人源化pd-l1肿瘤细胞系及具有该细胞系的动物模型与应用
【专利摘要】本发明提供了一种人源化PD?L1肿瘤细胞系，所述细胞系为MC?38?hPD?L1，并建立具有人源化PD?L1肿瘤细胞系的动物肿瘤模型，同时揭示了一种人源化PD?L1肿瘤细胞系的构建方法，具体通过CRISPR?CAS9敲除动物源的PD?L1，扩大培养获得敲除细胞库，提取DNA进行PCR扩增，回收扩增产物并进行克隆，最后通过慢病毒体系将人源PD?L1在mPD?L1 KO的MC?38细胞系中过表达，随后进行慢病毒的包装及Puromycin筛选获得人源化的PD?L1的MC?38细胞系。结果显示抗体治疗后的肿瘤浸润CD8 T淋巴细胞明显表现出更强的杀伤和增殖能力，此外我们也发现抗体治疗后肿瘤浸润的Treg细胞明显被抑制。这从分子机理上进一步证明该方法有效可行。CCTCC NO: C20169720160518
【专利说明】
人源化PD-L1肿瘤细胞系及具有该细胞系的动物模型与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种用于评估ro-Ll抗体疗效的人源化PD-Ll细胞系及其具有该细胞系的小鼠模型以及该细胞系与模型的制备方法，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002]近年来，靶向治疗和免疫治疗日渐成为肿瘤治疗的新策略。而特异性的阻断免疫节点的免疫治疗渐渐成为治疗的主流，并取得了令人兴奋的疗效。特异性的阻断免疫节点的方式主要是应用能直接封闭该免疫节点的单克隆抗体。总结起来，现在主要有杀伤性T淋巴细胞抗原WCTLAD1，2、程序性细胞死亡蛋白l(ro-l)3—7和程序性细胞死亡蛋白配体I(PD-L1)8—12，这几种免疫调节分子都可以向T淋巴细胞提供负控的信号，从而抑φ?」Τ细胞的对肿瘤细胞的杀伤功能。
[0003]通常来说，我们都通过人源化的动物来验证单克隆抗体或者其他特异性靶向人源分子的药物的药效以及其他相关药性评估。人源化的动物主要向免疫缺陷鼠过继回输人外周血淋巴细胞13—15，造血干细胞16或者新生鼠肝细胞17等方法实现。这一类方法在临床前的药性评估过程中发生着非常重要的作用，但是也存在着诸多不足，首要的一点就是建立人源化小鼠不仅耗时长而且费用也相对较高。因此建立一种快捷低价，用于抗体的临床前药效药性评估的人源化的动物模型非常必要，也具有相当的应用价值。
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【发明内容】
[0021]本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种人源化PD-Ll肿瘤细胞系及具有该细胞系的动物肿瘤模型及该肿瘤模型的应用。
[0022]本发明的目的通过以下技术方案来实现:
[0023]人源化ro-Ll肿瘤细胞系，所述细胞系为人源化PD-L1MC-38细胞，MC-38-hPD-Ll，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO:C201697，保藏时间2016年5月18日。
[0024]以上所述的具有人源化ro-Li肿瘤细胞系的动物肿瘤模型。
[0025]优选地，以上所述的人源化PD-Ll肿瘤细胞系的构建方法，通过CRISPR-CAS9敲除动物源的PD-Ll，扩大培养获得敲除细胞库，提取DNA进行PCR扩增，回收扩增产物并进行克隆，最后通过慢病毒体系将人源PD-Ll在mPD-LlKO的MC-38细胞系中过表达，随后进行慢病毒的包装及Puromycin筛选获得人源化的I3D-Ll的MC-38细胞系。
[0026]优选地，通过将人源化ro-Ll细胞系进行动物的皮下接种的方法建立人源化的MC-38 肿瘤动物模型。
[0027]优选地，所述动物选自大鼠、小鼠、兔子。
[0028]优选地，所述动物肿瘤模型可应用于制备抗ro-Ll药物，用于hPD-Ll单克隆抗体的筛选。
[0029]优选地，所述的具有人源化ro-Ll肿瘤细胞系的动物肿瘤模型的药效评价方法，通过在鼠源肿瘤细胞将人源ro-Ll替换鼠源ro-Ll而建立的人源化的肿瘤细胞，并建立人源化肿瘤细胞的肿瘤动物模型，用于新型ro-Li单克隆抗体的临床前药性评价，具体分以下两个方面:首先，ant1-human PD-L1抗体能有效抑制该细胞肿瘤的生长；其次，经ant1-humanPD-Ll抗体的治疗能有效的促进肿瘤浸润CD8 T淋巴细胞的增殖与杀伤能力。
[0030]本发明的有益效果:提供了一种简单的临床前抗体药效的评估手段，将会加快ro-LI单克隆抗体药效评估的进程，大大的降低了抗体疗效评估的经济支出。同时，本申请抗体治疗后的肿瘤浸润CD8 T淋巴细胞明显表现出更强的杀伤和增殖能力，此外我们也发现抗体治疗后肿瘤浸润的Treg细胞明显被抑制。这从分子机理上进一步证明该方法有效可行。
【附图说明】
[0031]图1是建立人源化细胞系的示意图。
[0032]图2是检测序列号不意图。检测mPD-Ll的敲除效率。
[0033]图3是流式检测正常细胞和敲除细胞IFN-γ刺激前后细胞PD-Ll的表达情况示意图。
[0034]图4是慢病毒过表达的hPD-Ll在mPD-LlKO的MC-38细胞中的表达水平的检测示意图。
[0035]图5是humanPD-Ll替换后细胞自身增殖检测示意图。
[0036]图6是humanPD-Ll替换后的MC-38细胞建立的肿瘤动物模型的生长曲线。
[0037]图7是人源化肿瘤动物模型给药治疗以及药效评估的流程图。
[0038]图8是不同浓度的H)-L1抗体给药治疗后肿瘤的生长曲线示意图。
[0039]图9是不同浓度的H)-L1抗体给药治疗后小鼠体重变化的示意图。
[0040]图10是1mpk的PD-Ll抗体给药治疗后肿瘤的大小示意图。
[0041]图11是1mpk的I3D-Ll抗体给药治疗后肿瘤的肿瘤统计示意图
[0042]图12是1mpkPD-Ll抗体给药治疗后对肿瘤浸润淋巴细胞的表型影响及数据统计示意图。
[0043]图13是1mpk PD-Ll抗体给药治疗后对肿瘤浸润淋巴细胞⑶8 T淋巴细胞的ki_67的表达水平变化及数据统计示意图。
[0044]图14是1mpk PD-Ll抗体给药治疗后对肿瘤浸润淋巴细胞CD8 T淋巴细胞的Granzyme B的表达水平变化及流式数据统计示意图。
[0045]图15是1mpk PD-Ll抗体给药治疗后对肿瘤浸润淋巴细胞⑶8 T淋巴细胞的IFN-ga_a的表达水平变化及流式数据统计示意图。
[0046]图16是1mpkPD-Ll抗体给药治疗后对肿瘤浸润淋巴细胞Treg的表型及结果统计示意图。
【具体实施方式】
[0047]基结肠癌细胞MC-38细胞鼠源I3D-Ll的敲除和人源I3D-Ll的表达。
[0048]研究表明，肿瘤组织中表达在肿瘤细胞表面的PD-Ll扮演着一种抗肿瘤抑制分子的角色2()。这个发现促使我们去建立一种更为直接经济的的动物模型，建立该模型的方法如下如图1所示:
[0049]步骤一，将鼠源的PD-Ll (mPD-Ll)通过CRISPR-Cas9的方法敲除:依据CRISPR_Cas9技术，首先通过http://crispr.mit.edu网站设计短链引导RNA(sgRNA)，设计序列如下:5’_GCTTGCGTTAGTGGTGTACT-3’。将合成的DNA双链通过BbsI插入SgRNA表达载体上(FG-BB-U6-SgRNA)。再和Cas9表达质粒(FG-hEF/HTLV-Cas9-PGK-Puro-WPRE)共转MC-38细胞，48小时候用pur ο筛选48小时。
[0050] 随后扩大培养，获得敲除细胞库，抽提DNA并通过如下引物进行PCR: forwardprimer is 5，-TGGTTCCTTTTAAACAAGACTGGG-3，，and reverse primer is 5，-CGCACCACCGTAGCTGATTA-3’，回收PCR产物并进行TA克隆，随后送样测序。克隆出的人源的PD-Ll 的氨基酸序列如下:MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
[0051 ] 步骤二、通过慢病毒体系将人源的PD-Ll过表达在这种mPD-LlKO的MC-38细胞中:首先克隆human PD-Ll的基因，并插入FG-hEF/HTLV-human CD274-PGK-Puro_WPRE腺病毒表达载体，随后再转染HEK293T细胞进行病毒包装。产生的病毒侵染MC-38mPD-LlK0细胞48h，并通过pur ο筛选48小时。
[0052]通过测序的方法检测mPD-Ll的敲除效率，如图2所示。由于干扰素-γ(IFN-γ )能显著的刺激PD-Ll的表达，我们分别通过流式检测了正常细胞和敲除细胞IFN-γ刺激前后细胞I3D-Ll的表达情况，结果表明MC-38细胞中mPD-Ll的敲除成功，如图3所示，KO细胞株无论有无IFN- γ都不能检测到I3D-Ll表达，说明I3D-Ll敲除彻底。
[0053]同样的，采用流式的方法检测了通过慢病毒过表达的hPD-Ll在mPD-LlKO的MC-38细胞中的表达水平，流式结果表明hPD-Ll能够在该细胞系中正常表达，如图4所示。
[0054]综上所述，经过各步骤的验证，建立人源化的ro-Ll的肿瘤细胞系MC-38-hro-Ll。
[0055]建立人源化的ro-Li小鼠肿瘤模型。
[0056]如前所述，首先建立人源化的肿瘤细胞系。但是，mPD-Ll的敲除和hPD-Ll的过表达本身是否会对细胞的生长产生影响我们仍然不得而知。
[0057]所以我们首先检测了野生型MC-38细胞，mPD-Ll敲除的MC-38细胞(MC-38K0)，人源化I3D-Ll细胞系的空白对照(MC-38-DEST)和人源化PD-Ll细胞系(MC-38-hro-Ll)的自身增殖能力，实验结果表明，无论是mPD-Ll敲除还是hPD-Ll的过表达都不影响MC-38细胞在体外的增殖水平，如图5所示。
[0058]进一步，我们通过皮下接种的方法建立以上所述四种细胞系，分别为MC-38细胞系、MC-38K0细胞系、MC-38-hro-Ll细胞系和MC-38-DEST细胞系的肿瘤模型，如图6所示，肿瘤的生长曲线表明mPD-Ll敲除显著的抑制了肿瘤的生长，而MC-38细胞的成瘤不受hPD-Ll的过表达影响。综上，我们成功建立了人源化的MC-38肿瘤动物模型。
[0059]如图7所示，按每只1.0*10~6(100此)细胞的接种量皮下接种0878176细胞。每隔两天测量肿瘤大小，按如下公式计算:M12*M2/2(M1:短径，M2:长径)。分别在day7和dayl I给予10mpk(200ul)的腹腔注射抗体治疗。在dayl5和day21分别检测肿瘤浸润淋巴细胞和髓系细胞的表型变化。染色方法如下:1、用研磨的方法获得单细胞悬浮液;2、按1:100稀释FcR抗体进行Fe block( 1min)。3、对不同细胞进行抗体染色20min，抗体信息如下:焚光标记的ant1-mouse CD45(30-F1I，B1legend)，CD3(145-2C1I，eB1science)，CD4(RM4_5，eB1science)，CD8(eB1H35-17.2，eB1science)，Foxp3(FJK-16s,eB1science)，K1-67(SoIAl5,eB1science),Granzyme B(NGZB,eB1science)，Ly_6C(AL_21,B1legend),Ly-6G(1A8,B1legend)，mPD-Ll(10F.9G2，B1legend)，hPD-Ll(29E.29A3，B1legend)和IFN-gamma(XMG1.2) j'Wash buffer洗三次后，用PBS悬浮准备上样。
[0060]药效性能测试
[0061 ] MPDL-3280A治疗能有效抑制肿瘤的生长。
[0062]所述人源化肿瘤动物模型可以应用于MPDL-3280A药物，为了验证上述人源化肿瘤动物模型能否用于hPD-Ll单克隆抗体的筛选，我们首先设计如图7所述的实验:我们首先通过皮下接种的方法建立MC-38-hro-Ll的肿瘤动物模型，分别在接种后的7、15天对小鼠进行PD-Ll抗体治疗(1.p.)，并在15天或21天时对肿瘤重量和肿瘤浸润淋巴细胞进行流式分析。
[0063]我们对接种MC-38-hro-Ll细胞的荷瘤小鼠进行腹腔注射MPDL-3280A治疗，如图8、图10、图11所示，肿瘤的生长曲线表明MPDL-3280A能有效抑制肿瘤的生长，结合图9所示，Impk，3mpk以及I Ompk给药治疗并不影响小鼠体重，说明MPDL-3280A药效安全。综上所述，我们的实验结果表明该动物模型能有效的对I3D-Ll抗体作出安全有效的免疫反应。
[0064]MPDL-3280A治疗上调肿瘤浸润的CD8T细胞同时下调调节性Treg细胞的频率。
[0065]诸多临床结果表明ro-Li抗体治疗会显著促进肿瘤杀伤性T淋巴细胞的浸润。为了进一步验证该模型能否得到同样的结果，我们通过流式对肿瘤组织进行表型分析。
[0066]如图12所示，流式结果表明MPDL-3280A腹腔注射治疗使得CD8T细胞以及CD8T/CD4T细胞的比值都明显的上调。此外，k1-67和Granzyme B是杀伤性CD8T细胞的重要marker，如图13-14所示，流式结果也同样表明MPDL-3280A也使得这两个重要marker的表达水平显著上调。
[0067]如图15所示，我们的结果还揭示MPDL-3280A治疗也使得IFN-γ在CD8T细胞的表达明显上调。
[0068]Treg对T细胞的杀伤功能和肿瘤发展都有重要意义。所以我们也同样的检测了Treg的比例，如图16所示，我们发现在早期阶段(dayl5)MPDL-3280A并不能影响Treg的比例，但是在晚期(day21)能够明显的抑制Treg的比例。
[0069]因此，我们得出如下结论:PD-L1抗体治疗该模型能有效的上调⑶8T细胞的浸润而明显抑制Treg的浸润。
[0070]这个结果再次证明该模型能有效的对抗体治疗作出有效的免疫反应。
【主权项】
1.人源化PD-Ll肿瘤细胞系，其特征在于:所述细胞系为人源化PD-L1MC-38细胞，名称为MC-38-hro-Ll，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC N0:C201697，保藏时间 2016年5 月 18 日。2.如权利要求1所述的具有人源化PD-Ll肿瘤细胞系的动物肿瘤模型。3.如权利要求1所述的人源化I3D-Ll肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于:通过CRISPR-CAS9敲除动物源的PD-Ll，扩大培养获得敲除细胞库，提取DNA进行PCR扩增，回收扩增产物并进行克隆，最后通过慢病毒体系将人源PD-Ll在mPD-LlKO的MC-38细胞系中过表达，随后进行慢病毒的包装及Puromycin筛选获得人源化的F1D-Ll的MC-38细胞系。4.如权利要求2所述的具有人源化I3D-Ll肿瘤细胞系的动物肿瘤模型的构建方法，其特征在于:通过将人源化I3D-Ll细胞系进行动物的皮下接种的方法建立人源化的MC-38肿瘤动物模型。5.如权利要求2所述的具有人源化ro-Li肿瘤细胞系的动物肿瘤模型的应用，其特征在于:所述动物肿瘤模型可应用于制备抗ro-Ll药物，用于hPD-Ll单克隆抗体的筛选。6.如权利2要求所述的具有人源化I3D-Ll肿瘤细胞系的动物肿瘤模型的药效评价方法，其特征在于:通过在鼠源肿瘤细胞将人源PD-Ll替换鼠源PD-Ll而建立的人源化的肿瘤细胞，并建立人源化肿瘤细胞的肿瘤动物模型，用于新型PD-Ll单克隆抗体的临床前药性评价，具体分以下两个方面:首先，ant1-human PD-Ll抗体能有效抑制该细胞肿瘤的生长;其次，经ant1-human PD-Ll抗体的治疗能有效的促进肿瘤浸润⑶8T淋巴细胞的增殖与杀伤能力。7.如权利要求3所述的人源化PD-Ll肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于:所述动物选自大鼠、小鼠、兔子。
【文档编号】A61K39/395GK105950560SQ201610347749
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】秦晓峰, 黄安飞, 彭迪
【申请人】苏州系统医学研究所