人类单纯疱疹i型病毒ul-7基因突变减毒株、构建方法及应用
【专利摘要】本发明属于基因工程和遗传修饰领域，具体的说，涉及一种人类单纯疱疹I型病毒UL?7基因突变减毒株、构建方法及应用，本发明完善了制备HSVI UL?7突变减毒株的技术过程及验证指标。在获得UL?7基因突变株后，为其减毒特征做了相应的检测确证。同时，对该突变株病毒做为HSVI减毒活疫苗应用的可能性做了相应的探讨。CGMCC No.1225420160412
【专利说明】
人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株、构建方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程和遗传修饰领域，具体的说，涉及一种人类单纯疱疹I型病毒 UL-7基因突变减毒株、构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 人类单纯疱疹病毒I型(Herpes Simplex Virus I，HSVI)作为一种影响人类健康 的重要病毒病原体，已为我们认识多年。其感染人体所引起的疾病一一单纯疱疹，主要发生 于口唇部皮肤。同时亦日益多见于生殖器皮肤。而后者多由于单纯疱疹病毒II型病毒 (HSVII)感染所引起。HSVI感染疾病的严重性在于其不仅导致表现为激烈疼痛的口唇部疱 疹，同时更重要的是该病毒可进入以三叉神经为主要受损组织的神经细胞中，并在其中形 成潜伏感染而形成对人类机体健康的终身影响。因此，对该病毒性的传染病的预防和治疗 具有重要的公共卫生意义。但迄今为止，HSVI疫苗研究未见明显进展，其主要原因为:首先， HSVI基因结构复杂，因此采用传统的减毒技术难以获得具有明确生物学指标的减毒疫苗毒 株，同时，其有效性和安全性指标都难以建立。其次，灭活疫苗始终未能展现有效的免疫原 性，而使用基因操作方式制备的多肽疫苗，如HSVI衣壳颗粒蛋白gB、gD、gC等的亚单位疫苗 亦均未在临床试验中获得临床保护性结果。因此，基于现有的技术，采用基因操作方法，构 建位点明确，具有生物学功能的突变病毒株，使其增殖毒力，尤其是对神经细胞感染能力表 现明显突变的技术策略是目前被认同的疫苗研究路线。Crispr/cas 9基因修饰技术的应用 为这一种HSVI疫苗的研究提供了可能。
【发明内容】
[0003] 为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供具有有效免疫原性和安全性的人类单纯 疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株。
[0004] 本发明的另一个目的为提供具有有效免疫原性和安全性的人类单纯疱疹I型病毒 UL-7基因突变减毒株的构建方法。
[0005] 本发明的又一个目的为提供人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株作为疫苗 候选株的应用。
[0006] 人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株，于2016年4月12日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 12254,地址:北京市朝 阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，包括如下步骤：
[0008] a.设计UL7基因编码序列的gRNA引物，分别为
[0009] IF:5 '-CACCGTGCGGCCAGTCCAGTTATCG-3 '
[0010] 1R:3，-AAACCGATAACTGGACTGGCCGCAC-5，
[0011] 2F:5 '-CACCGGCGGTCCTGACGGCCAACG-3 '
[0012] 2R:3'-AAACCGTTGGCCGTCAGGACCGCC-5'；将合成后的 1F和 1R 单链oligo DNA、2F和 2R单链oligo DNA分别退火形成双链DNA;
[0013] b.酶切PX330质粒并纯化;酶切纯化的PX330质粒分别连接IF和1R的退火产物、2F 和2R的退火产物得到第一连接产物和第二连接产物;第一连接产物和第二连接产物分别转 化感受态大肠杆菌，培养大肠杆菌以获得单菌落；
[0014] c.分别挑取含有第一连接产物或第二连接产物的单菌落并培养、再进行菌液PCR 鉴定，得到分别含有PX330-UL7-1和PX330-UL7-2的菌液，分别进行PX330-UL7-1和PX330-UL7-2质粒提取；
[0015] d.用转染试剂将质粒PX330-UL7-1和PX330-UL7-2同时转染人胚胎肾细胞系293T 细胞；
[0016] e.转染后16-20小时，以病毒感染复数moi = 0.5的HSV-1对转染后的293T细胞进行 感染;病毒感染时，从细胞培养板中吸出培养基，使用PBS清洗细胞后接种病毒;37 °C培养箱 中使病毒孵育30_60min后弃病毒液，加入1-3%FBS的细胞培养液至细胞产生病变后收获病 毒。
[0017] 在步骤a中，取1F、1R各2ul，去离子水461111，90-95°(：反应81^11进行退火，自然冷却 至室温，-20 °C储存备用；取2F、2R各2ul，去离子水46ml，90-95 °C反应8min进行退火，自然冷 却至室温，_20°C储存备用。
[0018] 在步骤b中，使用限制性内切酶对PX330质粒进行酶切，酶切体系为：PX330质粒 15ul，Bbsl 2ul，缓冲液3ul，去离子水5ul，37°C孵箱酶切4-6小时;酶切产物用1.2%琼脂糖 凝胶电泳进行胶回收纯化；
[0019] 1F和1R的退火产物、2F和2R的退火产物分别插入CRISPR/Cas9系统PX330载体的 Bbsl部位;反应体系：T4DNA连接酶lul，10X T4连接酶缓冲液lul，双链DNA 2ul，PX330质粒 酶切产物2.5ul，去离子水3.5ul，16°C连接4-6小时后取5-10ul用于大肠杆菌的转化；
[0020] 将DH5a感受态细胞100ul置于冰上，解冻后加入5-lOul连接产物混匀，冰浴30min， 42°C热激后迅速置于冰上5min，加入lOOOul LB培养基，37°C 100_200rpm震荡复苏60min;取 100ul复苏液直接涂布于含100ug/ml氨苄抗性的LB-agar平板上37°C培养直至单菌落长出。 [0021] 在步骤c中，挑取单菌落于5-10ml LB培养基中37°C100_200rpm震荡培养8-12h后 进行菌液PCR鉴定；菌液PCR所用上游引物为从PX330质粒上合成的一条引物PX330-senSe (序列为5 '-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC-3 '，），下游引物即为1R和2R，PCR反应体系如下： 菌液5ul，PX330_sense lul，lR或2R lul，Premix 10ul，去离子水3ul;PCR产物进行2%的琼 脂糖凝胶电泳分析目的条带。
[0022]在步骤d中，293T细胞消化后用DMEM培养基重悬混匀分散细胞悬液至形成单个细 胞;用细胞计数板进行计数后以每孔lXl〇5/3ml DMEM细胞的数量铺种入6孔板中。
[0023]在步骤e中，收获病毒后对收获的病毒液超声破碎10min，5000rpm离心5min后收集 上清，分装后保存于_80°C。
[0024]我们首先对HSVI基因编码的多种蛋白的生物学功能做了分析，并从中观察到HSVI 编码的UL-7蛋白，在病毒感染神经细胞及引起中枢神经系统组织细胞病变过程中具有重要 的作用，而对该基因的修饰突变，使其丧失原有功能后，可以和野生型病毒相较表现如下的 生物学功能的改变：（1)病毒感染体外培养的神经细胞能力降低。（2)病毒感染小鼠及猕猴 后不引起相似的临床症状。（3)不引起动物中枢神经系统的系统性病理改变。（4)同时仍然 引起机体对病毒的免疫反应，主要以血清中和抗体及IFN-r特异T细胞，针对HSVI感染的 Elispot阳性反应为特征。基于这些发现，我们进一步完善了制备HSVI UL-7突变减毒株的 技术过程及验证指标。在获得一株UL-7基因突变株后，为其减毒特征做了相应的检测确证。 同时，对该突变株病毒做为HSVI减毒活疫苗应用的可能性做了相应的探讨。
【附图说明】
[0025]图1为UL7基因的PCR产物检测结果，矩形框所示为一个UL7基因缺失30bp的突变毒 株:HSVI-MU-UL7。
[0026]图2(A)37°C和(C)34°C条件下突变株与野毒株在Vero细胞上以moi = l接种后的病 毒生长动力学曲线；（B)37°C条件下不同病毒株在Vero细胞上以moi = 0.00001接种后，固定 及染色3天后的蚀斑形态。
[0027]图3为野毒株和突变株感染后引起小鼠 CNS的病理改变示意图：大脑实质明显炎性 改变，包括大量炎性细胞的密集，血管浸润，组织充血，脑膜肿胀坏死，神经细胞的变性坏 死。
[0028] 图4为野毒株和突变株感染后小鼠 CNS组织的病毒载量曲线。
[0029] 图5为野毒株和突变株感染后小鼠的存活率示意图。
[0030] 图6为野毒株和突变株感染后小鼠的体重变化情况示意图。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施 例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0032] 人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株，于2016年4月12日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 12254,地址:北京市朝 阳区北辰西路1号院3号。
[0033] 1.UL7基因编码序列的gRNA引物设计。根据CRISPR-cas9系统中PAM序列选择-NGG 序列之前的20bp设计两对引物，分别为
[0034] IF:5 '-CACCGTGCGGCCAGTCCAGTTATCG-3 '
[0035] 1R:3 '-AAACCGATAACTGGACTGGCCGCAC-5，
[0036] 2F:5 '-CACCGGCGGTCCTGACGGCCAACG-3 '
[0037] 2R:3 '-AAACCGTTGGCCGTCAGGACCGCC-5 '
[0038] 将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA。以第一对引物为例，取1F、1R各 2ul，去离子水46ml，90-95°C反应8min进行退火，自然冷却至室温，-20°C储存备用。第二对 引物的反应条件和混合体系组成与第一对引物相同，仅仅使用的引物不同。
[0039] 2.使用限制性内切酶对PX330质粒进行酶切，酶切体系为:PX330质粒15ul，Bbsl (NEB公司）2ul，NEB buffer2.1 3ul，去离子水5ul，37°C孵箱酶切4-6小时。酶切产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳进行胶回收纯化(详细步骤见tiangen胶回收试剂盒）。
[0040] 3.两条双链DNA(1F和1R的退火产物或2F和2R的退火产物)分别插入CRISPR/Cas9 系统pX330载体(Addgene，美国）的Bbsl部位。反应体系：T4DNA ligase lul，10X T41igase buffer lul，双链DNA(1F和1R的退火产物或2F和2R的退火产物）2ul，PX330质粒酶切产物 2.5ul，去离子水3.5ul，16°C连接4-6小时后取5-10ul用于大肠杆菌的转化。
[0041 ] 4.感受态大肠杆菌的转化。将DH5a感受态细胞lOOul置于冰上，解冻后加入5-10ul 连接产物混匀，冰浴30min，42°C热激后迅速置于冰上5min，加入lOOOul LB培养基，37°C 100-200rpm震荡复苏60min。取lOOul复苏液直接涂布于含100ug/ml氨节抗性的LB-agar平 板上37 °C培养直至单菌落长出。
[0042] 5.挑取单菌落于5-10ml LB培养基中37°C100_200rpm震荡培养8-12h后进行菌液 PCR鉴定。（每个质粒挑选10个克隆）菌液PCR所用引物上游为从PX330质粒上合成的一条引 物PX330-sense (序列为5 ' -GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC-3 '）下游引物即为 1R和2R，PCR反 应体系如下：菌液5ul，PX330_sense lul，lR或2R lul，Premix 10ul，去离子水3ULPCR产物 进行2%的琼脂糖凝胶电泳分析目的条带，阳性条带应为250bp左右。
[0043] 6.使用Omega质粒小提试剂盒按照说明书进行PX330-UL7-1和PX330-UL7-2质粒提 取。293T细胞消化后用DMEM培养基重悬混匀分散细胞悬液至形成单个细胞。用细胞计数板 进行计数后以每孔lXl〇5/3ml DMEM细胞的数量铺种入6孔板中。用Fugene HD(Promega公 司，美国）试剂将质粒PX330-UL7-1和PX330-UL7-2进行293T细胞(人胚胎肾细胞系）转染，转 染过程按照Fugene HD试剂说明书进行。
[0044] 7.转染后16-20小时，以病毒感染复数(moi = 0.5)的HSV-1对转染后的293T细胞进 行感染。病毒感染时，从细胞培养板中吸出培养基，使用PBS清洗细胞后接种病毒。37°C培养 箱中使病毒孵育30_60min后弃病毒液，加入1-3%FBS的细胞培养液至细胞产生病变后收获 病毒。收获的病毒液超声破碎l〇min(最大功率），5000rpm离心5min后收集上清，分装后保存 于-8(TC 〇
[0045] 8.用病毒RNA/DNA试剂盒TIANamp(天根，中国）按照说明书提取UL7部分缺失的重 组病毒突变体HSVI - MU - UL7基因组DNA，进行SURVEYOR分析。具体过程为用含有PCR引物 (序列为F: CACCATCCTCAAGCAGGCCATCGCC; R: GGGGGCAGTTCTCCAGGTACATCAG)的 DNA聚合酶 (TAKARA，中国）对基因组周围CRISPR祀向点UL7基因进行PCR扩增。从基因组DNA提取扩增纯 化的PCR产物（400ng)被重新退火，用Transgenomic SURVEYOR Mutation Detection Kit按 照说明书进行分析，并使用Bio-Rad公司Gel Doc凝胶成像系统成像后，对产物进行检测。依 据相对谱带强度进行定量，检测到最终突变效率约为12%。
[0046] 9.将野毒株和HSVI -MU - UL7毒株的病毒液分别作10倍连续稀释，稀释后的病毒 置于含0.6%琼脂糖的￥打〇细胞(81〇?^〇培养基培养，温度为34°(：或37°(：。感染后的3天 (37 °C)或5 (34°C)天，用20 %乙醇将细胞固定，并用0.2 %结晶紫染色，噬菌斑形态成像。
[0047] 10.将野毒株和HSVI - MU-UL7毒株在34°C或37°C以0.5M0I浓度感染Vero细胞。在 感染后8、16、24、32、40、48hr从细胞培养上清和感染细胞收获全部病毒。根据标准病毒滴定 方法测定每份样品的滴度。同时，以定量RT-PCR的方法对野毒株和UL7部分缺失HSVI - MU- UL7毒株感染细胞后各时间点的病毒收获液进行绝对定量。
[0048] 11.以鼻腔感染的方式和同等剂量（103CCID50/只），分别接种野毒株和HSVI - MU-UL7毒株于BALB/c小鼠，观察毒株的致病能力。每个毒株均于接种后规定的不同时间点 (全程观察期为1个月）处死小鼠，每个器官切片进行HE染色以观察病毒感染后引起的病理 改变，以定量RT-PCR的方法检测病毒在各器官中的载量变化。另外，接种后每日观察动物的 临床表现，记录病死率。
[0049] 12.统计学分析。所有实验均进行至少三次且具有相似的结果，定量数据以平均 值土标准偏表示。单因素方差分析法(SPSS 17.0)对获得的数据进行统计分析。P〈0.05，具 有统计学意义。
[0050] 结果及总结：
[0051 ] 一、具有突变修饰UL-7基因的HSVI减毒株MU-UL7株的设计及构建 [0052] UL-7基因在HSVI减毒增殖过程中编码相应的UL-7分子，该蛋白分子作为HSVI病毒 结构中的衣壳蛋白成员之一，由以往的蛋白组学分析确定为仅占所有衣壳蛋白1%的比例。 根据其他以衣壳蛋白形式存在于HSVI中，并表现为病毒转录激活分子形式存在的相关分子 的研究工作，UL-7做为一种病毒转录调控因子在逻辑上是可能的。因此，利用突变技术，构 建UL-7基因突变修饰以改变其分子功能的病毒株，探讨UL-7功能。同时基于这一分子功能 的变化探索相应的减毒株的基本方向。我们利用CRISPR/Cas 9技术针对UL-7序列分别设计 了两对gRNA引物（序列为1?、11?、2?、21〇，并重组进入0?13?转染质粒，形成?乂33〇-此7-1和 PX330-UL7-2两个质粒。经这两个质粒转染HSVI感染的293T细胞后的突变处理，以及对此突 变病毒的Surveyor分析，并在此基础上的蚀斑克隆纯化，我们通过对其UL7基因的PCR产物 检测，确定了一个UL7基因缺失30bP的突变毒株(图1)并命名为HSVI - MU-UL7。
[0053] 二、HSVI - MU-UL7毒株的生物学特性测定：
[0054] 为了对UL7基因出现30bP缺失突变的HSV1毒株HSVI - MU-UL7生物学特性做进一 步的观察，以HSVI野毒株为对照，首先观察了突变株与野毒株在Vero细胞上以同样moi值 (moi = 1)接种后的病毒生长动力学，检测结果表明，在接种病毒后的16hr以内，突变毒株和 野毒株的增殖效率开始出现差距，并在16hr之后始终维持相同的差异（图2)，这一差距的病 毒滴度在10倍左右（图2)。而且，这个差异不受环境温度改变的影响，无论37°C还是34°C条 件下，野毒株与突变株的滴度均相差10倍左右（图2)。由于在一般情况下，病毒的感染增殖 能力可能受到培养温度的影响而出现波动，因此，野毒株在较低温度下亦可能出现增殖效 率下降--即表现为收获液的感染性滴度下降，而HSVI - MU-UL7突变株无论37°C还是34 °C条件下，均和随着温度变化而出现感染增殖能力波动的野毒株始终保持10倍左右的差 异，这一事实证明该突变体的这一表型特征，是与UL7基因的突变相关的。而同时毒株蚀斑 形态的观察表明，该突变体与野毒株相比较亦呈现蚀斑直径10倍左右的差异（图2)。通常， 这种变小的蚀斑形态代表了毒株毒力明显下降的可能。因此，综上所述结果，HSVI - MU - UL7突变体有可能属于一个病毒株。
[0055] 三、HSVI - MU-UL7突变体的动物致病特征观察：
[0056]根据已有的资料，BALB/c小鼠做为一种HSVI易感的动物，可以作为观察HSVI感染 致病能力的模型，为比较HSVI - MU-UL7突变体与野毒株的感染致病能力，以鼻腔感染的方 式和同等剂量（l〇3CCID5Q/只），分别接种突变体及野毒株于BALB/c小鼠20只X2/毒株，每个 毒株均进行一个规定期处死以观察病毒感染后引起的病理改变，病毒在各器官中的载量变 化。另一个是观察动物的临床表现，尤其是病死率的记录。所有的观察结果表明，与野毒株 比较，HSVI - MU-UL7突变体感染小鼠的能力明显降低。这主要表现在以下几个方面。首先， 动态病理观察表明，在感染后第4、6、7、8、10天的野毒株主要引起小鼠0~5的病理改变，其特 征为:大脑实质明显炎性改变，包括大量炎性细胞的密集，血管浸润，组织充血，脑膜肿胀坏 死，神经细胞的变性坏死(图3)。而且这些病理改变随时间而呈现逐渐加重的趋势(表1)。
[0057] 表1:野毒株和突变株感染后不同时间点小鼠 CNS的病理改变。
[0059] 判断标准：
[0060] 正常组织；
[0061 ] +:少量炎性细胞聚集，无明显神经细胞损伤；
[0062] ++:炎性细胞聚集伴轻微神经细胞损伤；
[0063] +++:炎性细胞聚集伴大量神经细胞损伤；
[0064] ++++:严重神经细胞损伤(或同时出现炎性细胞聚集）。
[0065] 与此同时，HS VI - MU - UL7突变体感染小鼠后的同样时间点上，仅表现CNS中血管 周围少量炎症细胞，但无神经细胞的坏死和组织充血坏死等具有组织病理特征的表现（图 3)。另外，这一病理表现在感染后10天内无加重的趋势。相反，这一炎性现象随时间逐渐消 退(表1)。其次，20天内，在整个病理过程中对动物CNS组织的病毒载量的分析表明，突变体 感染动物呈现一个较低（ml〇 3CCID5Q/100ug)的平稳的载量曲线（图4)。而野毒株感染动物 CNS组织中的病毒载量，在10天内，最高峰值可达108CCID5Q/100ug(图4)。再者，最为明显的 是动物的存活率，野毒株感染的所有动物，在感染后的第10天已经死亡殆尽（图5)。但突变 体感染动物在1个月后仍然全部存活（图5)。在临床表现方面，野毒株动物在感染的第3天 后，已明显出现活动减少、倒毛、体重减轻的表现（图6)。但突变体感染动物未见任何异常， 始终保持稳定，只出现体重轻微的增加（图6)。所有这些结果，进一步证明与野毒株相比，该 突变体是一个感染能力、增殖能力及致动物病变能力均为明显下降的减毒株。
[0066]总结上述结果，我们得到如下结论:在基于对HSV1病毒结构中所存在的衣壳蛋白 的初步认识，尤其是对这些蛋白在病毒感染增殖过程中的分子生物学功能的初步认识基础 上，我们依据UL7这个重要衣壳蛋白分子可能具有的生物学功能假设，利用CRISPR/Cas 9技 术，构建了具有UL7基因缺失突变的HSV1突变毒株。这个突变毒株的生物学特性及感染动物 致病能力均已发生了明显的改变。与野毒株相比较，已经具有了一个减毒株的特征，具有进 一步做为HSV1减毒疫苗株的生物学基础。
[0067]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护 的范围。
【主权项】
1. 人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株，于2016年4月12日保藏于中国微生物菌 株保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 12254。2. 人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，包括如下步骤： a. 设计UL7基因编码序列的gRNA引物，分别为 IF:5 '-CACCGTGCGGCCAGTCCAGTTATCG-3 ' IR:3，-AAACCGATAACTGGACTGGCCGCAC-5， 2F:5 '-CACCGGCGGTCCTGACGGCCAACG-3 ' 2R: 3 ' -AAACCGTTGGCCGTCAGGACCGCC-5 ' ；将合成后的 IF和IR单链〇1 igo DNA、2F和2R单 链oligo DNA分别退火形成双链DNA; b. 酶切PX330质粒并纯化;酶切纯化的PX330质粒分别连接IF和IR的退火产物、2F和2R 的退火产物得到第一连接产物和第二连接产物;第一连接产物和第二连接产物分别转化感 受态大肠杆菌，培养大肠杆菌以获得单菌落； c. 分别挑取含有第一连接产物或第二连接产物的单菌落并培养、再进行菌液PCR鉴定， 得到分别含有PX330-UL7-1和PX330-UL7-2的菌液，分别进行PX330-UL7-1和PX330-UL7-2质 粒提取； d. 用转染试剂将质粒PX330-UL7-1和PX330-UL7-2同时转染人胚胎肾细胞系293T细胞； e .转染后16-20小时，以病毒感染复数m〇i=0.5的HSV-I对转染后的293T细胞进行感 染;病毒感染时，从细胞培养板中吸出培养基，使用PBS清洗细胞后接种病毒;37 °C培养箱中 使病毒孵育30_60min后弃病毒液，加入1-3% FBS的细胞培养液至细胞产生病变后收获病 毒。3. 根据权利要求2所述的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，其特 征在于，在步骤a中，取1F、IR各2ul，去离子水46ml，90-95°C反应8min进行退火，自然冷却 至室温，-20°C储存备用；取2F、2R各2ul，去离子水46ml，90-95°C反应8min进行退火，自然 冷却至室温，-20°C储存备用。4. 根据权利要求2所述的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，其特 征在于，在步骤b中，使用限制性内切酶对PX330质粒进行酶切，酶切体系为：PX330质粒15 ul，Bbsl 2ul，缓冲液3ul，去离子水5ul，37 °C孵箱酶切4-6小时;酶切产物用1.2 %琼脂糖 凝胶电泳进行胶回收纯化； IF和IR的退火产物、2F和2R的退火产物分别插入CRISPR/ Cas9系统pX330载体的Bbsl 部位;反应体系:T4 DNA连接酶lul，10X T4连接酶缓冲液lul，双链DNA 2ul，PX330质粒 酶切产物2.5ul，去离子水3.5ul，16°C连接4-6小时后取5-10ul用于大肠杆菌的转化； 将DH5a感受态细胞IOOul置于冰上，解冻后加入5-10ul连接产物混匀，冰浴30min，42°C 热激后迅速置于冰上5 min，加入1000 ul LB培养基，37°C 100-200 rpm震荡复苏60 min; 取IOOul复苏液直接涂布于含100ug/ml氨苄抗性的LB-agar平板上37°C培养直至单菌落长 出。5. 根据权利要求2所述的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，其特 征在于，在步骤c中，挑取单菌落于5-10ml LB培养基中37°C100_200 rpm震荡培养8-12h 后进行菌液PCR鉴定；菌液PCR所用上游引物为从PX330质粒上合成的一条引物PX330-sense，序列为5 '-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC-3 '，下游引物即为IR和2R，PCR反应体系 如下：菌液5ul，PX330_sense lul，IR或2R lul，Premix 10ul，去离子水3ul;PCR产物进行 2%的琼脂糖凝胶电泳分析目的条带。6. 根据权利要求2所述的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，其特 征在于，在步骤d中，293T细胞消化后用DMEM培养基重悬混匀分散细胞悬液至形成单个细 胞;用细胞计数板进行计数后以每孔IXlO 5/ 3ml DMEM细胞的数量铺种入6孔板中。7. 根据权利要求2所述的人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株的构建方法，其特 征在于，在步骤e中，收获病毒后对收获的病毒液超声破碎1〇111；[11，5000印1]1离心51]1；[11后收集 上清，分装后保存于-80 °C。8. 人类单纯疱疹I型病毒UL-7基因突变减毒株作为疫苗候选株的应用。
【文档编号】C12R1/93GK105950573SQ201610310738
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】徐兴丽, 冯敏, 李濛, 李一濛
【申请人】康普润（苏州）生物科技有限公司