利用阳离子交换层析纯化蛋白质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质纯化领域，具体涉及利用阳离子交换层析方法纯化含有污染物 的抗体。
【背景技术】
[0002] 随着生物工程技术的不断发展，越来越多的包括抗体在内的蛋白质通过生物反应 器（如工程菌或工程细胞株）或其他方式进行大规模的制备，对获得的含有目的蛋白质培 养物进行分离纯化是其生产过程下游技术中必不可少的步骤，如何通过对蛋白质纯化方法 的改进，优化蛋白质的纯化条件，进一步增加去除污染物的效率，提高蛋白质的纯度和收率 等是蛋白质工业化生产中一直存在的问题。
[0003] 利用工程菌或工程细胞株表达目的蛋白质方法一般是将含有目的基因的重组载 体导入到宿主细胞中，在合适的条件下进行细胞培养，从而获得目的蛋白质的表达。获得的 培养物中除了目的蛋白外，还包括宿主细胞蛋白（Host cell protein，HCP)、宿主细胞DNA、 RNA、培养基组分、目的蛋白变体和/或聚集体、目的蛋白片段、以及可能存在的毒素、病毒、 微生物等在内的其他污染物等；因此必须通过一系列的纯化过程才能获得较纯的符合应用 目的的蛋白质。
[0004] 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是目前生物化学领域 中常用的一种纯化方法。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离 子与交换剂上的平衡离子通过可逆交换从而达到分离目的的一种层析方法。所谓离子交 换，是指溶液中的某一种离子与另一种合在载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中 的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。若载体上结合着带正电荷的活性基团， 则可交换阴离子，为阴离子交换剂；若载体上结合着带负电荷的活性基团，则可交换阳离 子，为阳离子交换剂。在一定的条件下，混合物中不同蛋白质所带电荷的性质及电荷多少不 同，有的能与特定离子交换剂结合，有的不能结合；能与离子交换剂结合的蛋白质中，结合 力的大小也不一定相同，然后采用适当的洗脱条件，可以对它们进行有效的分离。离子交换 层析目前广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
[0005] 由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合 情况较难估计，特别是蛋白质结构的复杂性，它与离子交换剂的结合力与蛋白质分子所携 带的电荷的数目有关，还与蛋白质的分子的大小及电荷排列等其他性质也有一定关系。因 此，针对不同的蛋白质特别是用做药物的抗体，优化选择出合适的离子交换层析纯化工艺， 尽可能降低生产成本并提高抗体收率，以获得较高纯度的抗体，往往需要通过大量的实验 进行摸索。
[0006] 专利200880119331. X公开了一种通过阳离子交换层析纯化抗体的方法，其中在 使用电导率升高的洗脱缓冲液来洗脱期望抗体之前使用高pH清洗步骤来清除污染物；通 过在阳离子交换纯化方案中包括至少两个清洗步骤，其中至少第一个在高pH(约pH 6. 8或 更大）进行，能显著提高纯化功效，实现了更高的步骤产率。该专利通过增加在洗脱抗体之 前使用高pH清洗步骤，以清除污染物，但工艺步骤的增多会使工艺时间延长，增加了生产 成本。
【发明内容】
[0007] 为了通过用尽量少的离子交换层析步骤进行纯化，降低生产成本，并获得较高纯 度的抗体，本发明提供了一种阳离子交换层析纯化含有污染物的抗体的方法，其包括以下 步骤：
[0008] a)上样：将含有抗体和污染物的溶液加载到阳离子交换柱上，
[0009] b)清洗：用清洗缓冲液清洗阳离子交换材料，
[0010] C)洗脱：用洗脱缓冲液从阳离子交换材料上洗脱下目的抗体。
[0011] 本发明通过对各种缓冲液的组成及浓度、pH、电导率等通过大量试验进行优化，达 到了较好的污染物去除效果和较高的收率。
[0012] 本发明的一个优选实施方案，清洗缓冲液的电导率为5_9ms/cm，优选电导率为 6_8ms/cm〇
[0013] 本发明的一个优选实施方案，清洗缓冲液的pH为5. 5-5. 9,优选pH为5. 7-5. 9 ;
[0014] 本发明中的清洗缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐、磷酸盐或其 两种及两种以上的混合物；缓冲液中含有选自氯化钾（KC1)、氯化钠（NaCl)、碳酸钾、乙酸 钠、硫酸钾、硫酸钠、柠檬酸盐、磷酸盐或这些成分的两种或多种混合物的盐类。
[0015] 本发明的一个优选实施方案中，清洗缓冲液为含有20-25mM MES，40-50mM NaCl的 溶液；
[0016] 本发明优选实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为9-14ms/cm，洗脱缓冲液的电导率 优选 9-lOms/cm，更优选 9. 0-9. 6ms/cm。
[0017] 本发明的另一优选实施方案中，洗脱缓冲液的pH为5. 5-5. 9,优选pH为5. 7-5. 9。
[0018] 本发明中的洗脱缓冲液中的缓冲物质为MES、柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐、磷酸盐或其 两种及两种以上的混合物；缓冲液中含有选自氯化钾（KC1)、氯化钠（NaCl)、碳酸钾、乙酸 钠、硫酸钾、硫酸钠、柠檬酸盐、磷酸盐或这些成分的两种或多种混合物的盐类。
[0019] 本发明的另一优选实施方案中，洗脱缓冲液为含有20-25mM MES，75-110mM NaCl 的溶液，NaCl浓度优选80-95mM NaCl。
[0020] 在利用本发明方法在进行阳离子交换层析之前，期间或之后，可以对含有污染物 的抗体进行一个或多个其他纯化步骤。例如可通过深层过滤、蛋白A亲和层析的初步纯化 后再进行阳离子交换层析，可获得更好的抗体纯化效果。
[0021] 用本发明的阳离子交换层析纯化工艺纯化的抗体为结合人VEGF(人血管内皮生 长因子）的抗体或结合人CD20的抗体。
[0022] 可用于本发明纯化工艺的结合人VEGF的抗体是指包括与人VEGF结合的多克隆抗 体、单克隆抗体、具有结合特异性的抗体片段或抗体的各种修饰形式等；本发明优选可用于 纯化的抗VEGF抗体为具有 SEQ ID N0:1(CDR H1)、SEQ ID N0:2(CDR H2)、SEQ ID N0:3(CDR H3)所示的重链高变区序列和 SEQ ID NO :4(CDR LI)、SEQ ID NO :5(CDR L2)、SEQ ID NO : 6(CDR L3)所示的轻链高变区序列的抗体，更优选为贝伐单抗（Bevacizumab)。
[0023] 本发明的抗VEGF抗体可由以下方法获得：将合成的SEQ ID NO :1-3的重链⑶R区 序列移植人重链亚组III构架上，SEQ ID NO :4-6的轻链⑶R区序列移植到人轻链Κ亚组1 构架上，获得抗VEGF抗体VH和VL序列，再将VH和VL分别克隆到含有人IgG重链恒定区 和轻链恒定区的表达载体上，将含有抗VEGF抗体重链和轻链的表达载体共转染CH0细胞， 在合适的培养条件下进行培养，CH0细胞表达的抗VEGF抗体分泌到胞外培养基中，收集含 有抗VEGF抗体细胞培养物，将细胞培养物进行初步纯化后，获得用于进一步进行离子交换 层析的含有抗VEGF抗体和污染物的混合物。
[0024] 可用于本发明纯化工艺的结合人⑶20的抗体是指包括与人⑶20结合的多克隆抗 体、单克隆抗体、具有结合特异性的抗体片段或抗体的各种修饰形式等，本发明优选可用的 抗⑶20抗体为具有SEQ ID N0 :7所示的重链可变区序列和SEQ ID N0 :8所示的轻链可变 区序列的抗体，更优选为利妥昔单抗（Rituximab)。
[0025] 本发明的抗⑶20抗体可由以下方法获得：将合成的SEQ ID N0 :7的重链可变区序 列和SEQ ID N0 :8的轻链可变区序列分别克隆到人IgG重链恒定区和轻链恒定区的表达载 体上，将含有抗CD20抗体重链和轻链的表达载体共转染CH0细胞，在合适的培养条件下进 行培养，CH0细胞表达的抗CD20抗体分泌到胞外培养基中，收集含有抗CD20抗体的细胞培 养物，将细胞培养物进行初步纯化后，获得用于进一步进行离子交换层析的含有抗CD20抗 体和污染物的混合物。
[0026] 本发明的另一实施方案中，在上样之前，将阳离子交换柱用平衡缓冲液进行平衡， 平衡缓冲液可以与清洗缓冲液为同一缓冲液。
[0027] 含有抗体和污染物的溶液上样溶液在上样前，通过对上样溶液pH进行优化，上样 溶液pH值为纯化时所选用平衡缓冲液的pH值±0. 05。
[0028] 上样溶液的电导率根据离子交换材料的性质进行调节，如果采用SP-HP等不耐高 盐的离子交换材料，则需要将上样溶液的电导率< 3. 5ms/cm，如果采用poros等耐高盐的 填料则可不需要调节上样溶液的电导率。
[0029] 本发明的另一实施方案中，所用的交换材料为粒度直径不大于50μπι左 右的离子交换材料。在一些优选的实施方案中，阳离子交换柱所用的交换材料