专利名称：一种多波长核酸蛋白层析分离检测系统的制作方法
技术领域：
本发明是生物化学和生物制药领域的专用分离检测方法与设备，尤其是涉及多波 长核酸蛋白层析分离检测方法和系统。
二背景技术：
在科学研究和生产过程中，存在着大量的蛋白质、核酸和多肽等生物大分子的分 析、分离和纯化工作，迫切需要高效快速的分析、分离和制备方法。目前广泛采用的 生化分离技术主要有沉淀分离、层析分离、电泳分离、离心分离、膜分离技术。而层 析分离技术以其独特的优势始终占据着生物大分子纯化技术的主导地位。层析系统包 括两个相固定相和移动相。当移动相流过加有样品的固定相时，由于各组分在两相 之间的分配比例不同，各组分就会以不同速度移动而互相分离开来。根据固定相基质 的形式，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。生化技术中常用的凝胶层析、离 子交换层析等通常采用柱层析方法。柱层析系统主要有两部分组成，层析柱系统和检 测器系统。根据研究对象设计层析柱系统，包括柱体、固定相、流动相(洗脱剂)、 流速等，已形成专门研究领域。检测器是柱层析系统分析、分离和纯化工作的"眼睛"， 主要有紫外(UV)吸收、示差折光、介电常数等。其中紫外吸收检测器是柱层析系统
应用最广的检测器，它有①灵敏度高，最低检测浓度可达10—"g/mL②受操作条件和外 界环境影响小，适于梯度洗脱③对无紫外吸收的物质组分无响应④非破坏性检测，可 与其他检测器串联使用等特点及优点。既可以用于少量物质的分离鉴定，又可用于大 量物质的分离纯化和制备。占据着生物大分子分离纯化技术的主导地位，使用率占 70%左右。传统核酸蛋白层析分离装置虽然配有280nm、 254nm等波长选择，但实际使 用时只能选定单一波长进行检测，因此，传统层析分离装置只能利用物质特征波长分 离己知单一组分(蛋白或核酸等)，不能对未知混合组分进行分离，更不能分析蛋白 或核酸的纯度。目前使用的大分子层析分离装置由核酸蛋白检测仪、层析柱、恒流泵、 部分收集器和记录仪等部件构成。作为一种简便的分析分离手段与方法，长期应用于 教学实验、科学研究和工业生产。在零点调整、灵敏度选择、读数换算、使用记录仪 描谱等环节的操作基本一样，且仅在单一波长(280nm或254nm)下检测。只能利用 物质特征波长分离己知单一组分(蛋白或核酸)，不能对未知混合组分进行分离，更 不能分析蛋白或核酸的纯度。传统核酸蛋白检测仪在操作和技术上普遍存在以下几方 面不足1、误差。仪器检测的第一数据为光透过率值。由于仪器的对数转换装置误 差没能得到很好的校正补偿，实际转换结果存在较大的误差。虽然要求使用者在进样 前一定要进行零点调整，方法为先调整透过率为100%，然后再调吸光度为O，使该 点(T=100%， A=0)两者符合了朗伯--比尔定律(A=lg(l/T))。但是，无法保证在测 量范围内(一般取0—2A)都符合朗伯一比尔定律。事实上不同点两者存在着误差， 有的误差超过50%。因此，仪器检测的科学性得不到保证。2、 读数。传统检测仪为保证测量时读数在仪器有效测量范围内，在仪器面板上 都设有灵敏度选择装置(2.0A、 l.OA、 0.5A、 0.2A、 0.1A、 0.05A等)，由此会带来 ①当对未知样品浓度不甚了解，不知如何选择灵敏度，需要反复摸索；②仪器显示值 不是样品吸光度值，真正吸光度值是仪器显示数与灵敏度的乘积；③如在测量时改变 仪器的灵敏度将会带来严重后果(基线变化大)。
3、 繁琐。大多传统检测仪在不同灵敏下的测量结果均为0-10mv直流电压信号， 将此信号输出到记录仪上，选择适当的记录仪走纸速度，在记录纸上绘出吸光度谱。 可想而知，记录纸上的吸光度并非样品吸光度，也受到仪器灵敏度的调制。要想从记 录纸上得到吸收峰的面积、归一化等参数将是一件费工耗时、十分繁琐的事。再者， 纸质谱图提供的信息单一且难以保存，更不能直接在文章中插入使用。
4、 单一。传统检测仪虽然可能配有280nm、 254nm等波长选择，但使用时只能选 定单一波长进行检测，不能同时进行双波长(280nm和254nm)同步检测。因此，传 统层析分离装置只能利用物质特征波长分离已知组分。需进一步分离未知物质，传统 层析分离装置无能为力。
发明内容
本发明目的是为彻底解决传统层析分离装置存在的误差大、读数不直观、记录 仪描谱、只能单波长检测等问题。提出一种涉及多波长核酸蛋白层析分离和检测系统。 本发明技术解决方案是多波长核酸蛋白层析分离和检测方法，紫外光源分光 后成不同波长的两束单色光，两束单色光通过光路经狭缝射到核酸蛋白层析分离后的
样品池，经样品池分别透射到两只光电管(R2868)上，光电管经光电转换得到与透 射光强度成正比例的电信号；先将信号放大，然后进行信号对数转换，此时得到的信 号与样品池光吸收成正比例，再经双通道A/D转换形成数字信号。紫外光源(包含 UA、 UB、 UC波段)分光后成不同波长的两束光射入波长(分别为280nm和254nm)， 单色光通过光路(两组45度反射镜)经狭缝射到样品池后分别透射到光电管上。 光源产生的两束单色光光路进行检测的步骤是
1)、在紫外光源内部出口处设有光路选择装置，该装置由步进电机和遮光片组 成，遮光片上开有(二的倍数，如4对)窗口，在窗口上装有聚光透镜，会聚后的光 射入射相应滤光片；2)、对数放大器输出的两路电信号输入到A/D转换器；3)、通 过控制步进电机的旋转和A/D转换器信号获得实现同步，保证不同波长信号和A/D输 出相一致；4)、然后对两路数字信号进行整形变换，送给接口电路。 多波长核酸蛋白层析分离和检测装置，由控制器、紫外光源、干涉滤光片分光、样品 池、光电管，信号放大器，对数转换器，双通道A/D转换器构成，紫外光源经至少两 种干涉滤光片分光后成不同波长的单色光，单色光通过光路和狭缝射到样品池后分别 透射到光电管上，光电管经光电转换器得到两路与透射光强度成正比例的电信号，电 信号接信号放大器进行信号放大，并输入到对数放大器(转换器)进行信号对数转换， 对数转换得到的信号与样品池光吸收成正比例，再接双通道A/D转换器，A/D转换器输出的数字信号；由控制器连接A/D转换器的控制端和输出端、并连接上位电脑工作 站的接口通信端；电脑工作站进行数据传输接收、屏幕绘谱、参数分析、谱图编辑、 数据保存等工作。
光源产生的两束单色光结构是在紫外光源内部出口处设有光路选择装置，该 装置由步进电机和遮光片组成，遮光片上开有两波长光交替输出对应的(如4对)窗 口，分别对应着两种波长的单色光输出。在窗口上装有聚光透镜，会聚后的光射入滤 光片；对数放大器输出的两路电信号输入到A/D转换器；步进电机带动遮光片旋转时 分别在光路中输出两种波长的单色光；根据需要本发明亦可以采用三束相异波长的 光。对应的采用三只光电管(R2868)，遮光片上开有(三的倍数，如6对)窗口，在 窗口上装有聚光透镜，会聚后的光射入相应的滤光片。
本发明有益效果是本发明以朗伯-比尔定律为依据，在检测方法、光源设计、 光路转换进行了设计。在检测电路包括模拟放大、对数放大、A/D转换、数字控制、 嵌入式技术以及电脑工作站等方面亦然。经过试验和用户试用，完成了"双波长核酸 蛋白检测仪"和电脑软件工作站的研制，配上层析柱、恒流泵、部分收集器等部件， 构成了完整的"双波长核酸蛋白层析分离检测系统"。该系统实现了良好检测效果 本发明在层析过程中用两种波长(如280nm和254nm)对样品池液体的吸光度进行实 时同步检测并设计层析电脑软件工作站。绘制出信息更加丰富的双波长层析谱，在双 波长图谱中进行比值运算(如用280nm吸光度除以254nm吸光度)，得到蛋白和核酸 的纯度图谱。
1)、吸光度A和透过率T严格符合朗伯-比尔定律(A=Lg(l/T))，任意两者(A 和T)对应误差小于1%; 2)、系统自动调整吸光度到0.000，透光率到100%; 3)、双 波长(如280nm和254nm)同步检测；4)、数据采集、电脑接口 (COM口和USB接口) 和软件工作站，检测、采集、软件工作站一体化系统集成；5)、层析分析软件具有数 据采集、实时描谱、分析参数、保存、打印、编辑等功能。6)、分析参数有峰高、峰 宽、峰面积、归一化、保留时间、面积含量、纯度、层析柱分辩率等。
四
图1是本发明硬件构成示意图 图2是本发明检测系统框图 图3、 4是两种检测图谱
五具体实施例方式
如附图所示，根据硬件框图与，本发明多波长核酸蛋白层析分离和检测装置，由 控制器、紫外光源、干涉滤光片分光、样品池、光电管，信号放大器，对数转换器， 双通道A/D转换器构成，紫外光源经至少两种干涉滤光片分光分光后成不同波长的单 色光，单色光通过光路和狭缝射到样品池后分别透射到光电管上，光电管经光电转换 器得到两路与透射光强度成正比例的电信号，电信号接信号放大器进行信号放大，并 接对数放大器(转换器)进行信号对数转换，对数转换得到的信号与样品池光吸收成正比例，再接双通道A/D转换器，A/D转换器输出的数字信号；由控制器连接A/D转 换器的控制端和输出端、并连接上位电脑工作站的接口通信端；电脑工作站进行数据 传输接收、屏幕绘谱、参数分析、谱图编辑、数据保存等工作。
由紫外光源产生的两束单色光结构是在紫外光源内部出口处设有光路选择装 置，该装置由步进电机和遮光片组成，遮光片上开有(4对)窗口，在窗口上装有聚 光透镜，会聚后的光射入滤光片；对数放大器输出的两路电信号输入到A/D转换器；
本发明以朗伯-比尔定律为依据，在光源设计、光路设计、模拟放大、对数放大、 A/D转换、数字控制、嵌入式技术以及电脑工作站等方面使用全新设计理念。经过长 时间研究、试验和用户使用，完成了 "双波长核酸蛋白检测仪"和电脑软件工作站的 研制，配上层析柱、恒流泵、部分收集器等部件，构成了完整的"双波长核酸蛋白层 析分离系统"。该系统实现了
1、 吸光度A和透过率T严格符合朗伯-比尔定律(A=Lg(l/T))，任意两者(A和 T)对应误差小于1%;
2、 系统自动调整吸光度到0.000，透光率到100%;
3、 双波长(如280nm和254nm)同步检测；
4、 数据采集、电脑接口 (COM口和USB接口)和软件工作站，检测、采集、软件 工作站一体化系统集成；
5、 层析分析软件具有数据采集、实时描谱、分析参数、保存、打印、编辑功能；
6、 分析参数有峰高、峰宽、峰面积、归一化、保留时间、面积含量、纯度、层 析柱分辩率等；
(二)由朗伯--比尔定律可知，组分在不同波长下的吸光度值A(入)，只与该组 分下得消光系数K(X)有关，即:A(入l)-K(入l)Cb A(入2):K(入2)Cb
A(入l)/ A(入2):K(入1)/ K(入2) 此比值为一常数。用两种(如280nm、 254nm)或两种以上波长对样品池液体的吸光 度进行同步检测并进行绘制，得到信息更加丰富的双波长或多波长层析谱。本发明用 双波长(如280nm和254nm)进行同步实时检测，在得到的双波长图谱中进行运算(用 280nm吸光度除以254nm吸光度)，就得到蛋白、核酸纯度图谱。可以知道哪里是纯 蛋白(比值大于1.7)，哪里是纯核酸(比值小于0.'5)。
图3为血红蛋白和核黄素混合样品溶液2mg，层析柱长20cm，内径1.0cm,固定 相为葡聚糖凝胶G25，用0.05mol磷酸缓冲液洗脱得到的层析图谱。由于血红蛋白和 核黄素分子量不同(血红蛋白分子量大于核黄素分子量)，在层析柱的停留时间将不 同。第一个峰为血红蛋白组分，第二峰为核黄素组分，可以看到两组分已完全分离。
图4是在图3基础上进行比值运算(用280nm (浅色)吸光度除以254nm (深色) 吸光度(黑色)曲线，即A280/A254)后得到的纯度谱。文献指出纯度谱中比值 大于1.7部分纯蛋白，比值小于0. 5部分为纯核酸。因此，样品里血红蛋白组分纯度 较高，核黄素组分蛋白纯度较低。
权利要求
1、多波长核酸蛋白层析分离和检测方法，其特征是将紫外光源分光后成不同波长的两束单色光，两束单色光通过光路经狭缝射到核酸蛋白层析分离后的样品池，经样品池分别透射到两只光电管上，光电管经光电转换得到与透射光强度成正比例的电信号；先将信号放大，然后进行信号对数放大转换，此时得到的信号与样品池光吸收成正比例，再经双通道A/D转换形成数字信号。
2、 根据权利要求l所述的多波长核酸蛋白层析分离和检测方法，其特征是光源 产生的两束单色光光路进行检测的步骤是1) 、在紫外光源内部出口处设有光路选择装置，该装置由步进电机和遮光片组 成，遮光片上开有两波长光交替输出对应的窗口，在窗口上装有聚光透镜，会聚后的 光射入滤光片；得到两束单色光；2) 、信号对数放大转换输出的两路电信号输入到A/D转换器；3) 、通过控制对步进电机和A/D转换器实现同步，保证不同波长信号和A/D输 出相一致；4) 、然后对两路数字信号进行整形变换，送给信号处理的接口电路。
3、 多波长核酸蛋白层析分离和检测装置，由控制器、紫外光源、干涉滤光片分 光、样品池、光电管，信号放大器，对数转换器，A/D转换器构成，其特征是采用双 通道A/D转换器，所述紫外光源是经两干涉滤光片分光后成不同波长的两束单色光的 紫外光源，两束单色光通过光路和狭缝射到样品池后分别透射到光电管上，光电管经 光电转换器得到两路与透射光强度成正比例的电信号，所述电信号接信号放大器进行 信号放大，并接对数转换器进行信号对数转换，对数转换得到的信号与样品池光吸收 成正比例，再连接双通道A/D转换器，双通道A/D转换器输出数字信号；由控制器连 接A/D转换器的控制端和输出端、并连接上位电脑工作站的信号处理的接口电路。
4、 根据权利要求3所述的多波长核酸蛋白层析分离和检测装置，其特征是光源产生的两束单色光结构是在紫外光源内部出口处设有光路选择装置，该装置由步进 电机和遮光片组成，遮光片上开有4对窗口，分别对应着两种波长的单色光输出，在 窗口上装有聚光透镜，会聚后的光射入滤光片；对数放大器输出的两路电信号输入到 A/D转换器；设有步进电机带动遮光片旋转，分别在光路中输出两种波长的单色光。
全文摘要
多波长核酸蛋白层析分离和检测装置，由控制器、紫外光源、干涉滤光片分光、样品池、光电管，信号放大器，对数转换器，A/D转换器构成，采用双通道A/D转换器，所述紫外光源是经两干涉滤光片分光后成不同波长的两束单色光的紫外光源，两束单色光通过光路和狭缝射到样品池后分别透射到光电管上，光电管经光电转换器得到两路与透射光强度成正比例的电信号，所述电信号接信号放大器进行信号放大，并接对数转换器进行信号对数转换，对数转换得到的信号与样品池光吸收成正比例，再连接双通道A/D转换器，双通道A/D转换器输出数字信号；由控制器连接A/D转换器的控制端和输出端、并连接上位电脑工作站的信号处理的接口电路。
文档编号G01N21/59GK101620182SQ200910032840
公开日2010年1月6日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者徐顺利 申请人:南京大学