一种蛇毒抗肿瘤的细胞毒素及其生产工艺的制作方法

专利名称：一种蛇毒抗肿瘤的细胞毒素及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化与生物医药领域，具体的说是一种蛇毒细胞毒素及其生产 工艺。
技术背景细胞毒素的分离纯化最早是在1947年由印度学者用盐析法(Na2S04和NaCl)从印度眼镜蛇毒中分离得到的；接着RavdonatandHoller用纸层析法；Braganca等经CM-celMose离子交换层析、Sephadex G-50凝胶过滤等步骤分离出CytotoxinP6;杜雨苍等用SP-SephadexC-25阳离子交换层析从中华眼镜蛇毒中分离出5个细胞毒素。但随着对细胞毒素研究的深入，许多学者注意到采用传统的分离方法会出现痕量的磷脂酶A2 (PLA2) (0.1 0.5%,w/w)与CTX共同洗脱下来，而PLA2与CTX会产生协同作用，可使CTX的溶血作用显著增强，也可使它的细胞毒性增加数倍，严重干扰了对CTX的生物学活性及其作用机制的研究，因此分离得到不含PLA2的CTX很重要。Hodges等介绍了一种新的从眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素同系物的方法(1)粗毒过SephadexG-50凝胶过滤柱去除大分子杂蛋白，得主要毒素峰；(2)主峰过SP-SephadexC-25阳离子交换层析，线性梯度洗脱得一系列蛋白峰；(3)主峰再过反相高效液相(RP-HPLC)。这种方法对去除痕量磷脂酶A2很有效，同时也保留了CTX的全部生物学活性。 发明内容为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的蛇 毒细胞毒素纯品及其生产工艺。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是--种具有抗肿瘤作用的蛇毒细 胞毒素，其特征是取之于现有眼镜蛇毒冻干粉。所述的眼镜蛇毒冻干粉是未经双蒸水溶解的。一种具有抗肿瘤作用的蛇毒细胞毒素生产工艺，其特征是1) 去杂质的眼镜蛇毒冻干粉未经适量的双蒸水溶解后，hSP S印harose High Performance阳离子交换柱层析，得20个蛋白峰(I一XX )，收集具有细胞毒素 活性的XII、 XIII峰。2) 收集具有细胞毒素活性的Xn、 XIII峰分别上经Source 30RPC反相层析， 分别得到主蛋白峰一个，即细胞毒素XII和细胞毒素XIII。所述的SP Sepharose High Performance (GE Healthcare公司产品)。所述的Source 30RPC(GE Healthcare公司产品)。 本发明的有益效果是本发明的生产工艺第l步骤与现有技术不同的是 选用高分辨率快速阳离子交换介质SP S印harose H. P ,在MTAexpl。rer蛋白纯化 系统进行分离纯化，因而获得高分辨率的分离效果，故可获得20个蛋白峰，而 使用现有技术工艺最多获得15个蛋白峰；在AKTAexplorer蛋白纯化系统用SP S印harose H. P分离蛋白质不仅分辨率极高，而且有良好的重复性和工艺放大能 力。本发明的第2步骤选用高速低反压高分辨率Souixe 30RPC介质，获得高分辨 率精细纯化效果，第1步骤获得的细胞毒素组分经第2步纯化即获得不含PLA的细 胞毒素纯品，比现有技术纯化步骤具有快速重复性好，适合放大生产。
以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明图l为蛇毒经SP-S印harose H. P阳离子交换柱层析图谱。图中眼镜蛇毒粗毒经SP-S印harose H. P阳离子交换色谱分离得到20个蛋白峰，分别记为i 、 n、 m、 iv、 v、 vi、 vn、 vni、 ix、 x、 xi、 xii、 xm、 xiv、 xv、 xn、 xvn、 xvm、 xn和xx。测定各洗脱峰对大鼠离体心脏和离体 隔神经隔肌标本的影响的影响，发现组分x工、XII、 xin和xiv具有抑制心脏 收縮幅度，使心脏停于收縮期，能抑制直接刺激膈肌引起的收縮，初歩鉴定为细胞毒素组分。图2和图3为具有细胞毒活性蛋白峰经Source30 RPC反向层析图谱。 将XII、 XlII用Source30 RPC柱进一步纯化，各得到主蛋白峰l个，分别记为CTX—XII 和CTX_XIII。经鉴定他们均具有杀伤肿瘤细胞作用。其中图2为Source 30RPC反相层析纯化CTX-XII; 图3为Source 30RPC反相层析纯化CTX-XIII。
具体实施方式
实施例1:1、眼镜蛇毒粗毒的离子交换色谱取舟山眼镜蛇毒粗毒10,0g溶于双蒸水100ml中，4"C过夜低温(4 。C) 15000Xg离心15 min，取上SP S印harose High Performance阳离子交换 层析柱(5.0X29cm)，用O. 05mol / L磷酸缓冲液(pH 5. 8)及O. 0-0. 5 mol / L NaCl阶段性梯度洗脱，10ml/管，流速18ml/min，用MTA Explorer蛋白纯化 系统监测收集洗脱峰。结果眼镜蛇毒粗毒的SP S印harose H. P柱层析分离 共得20个蛋白峰(参见

图1)。 2、各分离组分的生物活性鉴定 1)组分对大鼠离体心脏灌流的影响 参照Langendorff法，健康SD系大鼠处死后迅速取出心脏(心脏上连有约 lcm长的主动脉)，立即置入氧饱和的Krebs液(每升Krebs含NaCl 6.9g， KC1 0.35g， MgS04 7H20 0.29g， KH2P04 0'16g， Glucose 2g， NaHC03 2.1g，无水 CaCl2 0.28g ， pH7.0)中，轻轻挤压心脏，主动脉固定于心脏套管上，37。C恒 温水浴，Kreb's液灌流，持续通02，药液从心脏套管注入，心脏收缩力通过张 力换能器描计于二道生理记录仪上。各组分对大鼠离体心脏标本的影响结果 组分I一X和XVI—XX对Langendorff心脏标本收縮作用无影响；组分XI XV使大鼠离体Langendorff心脏收縮幅度减少，最后停搏于收缩期(参见图2)。 2)组分对大鼠离体膈神经-膈肌标本的影响参照Bulbring法制备标本，取SD系大鼠处死后，自胸骨左缘打开胸腔，分 离膈神经，保留部分肋骨和中心腱，膈肌制成扇形，将标本立即置入氧饱和的 Kreb's液中，把中心腱连接线与换能器相连，肋骨端连接线放入盛有Kreb's液的 恒温3(TC水浴槽中(持续通02)，并固定好两个刺激电极，用0.5ms超强方波， 每5min交替刺激神经和肌肉，收縮张力通过换能器描计于二道生理记录仪上， 描计一段曲线作对照，向浴槽内加入待测组分。观察各组分对大鼠离体膈神经-膈肌标本的影响结果组分VIII — X有神经肌肉阻断作用，抑制间接刺激膈肌引 起的收縮；组分XI XV能抑制直接刺激膈肌引起的收縮(参见图2)。由此鉴 定组分VIII—X为神经毒素，XI XV为细胞毒素。3、 细胞毒素的精细纯化 Source 30RPC反相层析纯化CTX经SP-S印harose H. P阳离子交换柱分离所得到的XII、XI11峰再过Resource 30RPC反相层析。洗脱条件A液为0. lyoTFA+iO。/。乙腈;B液为 . 12%TFA+70%& 腈，线形梯度洗脱，监测波长280nm，洗脱速度为10ml/niin。4、 理化性质测定1)纯度鉴定采用SDS-PAGE (Tris-Tricine系统)碱性不连续电泳。凝 胶浓縮胶4%T， 3%C;分离胶16.5%T， 6%C。负极缓冲液O.lmol/LTris， 0.1mol/LTricine， 0.1%SDS， pH8.25;正极缓冲液0.2mol/L Tris， pH 8.9。在 Hoefer电泳仪上电泳，稳流40mA。凝胶用0.025X考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R-250染色，7%冰醋酸脱色。在SDS-PAGE (Tris-Tricine系统)上，组分 XII XHI均呈单一条带。2.4.2分子量测定SDS-PAGE (Tris-Tricine系统)得到的凝胶，在ImageMaster VDS凝胶成像系统上计算CTXXII XI11的分子量估计值。分子量为 7.235禾B 7.381kDa。2、 4、 3、磷脂酶A2(PLA2)活力测定称取500mg卵磷脂加入0.01M脱氧胆酸10ml，在玛瑙研钵里研磨使之乳化， 然后加入0.01M CaCl210ml， 1M NaCl lOml，混匀后用2M KOH调PH为8.0， 用水稀释至100ml，每次取10ml作测定用。加蛇毒样品溶液100uJ (含毒lmg)， 37'C恒温，用0.02MKOH滴定游离脂肪酸，记录半小时的不同时间消耗的KOH 的ml数，换算成脂肪酸的umol数，作图。以初速的直线部分计算比活，单位 为游离脂肪酸的umol数/mg蛇毒，分钟。结果酶活力测定结果均为0，显示组 分X XHI均不混有磷酯酶A2。本实施例所述的细胞毒素活性鉴定及其抗肿瘤活性测定方法同文献"1. 舟山眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化及其体外抗肿瘤活性中国生化药物杂志 2003;24(3):127-30; 2.舟山眼镜蛇毒细胞毒素-F的体内抗肿瘤作用福建医科 大学学报2003; 37(3) :298-300; 3.舟山眼镜蛇毒细胞毒素-F对人鼻咽癌细胞 和乳心肌细胞的作用研究福建医科大学学报2004; 38(2) :121-124 "等。
权利要求
1. 一种具有抗肿瘤作用的蛇毒细胞毒素，其特征是蛇毒细胞毒素取之于现有眼镜蛇毒冻干粉。
2、 根据权利要求l所述的蛇毒细胞毒素，其特征是:所述的眼镜蛇毒冻干粉是 未经双蒸水溶解的。
3、 一种具有抗肿瘤作用的蛇毒细胞毒素生产工艺，其特征是1) 去杂质的眼镜蛇毒冻干粉未经适量的双蒸水溶解后，上SPS印haroseHigh Performance阳离子交换柱层析，得20个蛋白峰I一XX ，分别收集具有细胞毒素 活性的XII、 XIII峰；2) 收集具有细胞毒素活性的XII、 Xin峰分别上经Source 30RPC反相层析，分别得到主蛋白峰一个，即细胞毒素xn和细胞毒素xin。
全文摘要
本发明公开了一种蛇毒抗肿瘤的细胞毒素及其生产工艺，属生化与生物医药领域。本发明蛇毒细胞毒素取之于现有眼镜蛇毒冻干粉。本发明工艺为应用冻干眼镜蛇毒用已知的缓冲液溶解上SP-Sepharose H.P阳离子交换柱(5.0×29cm)，用磷酸缓冲液和NaCl阶段性梯度洗脱，10ml/管，流速18ml/min，用KTAExplorer蛋白纯化系统监测收集洗脱峰，收集具有细胞毒作用的XII、XIII峰，再经Source 30RPC反相层析，分别得到细胞毒素XII和细胞毒素XIII，它们分子量约为6000-7000道尔顿，等电点大于10。本发明获得不含PLA₂的蛇毒抗肿瘤的细胞毒素纯品，比现有技术纯化步骤具有快速重复性好，适合放大生产等。
文档编号C07K14/435GK101270159SQ20081007105
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月16日 优先权日2008年5月16日
发明者许云禄 申请人:福建医科大学