专利名称：抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体而言，针对白唇竹叶青蛇伤的治疗药物，本发明提供了一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法。
背景技术：
毒蛇咬伤突发性强、病情重、进展快及死亡率高，尽快、尽早应用抗蛇毒血清是治疗蛇伤最有效的方法。蛇毒血清系用脱毒的蛇毒免疫马匹，血浆经胃酶消化、硫酸铵盐析后，再进一步精制提纯，制成以去除Fe片段的IgG为主要成分的抗毒血清制剂。抗蛇毒马血清具有分子量大、价格昂贵、流通不便、分离制备复杂，特别是该制剂中的马源IgG系异种蛋白，故常发生过敏反应，一般多见的有皮疹、喉头水肿、血压下降、四肢关节疼痛、血清病、过敏性休克等III型变态反应。 1962年，Williams等发现母鸡受抗原免疫之后，其血液中产生的特异性抗体可转移至卵黄中，因此将卵黄中的免疫球蛋白称为卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin, IgY)。自20世纪90年代以来，已有学者从鸡卵黄中制备出了抗巴西响尾蛇毒、抗具窍腹蛇毒、抗蝰蛇毒、抗蝮蛇毒、抗眼镜王蛇毒及抗中华眼镜蛇毒等数种IgY。与现有的马源性蛇毒抗体相比，抗蛇毒IgY具有以下优点①产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的蛇毒蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类有较强的免疫原性；②收集鸡蛋无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则IgY产量高，约IOOmg/蛋；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯；④由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4°C条件下6个月，IgY活性损失很小，有利于大规模的提纯IgY IgY具有较强耐热、耐酸、抗离子强度和抗酶降解能力IgY不会激活哺乳动物补体系统及细胞表面Fe受体，故可显著降低过敏反应率；⑦IgY不与哺乳动物的RF因子，类风湿因子、SPA、SPG结合，故作为免疫诊断的工具，用于测定患者体内蛇毒种类及残留量，可大大减少假阳性。因此，IgY已成为新一代蛇伤特效药物研制的一个重要方向。白唇竹叶青(Trimeresurus albolabris)隶属蜂科峻亚科(Crotalinae)竹叶青属(Trimeresurus),是我国十大毒蛇之一,其毒液主要含有凝血毒素、出血毒素及各种酶类等，如类凝血酶、磷脂酶、5’ -核苷酸酶等组分，蛇伤后表现为血液毒中毒引起的局部出血、肿胀、疼痛，严重者伤口流血不止，血液不能凝固，全身出血，凝血酶原时间及活化部分凝血酶时间延长，纤维蛋白原减少等弥散性血管内凝血(Disseminated ordiffuseintravascular coagulation, DIC)。目前尚无特异针对白唇竹叶青蛇伤的治疗药物，因此本发明提供了一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种能够特异针对白唇竹叶青蛇伤的治疗药物的制备方法。本发明的目的是通过下述技术方案予以实现本发明一方面涉及一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法，其包括如下步骤(I)取成年白唇竹叶青蛇的蛇毒制备白唇竹叶青蛇毒抗原，将抗原注射到产蛋母鸡中，免疫后收集鸡蛋低温保存；(2)提取和纯化抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体①水稀释法取免疫后鸡蛋，分离出蛋黄液，用双蒸水将卵黄液按I : 8-10稀释，调节pH值为5. 0-5. 2之间，搅拌均匀，0-4°C放置10h-12h，然后以16000-20000g/min低温超速离心10-20min，上清液经超滤浓缩，即为卵黄抗体水提物；②硫酸铵盐析法
在卵黄抗体水提物中加入硫酸铵至35-45%饱和度，充分混匀，0-4°C放置6_10h，离心后弃上清，沉淀即为IgY盐析物；③嗜硫色谱法先以pH 7. 4-7. 6 的含 O. 5-0. 7M Na2SO4 的 15_25mM PBS 平衡 HiTrap IgYPurification HP色谱柱，将IgY盐析物用上述缓冲液溶解后过O. 45 μ m滤膜，通过自动进样阀上样，洗脱未结合组分后，换用pH 7. 4-7. 615-25mM PBS (不含Na2SO4)进行洗脱，流速lml/min，检测波长280nm，收集洗脱峰，经脱盐处理后冻干，即得本发明的抗白唇竹叶青蛇
毒卵黄抗体。在本发明的一个优选实施方式中，所述的取成年白唇竹叶青蛇的蛇毒是通过咬皿法取毒，冷冻干燥后低温保存。在本发明的另一个优选实施方式中，所述的将抗原注射到产蛋母鸡中包括如下步骤将白唇竹叶青蛇毒与完全弗氏佐剂按I : I (V/V)充分乳化后，取22周龄产蛋莱航母鸡，经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下多位点注射；初次免疫剂量为O. 33mg/只，于免疫后的14d、22d后改为不完全弗氏佐剂进行2次加强免疫，免疫剂量分别为O. 66mg/只、I. 32mg/只；免疫后每日收集鸡蛋，编号后于4°C保存。在本发明的另一个优选实施方式中，所述的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体在非还原性SDS-PAGE条件下分子量约为200KDa，在还原状态下显示该抗体包括重链和轻链。通过本发明的方法所制备的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体纯度高，可以有效阻止白唇竹叶青蛇毒对机体的攻击。
图I :抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体SDS-PAGE图谱I为蛋白质Marker ；2为非还原性电泳；3为还原性电泳
具体实施例方式抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备(I)白唇竹叶青蛇毒抗原的制备成年白唇竹叶青蛇采用咬皿法取毒，冷冻干燥后低温保存，测定蛇毒ld5(i。(2)乳化佐剂及免疫动物将白唇竹叶青蛇毒与完全弗氏佐剂按I : l(v/v)充分乳化后，取22周龄产蛋莱航母鸡(I. 5±0. Ikg)，经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下多位点注射。初次免疫剂量为O. 33mg/只，于免疫后的14d、22d后改为不完全弗氏佐剂进行2次加强免疫，免疫剂量分别为O. 66mg/只、I. 32mg/只；免疫后每日收集鸡蛋，编号后于4°C保存，留取免疫前的鸡蛋作为阴性对照。采用单元式笼养，一鸡一舍，喂以标准蛋鸡饲料及清洁水。(3)抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的提取和纯化①水稀释法取免疫后鸡蛋，分离出蛋黄液，用双蒸水将卵黄液按I : 9稀释，调节pH值为5. 1，搅拌均匀，4°C放置10h-12h，然后以18000g低温4°C超速离心15min，上清液经超滤浓缩，SP为卵黄抗体水提物。②硫酸铵盐析法
在卵黄抗体水提物中加入硫酸铵至40%饱和度，磁力搅拌器充分混匀，4°C放置8h,离心后弃上清,沉淀即为IgY盐析物。③嗜硫色谱法先以pH 7. 520mM PBS(含 0.6M Na2SO4)平衡 HiTrap IgY Purification HP 色谱柱，将IgY盐析物用上述缓冲液溶解后过O. 45 μ m滤膜，通过自动进样阀上样，洗脱未结合组分后，换用pH 7. 520mM PBS (不含Na2SO4)进行洗脱，流速lml/min，检测波长280nm，收集洗脱峰，经脱盐处理后冻干，即得本发明的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体。抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的效价及纯度检测(I)抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的检测采用间接ELISA法，以5 μ g/ml白唇竹叶青蛇毒碳酸缓冲液(pH 9. 6) 100 μ I/孔包被96孔酶标板，4°C放置过夜；取出后以pH 7.4 PBST (含O. 05% Tween 20的PBS缓冲液)缓冲液洗涤酶标板3次，再以含I % BSA的PBST (含O. 01 % Tween 20的PBS缓冲液)封闭液100 μ I每孔封闭酶标板，37°C温育2h ;取出后洗涤、甩干，每孔加以抗体稀释液(含1% BSA的PBST溶液)倍比稀释的纯化卵黄抗体100 μ 1，同时以免疫前的卵黄抗体作阴性对照，以未包被蛇毒孔加入经稀释的卵黄抗体做空白对照，37°C温育I. 5h ;洗涤后加入HRP标记的兔抗鸡IgG (按I 5000稀释)100μ1，37 温育1.5h;洗涤后每孔加入底物TMB溶液100μ 1，37°C显色15min，每孔加50 μ I 2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪上读取波长为450nm的吸光度(A)值。结果判断测定孔A值> 阴性对照孔均值2. I倍以上，可判定本发明所制备的抗体为阳性。(2) IgY纯度鉴定及Mr测定按SDS-PAGE法进行。还原SDS-PAGE为上样缓冲液中含有5%的巯基乙醇，非还原SDS-PAGE上样缓冲液中不含巯基乙醇。还原、非还原SDS-PAGE浓缩胶浓度均为5%，分离胶浓度均为10%，每道上样量约为50yg。电泳结果显示(见附图I)，制备的卵黄抗体在非还原性SDS-PAGE条件下显示为单一条带，分子量约为200KDa，在还原状态下显示该抗体由重链和轻链组成。抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的保护性实验选用健康昆明小白鼠20只，随机分成2组，每组10只。将6. 6mg/kg (相当于2LD5(I)的白唇竹叶青蛇毒液与39. 6mg/kg的纯化IgY液混合，置37°C恒温水浴箱中孵育60min，腹腔注射试验组小鼠。同时以免疫前IgY抗体与蛇毒液混合，孵育后腹腔注射小鼠作为对照组，记录48h内动物的存活率。结果显示，试验组小鼠全部存活，而对照组小鼠Ih内均死亡，证明该方法制备的卵黄抗体可以有效阻止白唇竹叶青蛇毒对机体的攻击。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
权利要求
1.一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法，其包括如下步骤 (1)取成年白唇竹叶青蛇的蛇毒制备白唇竹叶青蛇毒抗原，将抗原注射到产蛋母鸡中，免疫后收集鸡蛋低温保存； (2)提取和纯化抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体 ①水稀释法 取免疫后鸡蛋，分离出蛋黄液，用双蒸水将卵黄液按I : 8-10稀释，调节pH值为.5.0-5. 2之间，搅拌均匀，0-4 °C放置10h-12h,然后以16000-20000g/min低温超速离心.10-20min，上清液经超滤浓缩，即为卵黄抗体水提物； ②硫酸铵盐析法 在卵黄抗体水提物中加入硫酸铵至35-45 %饱和度，充分混匀，0-4 V放置6-10h，离心后弃上清，沉淀即为IgY盐析物； ③嗜硫色谱法先以 pH 7. 4-7. 6 的含 O. 5-0. 7M Na2SO4 的 15_25mM PBS平衡HiTrap IgYPurificationHP色谱柱，将IgY盐析物用上述缓冲液溶解后过O. 45 μ m滤膜，通过自动进样阀上样,洗脱未结合组分后，换用pH 7. 4-7. 615-25mM PBS (不含Na2SO4)进行洗脱，流速lml/min，检测波长280nm，收集洗脱峰，经脱盐处理后冻干，即得本发明的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体。
2.根据权利要求I所述的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法，所述的取成年白唇竹叶青蛇的蛇毒是通过咬皿法取毒，冷冻干燥后低温保存。
3.根据权利要求I所述的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法，所述的将抗原注射到产蛋母鸡中包括如下步骤将白唇竹叶青蛇毒与弗氏佐剂按I : l(v/v)充分乳化后，取22周龄产蛋莱航母鸡，经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下多位点注射；初次免疫剂量为.O.33mg/只，于免疫后的14d、22d后改为不完全弗氏佐剂进行2次加强免疫,免疫剂量分别为O. 66mg/只、I. 32mg/只；免疫后每日收集鸡蛋，编号后于4°C保存。
4.根据权利要求I所述的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法，所述的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体在非还原性SDS-PAGE条件下分子量约为200KDa,在还原状态下显示该抗体包括重链和轻链。
全文摘要
本发明公开了一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法，其包括(1)取成年白唇竹叶青蛇的蛇毒制备白唇竹叶青蛇毒抗原，将抗原注射到产蛋母鸡中，免疫后收集鸡蛋低温保存；(2)通过水稀释法、硫酸铵盐析法和嗜硫色谱法提取和纯化得到抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体。通过本发明的方法所制备的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体纯度高，可以有效阻止白唇竹叶青蛇毒对机体的攻击。
文档编号C07K16/02GK102964448SQ20121050009
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者和七一, 余晓东, 段海龙 申请人:重庆师范大学