专利名称：一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法
技术领域：
本发明属于生物医药提取技术领域，尤其是涉及一种从眼镜蛇蛇毒中提取神经生 长因子(Nerve Growth Factor, NGF)的方法。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是迄今为止发现的唯一不仅对中枢及 外周神经的正常神经细胞有营养因子作用，而且具有调节损伤神经修复机能的生物活性分 子。神经生长因子在临床上有重大的应用价值，目前的适应症主要包括各种外周神经病、视 神经损伤、脊椎损伤、颅脑损伤、中枢神经系统缺氧和缺血造成的损伤及早老性痴呆等。NGF 可以从蛇毒、人胎儿脑髓、人胎盘及雄性小鼠的颂下腺中提取，也可以通过基因工程的方法 制备。其中，基因工程表达是制备NGF的趋势，但由于神经生长因子须在CHO细胞等真核细 胞表达系统中才有较好的生物活性，技术难度大，形成工业化生产尚有相当长的时间。而人 胎儿脑髓、人胎盘等组织来源困难、成本高；雄性小鼠颂下腺原料成本高并且有动物组织污 染的风险。通过人工养殖毒蛇，蛇毒原料来源稳定，成本低。同种毒蛇所产蛇毒性质均一，原 料的稳定性高。并且避免了破碎生物组织产生污染源的可能。原有的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的制备方法，是将眼镜蛇蛇毒原料溶于50mM Tris-HCL, pH 7. 0加有蛋白酶活性抑制剂的溶液中，离心后上清液上样到用溶解原料的溶 液平衡好的Sephadex G-100的分子筛层析柱，收集活性部分，透析交换缓冲液到NaAC，pH 5. 0的缓冲液，将交换完缓冲液的样品上样到透析缓冲液平衡好的CM-52柱，NaCL溶液梯度 洗脱，收集活性部分，将活性部分上样到含NaCL溶液，pH5. 0，50mmol/L的NaAC溶液平衡好 的Sephadex G-100层析柱，收集活性部分，即为眼镜蛇蛇毒神经生长因子。此制备过程采用的是羧甲基纤维素阳离子层析介质(CM-52)，此介质在使用过程 中由于流速太慢，柱床高度会随缓冲液浓度及PH改变，而且不能承受0. IM以上的NaOH在 位清洗，重生效果差，若用于规模化生产，则会影响效率。S^hadex G-100层析介质的刚性 差流速慢，承受压力后容易变形使流速更慢并且影响分离效果。交换缓冲液使用透析技术， 速度慢、透析过程终点不容易掌握，溶液用量大，不适于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种生产周期短、生产效率高、采 用超滤替代透析以及使用高流速、高载量的离子交换凝胶CM Sepharose FF和高分辨率的 分子筛凝胶Superdex 75prepgrade来制备眼镜蛇蛇毒神经生长因子适于规模化生产的方法。本发明的目的是这样实现的，一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒的神经生长因子 的纯化方法，其特点在于
1)将冻干的眼镜蛇蛇毒干粉溶于水后加入硫酸铵，使其成为50 60%的硫酸铵 溶液，待其充分混勻后，静置30min，IOOOOrpm离心30min，收集上清液，2)选用截留分子量为3k 5k的超滤膜包将上清液超滤交换缓冲液为pH 5. 0的 50mMNaAc 溶液；3)将完成缓冲液交换的上清液过0. 22 μ m滤膜，除去杂质颗粒和细菌；4)将过膜后的上清液上样于pH 5. 0浓度为50mM的NaAc缓冲溶液平衡好的CM Sepharose FF层析柱，流速5ml/min，上样完毕，在8倍柱体积内将缓冲液中的NaCL浓度从 0升至0. 5M，直线梯度；5)收集上步骤中的具有NGF活性的蛋白，用3K超滤膜膜包将蛋白溶液浓缩；6)浓缩后的目的蛋白上样于含0. 15mol/L NaCL溶液，pH7. 520mmol/L的Tirs溶 液平衡好的Superdex 75prep grade柱，流速8ml/min，收集目的蛋白，即为眼镜蛇蛇毒神 经生长因子原液。本发明方法与原有方法相比大大缩短了生产周期，提高了处理量和得率，适用于 规模化生产。用硫酸铵溶液处理蛇毒，沉淀了原料中的大量杂蛋白，为后续的离子交换步骤减 轻压力，提高了处理量，采用此法的优点是1、周期短，整个沉淀过程只要一小时，大大低于采用层析法所需要的时间。2、要求低，整个过程中只需要硫酸铵一种辅料，且不需特殊设备。3、效果好，能在短时间内去除多达约50%的杂蛋白。使用超滤膜膜包，其中的超滤膜是以高分子材料采用特殊工艺制成的半透膜，在 压力的作用下小于膜孔径的分子透过膜成为超滤液，其它的高分子物质，胶体，超微粒子， 细菌等则被膜阻挡成为浓缩液，从而达到物质的分离，浓缩提纯之目的。超滤分离对于极稀 溶液中分离溶质具有广泛的适应性，与其它分离过程相比，有如下特点1、超滤过程在常温下进行，能耗低，不需加热，无热效应及相态变化，不需加入其 它物质即可达到分离、浓缩、纯化即分级等目的，故特别适用于1)热敏性物质(生物制品、 菌体、蛋白质)的浓缩分离。2)极稀溶液的浓缩回收。3)恒体积恒浓度下的脱盐纯化。2、超滤膜耐化学侵蚀，PH适应范围广。3、处理量大，速度快，适合于工业化生产和放大。采用琼脂糖凝胶介质，有以下特点1、介质载体为刚性材料，粒度90μπι，流速快，结合量大，线速度可达到 300-500cm/h,对粗提液处理速度快。2、该介质再生效果好。活性部分洗脱后，可用.0.5M NaOH溶液进行在位清洗，洗 脱杂质效果好。同时避免了拆柱和再次装柱，节省时间。3、该介质装填不需要特殊设备，效果重现性好，可以按比例放大适合工业化生产。采用超滤膜浓缩样品，提高样品的浓度可以收取更多的最终产品，提高了得率，减 小体积后用更少的层析介质即可完成分离，节约了成本。本发明通过 使用硫酸铵沉淀杂蛋白，超滤替代透析以及使用流速更快、分辨率更 高的层析介质达到了节约生产时间、生产成本，提高了原料处理量，获得高品质、高得率产 品的目的。适用于规模化生产。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。图 ICM Sepharose FF 层析图 图 2Superdex 75pr印 grade 层析图
具体实施例方式实施例，一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法，是包括以 下步骤(1)硫酸铵沉淀原料将合格的冻干眼镜蛇蛇毒干粉IOg溶于200ml水，可适当搅拌，但要避免产生过多 的泡沫，待蛇毒完全溶解后，以IOOOOrpm离心lOmin，取上清液过0. 45μπι的滤膜，去除不溶 性杂质，加入硫酸铵110g，适当搅拌，同样要避免产生过多的泡沫，形成55%浓度的硫酸铵 溶液后，静置30min待溶液中的胶体完全聚合，析出沉淀，而后IOOOOrpm离心使沉淀和上清 分离，小心倒出上清液120ml，备用；(2)超滤交换缓冲液将上步骤所得上清液120ml倒入3KDa分子量超滤系统，调整压力和流速，经10倍 体积缓冲液循环后上清液的缓冲液换成PH 5. 0浓度为50mM的NaAc溶液，将上清液倒出再 过0. 22 μ m滤膜以便除去细菌和杂质颗粒；(3)CM S印harose FF 层析过膜后的上清液溶液上样到pH 5.0浓度为50mM的NaAc溶液平衡好的CM Sepharose FF层析柱(5. 0 X 30cm)，流速5ml/min，待流穿峰洗脱完毕后，换洗脱缓冲液，洗 脱缓冲液是在平衡缓冲液中加NaCl，使NaCl浓度在8倍柱体积内以直线梯度均勻地从0升 至0. 5M，收集活性部分，见图1 ；(4)超滤浓缩蛋白溶液收集的活性部分倒入超滤系统，调整压力和流速，待储存杯中的溶液60ml时倒 出，留待下步骤使用；(5) Superdex 75prep grade 层析将浓缩好的蛋白溶液上样于含0. 15mol/L NaCl，pH7. 5，20mmol/L的Tirs溶液平 衡好的Superdex 75 prep grade层析柱(5. 0 X80cm)，流速8ml/min，收集目的蛋白，即为 眼镜蛇蛇毒神经生长因子原液，见图2 ；(6)除盐、冷冻真空干燥将步骤(5)得到的神经生长因子产品峰用3KDa分子量超滤膜超滤除盐，过 0. 22 μ m滤膜，无菌分装，冷冻干燥后既得神经生长因子62mg。
权利要求
一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法，其特征在于1)将冻干的眼镜蛇蛇毒干粉溶于水后加入硫酸铵，使其成为50～60％的硫酸铵溶液，待其充分混匀后，静置30min，10000rpm离心30min，收集上清液，2)选用截留分子量为3k～5k的超滤膜包将上清液超滤交换缓冲液为pH 5.0的50mM NaAc溶液；3)将完成缓冲液交换的上清液过0.22μm滤膜，除去杂质颗粒和细菌；4)将过膜后的上清液上样于pH 5.0浓度为50mM的NaAc缓冲溶液平衡好的CM Sepharose FF层析柱，流速5ml/min，上样完毕，在8倍柱体积内将缓冲液中的NaCL浓度从0升至0.5M，直线梯度洗脱；5)收集上步骤中的具有NGF活性的蛋白，用3K超滤膜膜包将蛋白溶液浓缩；6)浓缩后的目的蛋白上样于含0.15mol/L NaCL溶液，pH7.520mmol/L的Tirs溶液平衡好的Superdex 75 prep grade层析柱，流速8ml/min，收集目的蛋白，即为眼镜蛇蛇毒神经生长因子原液。
全文摘要
本发明公开了一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法，是将冻干的眼镜蛇蛇毒溶解后用硫酸铵溶液进行沉淀，然后离心取上清液，采用截留分子量为3K的超滤膜膜包超滤，交换缓冲液至pH 5.0浓度为50mM的NaAc缓冲溶液，交换完缓冲液的样品上样于CM Sepharose FF柱层析，收集目的蛋白，上样于Superdex 75柱，收集目的蛋白，得到眼镜蛇蛇毒神经生长因子原液，本发明与现有技术方法相比提高了处理量和得率，适用于规模化生产。
文档编号C07K14/48GK101845093SQ20101001146
公开日2010年9月29日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者刘志强, 吕宪峰, 张坤, 曹恒, 林峰, 王东 申请人:中鑫东泰(莱阳)纳米基因生物技术有限公司