眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及药物【技术领域】，特别涉及眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。眼镜蛇毒能够对长期反复接触LPS诱导产生的慢性阻塞性肺炎有明显的治疗效果，能有效改善肺组织的病理损伤。中华眼镜蛇蛇毒不仅能降低慢性阻塞性肺炎小鼠肺系数，还能有效保护肺组织。不仅能抑制病变小鼠肺组织内IκB-α的降解、同时还能下调TGF-β1的表达。不仅能降低TNF-α水平，还能降低炎症因子IL-1的水平。
【专利说明】眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物【技术领域】，特别涉及眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]慢性阻塞性肺疾病为一种具有气流受阻为特征的慢性呼吸系统疾病，患病人数多，死亡率现已为全球死亡原因的第四位，且有逐年增加的趋势。吸烟或暴露在烟雾环境中是造成慢性阻塞性肺疾病的主要原因。慢性阻塞性肺疾病发生、发展及演变过程中另一个重要的因素便是反复的呼吸道感染，脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种内毒素，是呼吸道感染的一种主要诱发因素，存在于烟雾、空气中，可刺激机体产生IL-1和TNF- α等炎症因子，使气道和肺组织发生炎症反应，反复多次给予LPS也是实验研究中用于制作慢性阻塞性肺疾病模型的主要方式。
[0003]蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。新鲜毒液呈蛋清样粘稠液体，具有特殊的腥味。不同蛇种毒液色泽各异，中华眼镜蛇蛇毒呈淡黄色。蛇毒的干物质中90%以上是蛋白质，是其毒性和生物学活性的主要成分。中华眼镜蛇蛇毒成分主要有眼镜蛇蛇毒因子(1% _2%)、心脏毒素(40%-50%，又名细胞毒素、膜毒素)、神经毒素(10%)等其它类蛋白质。祖国传统医学认为眼镜蛇及其毒性成分可通经络，祛风湿，并具有强身健体之功效。早在二十世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，随后出现一系列关于蛇毒有类似吗啡样镇痛作用的报道。随着研究的不断深入，现在蛇毒及其制品已应用于临床，除了镇痛作用外，研究发现在抗风湿、抗肿瘤以及在神经系统疾病治疗方面都有很好的疗效，但是在治疗慢性阻塞性肺疾病的作用还未见报道。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明提供眼镜蛇蛇毒及神经毒素在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，提供了一种治疗慢性阻塞性肺疾病的新思路、新方法。需要说明的是物理改性的中华眼镜蛇蛇毒最好，但是未改性的眼镜蛇总毒和其中的神经毒素、膜毒素和眼镜蛇毒因子也是有效的。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0006]本发明提供了眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。
[0007]慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病，与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，全球40岁以上发病率已高达9%?10%。慢性阻塞性肺病的确切病因尚不清楚，一般认为与慢支和阻塞性肺气肿发生有关的因素都可能参与慢性阻塞性肺病的发病。已经发现的危险因素大致可以分为外因(即环境因素)与内因(即个体易患因素)两类。外因包括吸烟、粉尘和化学物质的吸入、空气污染、呼吸道感染以及社会经济地位较低的人群(可能与室内和室外空气污染、居室拥挤、营养较差以及其他与社会经济地位较低相关联的因素有关)。内因包括遗传因素、气道反应性增高者、在怀孕期、新生儿期、婴儿期或儿童期由各种原因导致肺发育或生长不良的个体。
[0008]在本发明的一些实施例中，所述眼镜蛇包括中华眼镜蛇和/或泰国眼镜蛇。
[0009]在本发明的一些实施例中,所述蛇毒包括神经毒素、心脏毒素(膜毒素)或蛇毒因子。
[0010]在本发明的一些实施例中，所述蛇毒为改性蛇毒或未改性蛇毒。
[0011]本发明通过中华眼镜蛇总毒及神经毒素经物理方法处理达到减毒增效目的，物理处理后的眼镜蛇毒能够抑制脂多糖(LPS)诱导的急性肺部炎症，并且对于长期反复给予脂多糖(LPS)诱导产生的慢性阻塞性肺疾病均具有显著的治疗作用，其疗效超过未经处理的眼镜蛇毒。
[0012]本发明中的眼镜蛇是人工饲养的眼镜蛇，在无菌条件下采毒，经冷冻干燥成淡黄色粉末，低温保存。本发明通过中华眼镜蛇总毒经物理方法处理达到减毒增效目的。中华眼镜蛇蛇毒在临床上已用于治疗风湿和缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛等，但都用纯化的神经毒素、多种蛇毒的混合制剂或眼镜蛇毒和其它中药的复方制剂。鉴于中华眼镜蛇毒毒性比较大，蛇毒中的药用成分主要是蛋白质，其结构和生物活性可以被理化因素改变。蛇毒在用过氧化氢处理后，二硫键被打开，其毒性大大降低，但是镇痛作用也几乎消失，提示生物学活性被破坏。而蛋白质加热后可发生可逆性变性，变性后空间结构发生了改变，或部分大分子蛋白质因加热部分分解为小分子量蛋白质。小鼠试验证明这种加热变性并复性之后的蛇毒毒性明显减少，而药效增加。蛇毒成分尤其是神经毒素对胃蛋白酶的降解不敏感。本发明人发现加热变性的中华眼镜蛇蛇毒对脂多糖引起的急性肺部炎症以及长期反复给予脂多糖诱导产生的慢性阻塞性肺炎有明显的改善作用并且可以显著改善肺呼吸功能，提示对肺部炎症以及肺呼吸功能有很好的治疗作用。这一发现，将对肺炎以及慢性阻塞性肺疾病的研究和药物开发产生重大的影响，并有临床实用价值，为中华眼镜蛇蛇毒开辟新的临床用途。
[0013]所述物理改性后的眼镜蛇总毒及神经毒素是通过将眼镜蛇总毒及神经毒素在用去离子水溶解的情况下，加热温度为50?100°C之间，时间在Imin?300min，再自然复性后得到的。
[0014]在本发明的一些实施例中，所述改性蛇毒的制备方法为:取未改性蛇毒与去离子水混合后加热变性、复性。
[0015]在本发明的一些实施例中，所述加热变性的加热温度为50?100°C，加热变性的时间为I?300min。
[0016]在本发明的一些实施例中，所述药物包括所述眼镜蛇蛇毒及药学上可接受的辅料。
[0017]在本发明的一些实施例中，所述药物的剂型为口腔速溶药膜、口服液、片剂、胶囊、分散剂、喷雾剂、注射剂或透皮吸收制剂。
[0018]在本发明的一些实施例中，所述药物的给药剂量为10?3000 μ g/kg动物。
[0019]在本发明的一些实施例中，所述药物的给药剂量为I?1000 μ g/kg人。
[0020]相对于现有技术中的方案，本发明的优点是:
[0021]1.眼镜蛇蛇毒不仅能减轻初次接触内毒素所致的急性肺部炎症，而且对长期反复接触内毒素诱导的慢性阻塞性肺疾病有明显的治疗效果。
[0022]2.眼镜蛇蛇毒不仅能降低肺炎小鼠肺系数，还能有效保护肺组织。
[0023]3.眼镜蛇蛇毒不仅能降低肿瘤坏死因子TNF-α水平，还能降低炎症因子白细胞介素IL-1的水平。
[0024]4.眼镜蛇蛇毒用量少，有效范围大，从10?3000 μ g/kg都有很好的治疗慢性阻塞性肺疾病的作用。人用剂量约为I?1000 μ g/kg。
[0025]本发明公开了眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的用途。本发明发现眼镜蛇毒对肺部炎症有明显的治疗作用，其能减轻炎性细胞的浸润，肺泡损伤，从而改善肺的呼吸功能。眼镜蛇毒治疗慢性阻塞性肺疾病具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和经皮给药等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1示眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠脏器系数的影响；其中，图UA)示LPS诱导急性肺损伤小鼠肺系数；图1(B)示LPS诱导急性肺损伤小鼠肝系数；图1 (C)示LPS诱导急性肺损伤小鼠胸腺系数；图1 (D)示LPS诱导急性肺损伤小鼠脾系数；
[0027]图2示眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠脏器病理学改变的影响；
[0028]图3示眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠血清中IL-1和TNF- α浓度的影响；其中，图3㈧示LPS诱导急性肺损伤小鼠血清IL-1浓度；图3?)示LPS诱导急性肺损伤小鼠血清TNF-α浓度；
[0029]图4示眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠体内I K B- α含量的影响；
[0030]图5示眼镜蛇蛇毒对多次接触LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠体重、肺系数的影响；其中，图5㈧示LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠的体重差值；图5(B)示LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠的的肺系数；
[0031]图6示眼镜蛇蛇毒对多次接触LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠肺组织病理学改变的影响；
[0032]图7示眼镜蛇蛇毒对对多次接触LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠体内TGF- β I的影响。
【具体实施方式】
[0033]本发明公开了眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0034]本发明提供的眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用中所用眼镜蛇蛇毒、试剂、辅料均可由市场购得。
[0035]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0036]实施例1中华眼镜蛇毒的动物药效学实验
[0037]眼镜蛇蛇毒对初次接触脂多糖诱导的小鼠急性肺炎的影响:
[0038]脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，可以引起机体产生多种炎症反应，单次给予脂多糖5mg/kg可以制作小鼠急性肺炎模型，将昆明小鼠随机分为5组(η = 10)雌性各半，体重18-22g:生理盐水对照组、模型组、中华眼镜蛇蛇毒加热小剂量组(30 μ g/kg)、中剂量组(90 μ g/kg)、大剂量组(270 μ g/kg)。在给予脂多糖(5mg/kg)后,观察动物的活动状态，呼吸频率。在眼镜蛇蛇毒在治疗脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤试验中，实施例采用灌胃给药，给药剂量在10-3000 μ g/kg，一天一次。
[0039]3小时后取血，处死动物后取肺、肝、脾、胸腺等脏器称重，离心后得到的血清检测细胞因子白细胞介素-1，肿瘤坏死因子-a (TNF- α )，部分肺组织10%甲醛固定，切片染色，其他用于检测生化指标。
[0040]图1眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠脏器系数的影响，其中*Ρ〈0.05，_Ρ〈0.01与正常组比较；#Ρ<0.05，###P<0.01与模型组比较。其中，图1 (A)示LPS诱导急性肺损伤小鼠肺系数；图1(B)示LPS诱导急性肺损伤小鼠肝系数；图1(C)示LPS诱导急性肺损伤小鼠胸腺系数；图1(D)示LPS诱导急性肺损伤小鼠脾系数。从图1中，在给予脂多糖诱导炎症6小时后，与正常对照组相比，模型组的小鼠肺系数、肝系数均有明显增大，胸腺系数和脾系数也有所增加，给药组脏器系数均有不同程度减小。
[0041]图2为眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠脏器病理学改变的影响(HE染色Χ400)。从图2可知:1、肺病理切片结果提示:正常对照组小鼠肺表面未见病损灶，切面均质，无液体溢出；肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡膈无水肿、炎症等特殊改变。LPS模型组小鼠肺组织水肿明显，可见出血斑点，切面湿润、有水肿液流出；主要病变为弥漫性肺水肿、炎症、出血，可见渗出、间质增宽，血管周围水肿，间质大量炎细胞浸润。蛇毒小、中、大剂量组小鼠上述肺组织病理改变明显减轻。2、肝病理切片结果提示:正常对照组小鼠肝小叶组织结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，汇管区无炎细胞浸润，肝窦枯否氏细胞未见增生，肝细胞未见脂肪性病变。LPS模型组，肝细胞水肿，胞浆呈空网状，髓样变性明显，均可见肝细胞索离断，周围肝细胞轻度水肿伴脂肪变性，肝窦缺血性改变，小叶中央周围或汇管区见多发片状坏死伴淋巴细胞浸润。蛇毒小、中、大剂量组均有不同程度的改善。3、脾病理切片结果提示:正常对照组脾小结大小均匀，中央动脉结构清晰，无明显异常。LPS模型组脾脏白髓明显缩小、红髓扩大并充血，同时脾小体结构不完整，淋巴细胞数目明显减少；蛇毒各治疗组虽脾小结大小不一，但白髓区明显扩大，红髓血管扩张、充血，脾中央小动脉周围淋巴鞘明显扩大，细胞增多，密度增大，病理损伤得到明显改善。
[0042]图3为眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠血清中IL-1和TNF- α浓度的影响。其中，图3㈧示LPS诱导急性肺损伤小鼠血清IL-1浓度；图3(B)示LPS诱导急性肺损伤小鼠血清TNF- α浓度。从图3可以看出，与正常对照组相比，LPS模型组在腹腔注射给药6小时后，血清中炎性细胞因子IL-1和TNF-α含量显著性增加。而给予蛇毒的不同剂量组IL-1和TNF-α含量则明显降低，差异具有统计学意义。
[0043]图4为眼镜蛇蛇毒对初次接触LPS诱导的急性肺损伤小鼠体内I K B- α含量的影响。NF-κ B是调控炎症和免疫反应的主要核转录因子之一，能促进肺泡巨噬细胞IL-1 β、IL-8、TNF-a和TGF-β等炎性细胞因子基因转录。I κ B-α是胞内蛋白家族的一员，它在胞内与NF- K B结合，抑制NF- K B的转录活性。
[0044]通过Western blot实验可以看出，给药组相对于模型组,肺组织中I κ B-α的水平均有明显上升，提示改性后的中华眼镜蛇蛇毒可以抑制LPS诱导的NF-κ B的激活，从而有助于抑制肺部炎症的产生。
[0045]实施例2眼镜蛇蛇毒对反复给予LPS诱导的慢性阻塞性肺炎影响实验
[0046]试验中每周给予一次脂多糖5mg/kg，反复给药8周，可以制作小鼠慢性阻塞性肺炎模型，将昆明小鼠随机分为5组(η = 10)雌性各半，体重18-22g:生理盐水对照组、模型组、中华眼镜蛇蛇毒加热小剂量组(30 μ g/kg)、中剂量组(90 μ g/kg)、大剂量组(270yg/kg)。在给予长期给药过程中，观察动物的活动状态，呼吸频率。在中华眼镜蛇蛇毒在治疗脂多糖诱导的小鼠慢性阻塞性肺炎试验中，实施例采用灌胃给药，给药剂量在10-3000μ g/kg, —天一次。
[0047]实验8周后，小鼠摘眼球取血，然后处死动物取肺、肝、脾等脏器称重，离心后得到的血清检测细胞因子白细胞介素-1，肿瘤坏死因子- a (TNF-a )，部分肺组织10%甲醛固定，切片染色，其他用于检测生化指标。
[0048]试验结果如下:
[0049]图5为眼镜蛇蛇毒对多次接触LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠体重、肺系数的影响。其中图5(A)、图5(B)分别为LPS诱导的慢性阻塞性肺炎小鼠的体重差值、肺系数。*Ρ〈0.05，***Ρ〈0.01与正常组比较；#Ρ<0.05，###P<0.01与模型组比较。与模型组相比，蛇毒小、中、大剂量组小鼠的体重差值具有显著的增加，肺系数明显降低，差别具有统计学意义。
[0050]图6为眼镜蛇蛇毒对多次接触LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠肺组织病理学改变的影响(HE染色Χ400)。正常对照组小鼠肺表面未见病损灶，切面均质，无液体溢出；肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡膈无水肿、炎症等特殊改变。模型组小鼠肺组织明显病变，肺泡壁增厚，细胞出现坏死，间质炎性细胞、淋巴细胞大量浸润，血管周围水肿。蛇毒小、中、大剂量组小鼠上述肺组织病理改变明显减轻，其中中剂量组、大剂量组部分病变组织基本恢复正常。
[0051]图7为眼镜蛇蛇毒对多次接触LPS诱导的慢性阻塞性肺病小鼠体内TGF-β I的影响。TGF-β I能够促进细胞合成炎性细胞因子IL-l，TNF-a，蛇毒小、中、大量组与模型组相比TGF-β I表达强度有不同程度的下调，从而抑制炎症的发生。
[0052]从上述的试验可以看出:
[0053]1.中华眼镜蛇毒能够减轻初次接触LPS诱导的急性肺损伤。
[0054]2.中华眼镜蛇毒对长期反复接触LPS诱导产生的慢性阻塞性肺炎有明显的治疗效果，能有效改善肺组织的病理损伤。
[0055]3.中华眼镜蛇蛇毒不仅能降低慢性阻塞性肺炎小鼠肺系数，还能有效保护肺组织。
[0056]4.中华眼镜蛇蛇毒不仅能抑制病变小鼠肺组织内Ik Β-α的降解、同时还能下调TGF-β I的表达。
[0057]5.中华眼镜蛇蛇毒不仅能降低TNF-α水平，还能降低炎症因子IL-1的水平。
[0058]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.眼镜蛇蛇毒在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述眼镜蛇包括中华眼镜蛇和/或泰国眼镜蛇。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛇毒包括神经毒素、心脏毒素或蛇毒因子。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛇毒为改性蛇毒或未改性蛇毒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改性蛇毒的制备方法为:取未改性蛇毒与去离子水混合后加热变性、复性。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述加热变性的加热温度为50?100°C，加热变性的时间为I?300min。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述眼镜蛇蛇毒及药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口腔速溶药膜、口服液、片剂、胶囊、分散剂、喷雾剂、注射剂或透皮吸收制剂。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为10?3000yg/kg动物。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为I?1000μ g/kg人。
【文档编号】A61K35/583GK104434981SQ201410616549
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】秦正红, 崔 奎, 寇建群 申请人:苏州人本药业有限公司