专利名称：用离子交换层析纯化蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及蛋白质纯化。具体说，本发明涉及使用离子交换层析从包含多肽和至少一种污染物的组合物中纯化多肽(例如抗体)。
背景技术：
对于生物技术产业来说，蛋白质的大规模、经济的纯化是一个日逾重要的问题。通常，使用经过基因工程改造能产生感兴趣的蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系，通过插入一种含有该蛋白质基因的重组质粒，经过细胞培养来产生蛋白质。由于所用的细胞系是活的有机体，它们必须用含有糖、氨基酸和生长因子，通常由动物血清制备物提供的复合生长培养基来喂养。从喂养给细胞的化合物混合物中和从细胞本身的副产品中，将所需蛋白质分离出来，达到足够作为人治疗用的纯度，是一种艰难的挑战。
从细胞碎片中纯化蛋白质的程序首先由蛋白表达的位点所决定。可使一些蛋白质直接从细胞分泌到周围的生长培养基中；其它蛋白质则在细胞内产生。对于后一种蛋白质，纯化过程的第一步涉及裂解细胞，这可通过不同方法完成，包括机械剪切、渗透压休克或酶处理。这些破坏方法使细胞的全部内容物释放到组织匀浆中，并额外产生了由于其体积小难于除去的亚细胞片段。通常须通过差速离心或过滤除去它们。在蛋白质产生过程中，由于细胞自然死亡直接分泌的蛋白质和宿主细胞胞内蛋白质的释放，也产生同样的问题，尽管量较小。
一旦获得了含有感兴趣蛋白质的澄清溶液，通常尝试联合应用不同层析技术来将其与细胞产生的其它蛋白质分离。这些技术根据蛋白质的电荷、疏水程度、或大小来分离蛋白质混合物。这些技术中的每一种都可采用数种不同的层析树脂，这使得可对涉及的具体蛋白质制定专用的纯化方案。各种这些分离方法的要点是，使蛋白质以不同速度沿一根长层析柱向下运动，而达到物理性分离，这种分离随蛋白质沿柱再向下运动而增加，或选择性的粘附于分离基质，再以不同溶剂差别性洗脱。就某些情况而言，当杂质特异性粘附于层析柱，而感兴趣的蛋白质不粘附时，所需蛋白质即可与杂质分离开来，即，感兴趣的蛋白质存在于“流穿液”中。
离子交换层析是一种常用于蛋白质纯化的层析技术。在离子交换层析中，如果周围缓冲液的离子强度足够低，溶质表面的带电部分就被结合在层析基质上的相反电荷所吸引。通常可提高缓冲液的离子强度(亦即，导电率)与溶质竞争离子交换介质的带电位点，来实现洗脱。改变pH从而改变溶质带电荷量是实现溶质洗脱的另一种方法。导电率或pH的改变可以是逐渐的(梯度洗脱)或分步的(分步洗脱)。在过去，这些改变是渐进的，亦即，pH或导电率单向增大或减小。
发明简述本发明提供了一种离子交换层析方法，其中使感兴趣的多肽在第一导电率或pH下与离子交换材料结合，然后用导电率或pH不同的，或两者都不同的中间缓冲液洗涤离子交换材料。在该中间洗涤后的特定时刻，与离子交换层析的标准方法相反，用洗涤缓冲液洗涤离子交换材料，其中从中间缓冲液改变到洗涤缓冲液的导电率或pH、或两者，与前面步骤中导电率或pH、或两者的改变方向相反。在用洗涤缓冲液洗涤准备好离子交换材料后，才通过使用洗脱缓冲液(它具有和前面步骤中使用的缓冲液的导电率或pH、或两者都不同的导电率或pH、或两者)来洗脱感兴趣的多肽分子。
离子交换层析的本新颖应用方法对必须以充分生产规模(其中同时要求多肽产物的纯度和高回收率)从非常接近的相关污染物分子中分离产物分子特别有用。
因此，本发明提供了一种从包括多肽和污染物的组合物中纯化多肽的方法，该方法包括依次进行的下列步骤(a)用加样缓冲液使多肽结合到离子交换材料上，其中加样缓冲液处于第一导电率和pH；(b)用第二导电率和/或pH的中间缓冲液洗涤离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下污染物；
(c)用第三导电率和/或pH的洗涤缓冲液洗涤离子交换材料，其中从中间缓冲液到洗涤缓冲液的导电率和/或pH的变化，和从加样缓冲液到中间缓冲液的导电率和/或pH的变化方向相反；和(d)用第四导电率和/或pH的洗脱缓冲液洗涤离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下多肽。第一导电率和/或pH可以和第三导电率和/或pH相同。
当离子交换材料包括阳离子交换树脂时，中间缓冲液的导电率和/或pH优选比加样缓冲液的导电率和/或pH大；洗涤缓冲液的导电率和/或pH优选比中间缓冲液的导电率和/或pH小；而洗脱缓冲液的导电率和/或pH优选比中间缓冲液的导电率和/或pH大。优选的，洗涤缓冲液的导电率和/或pH与加样缓冲液的导电率和/或pH相同。
污染物和多肽的优选洗脱是通过分别改变中间缓冲液和洗脱缓冲液的导电率同时保持这两种缓冲液的pH大致相同来实现的。
本发明还提供了一种从包含多肽和污染物的组合物中纯化多肽的方法，该方法包括依次进行的下列步骤(a)用加样缓冲液使多肽结合到阳离子交换材料上，其中加样缓冲液处于第一导电率和pH；(b)用比加样缓冲液大的第二导电率和/或pH的中间缓冲液洗涤阳离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下污染物；(c)用比中间缓冲液小的第三导电率和/或pH的洗涤缓冲液洗涤离子交换材料；和(d)用比中间缓冲液大的第四导电率和/或pH的洗脱缓冲液洗涤离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下多肽。
此外，本发明提供了一种从包含抗体和污染物的组合物中纯化抗体的方法，该方法包括将组合物加到阳离子交换树脂上，其中加到阳离子交换树脂上的抗体量是每毫升阳离子交换树脂大约20毫克到大约35毫克，而且可任选的，还包括将抗体从阳离子交换树脂上洗脱出来。该方法优选还包括一个从离子交换树脂上洗脱出一种或多种污染物的中间洗涤步骤。该中间洗涤步骤通常在抗体洗脱步骤之前。
本发明还提供了包含抗-HER2抗体和它的一种或多种酸性变体的混合物的组合物，其中组合物中酸性变体的量不到大约25％，优选不到约20％，例如，范围在约1％到约18％之内。可任选的，该组合物还包括一种药物学上可接受的载体。
附图简述
图1是流程图，显示如何通过改变导电率(如下文实施例1的NaCl浓度)或通过改变pH(例如流程图中所示pH值)来进行阳离子交换层析。
图2是流程图，显示如何通过改变导电率(如图中描述的NaCl浓度)或通过改变pH(如所示pH值)来进行阴离子交换层析。
图3是在实施例1中以完全生产规模进行阳离子交换层析得到的吸收示踪。用箭头标出了用本文所述的不同缓冲液洗涤柱的点。
图4描述了在各层析组分中(作为相应层析的所有组分总量百分比计算)回收的重组人源化抗-HER2单克隆抗体(rhumAb HER2)。流穿、洗涤步骤、和预合并组分是从加样开始到合并开始收集到的所有流出样品。合并组分是从前导肩的转折点开始的五倍柱体积的洗脱流出样品。再生组分含有从合并结束到再生结束捕获的流出物。
图5显示了用羧基嗍(Carboxysulfon)阳离子交换高效液相层析(CSxHPIEX)评估的各阳离子交换层析合并样品中rhuMAb HER2的质量。峰a、b和l是rhuMAb HER2的脱酰胺基形式。峰3是未脱酰胺基的rhuMAb HER2。峰4是rhuMAb HER2的含有C-末端赖氨酸的变体和异—天冬氨酸变体的组合。
图6显示了各层析用0.025M MES/0.070M NaCl，pH5.6洗涤的吸光度(280nm)概貌谱。rhuMAb HER2加到阳离子交换树脂中的量影响了峰顶的吸光度水平，亦即达到峰顶所需的缓冲液量。由于在该洗涤中存在小峰(在30mg/ml加样中最可见)，将峰顶定义为至少0.5吸光度单位(AU)的吸光度水平。
图7A和7B分别显示了humMAb4D5-8轻链(SEQ ID NO1)和humMAb4D5-8重链(SEQID NO2)的氨基酸序列。
优选例的详述定义本文要纯化的“组合物”包含感兴趣的多肽和一种或多种污染物。组合物可以是“部分纯化”的(亦即，已进行过一次或多次纯化步骤，例如下文实施例1中的蛋白质A层析)或可以直接获自产生该多肽的宿主细胞或有机体(如组合物可以包含收集的细胞培养液)。
本文所用的“多肽”通常指具有约10个以上氨基酸的肽和蛋白质。优选的多肽是哺乳动物蛋白质，其例子包含肾素；包括人生长激素和牛生长激素的生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；因子VIIIC、因子IX、组织因子和vonWillebrands因子等凝血因子；蛋白质C等抗凝血因子；心钠素；肺表面活性剂；尿激酶或人尿或组织型血纤蛋白溶酶原激活剂(t-PA)等血纤蛋白溶酶原激活剂；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化后可调节的、正常T细胞表达并分泌的)趋化因子；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；人血清白蛋白等血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；β-内酰胺酶等微生物蛋白质；DNase；IgE；CTLA-4等细胞毒T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；骨衍生神经营养因子(BDNF)、营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5、NT-6)等神经营养因子或NGF-β等神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；aFGF和bFGF等成纤维细胞生长因子；上皮生长因子(EGF)；TGF-α和TGF-β等转化生长因子，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-1和IGF-II)；去(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD3、CD4、CD8、CD19和CD20等CD蛋白质；促红细胞生成素；骨诱导性因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素-α、-β和-γ等干扰素；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物岐化酶；T-细胞受体；膜表面蛋白质；衰变加速因子；病毒抗原例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM等整联蛋白；HER2、HER3或HER4受体等肿瘤相关抗原；和上述任一多肽的片段和/或变体。最优选的是结合人HER2的全长抗体。
“污染物”是和所需多肽产物不同的物质。污染物可以是所需多肽的变体(如所需多肽的脱酰胺基变体或氨基天冬氨酸变体)或其它多肽、核酸、内毒素等。
起始多肽的“变体”或“氨基酸序列变体”是包含与起始多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽。通常，变体具有和天然多肽至少80％的序列相同性，优选至少90％序列相同性，更优选至少95％序列相同性，而最优选至少98％序列相同性。通过将序列对齐排列来提供最大同源性后，Fitch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801382-1386(1983)(用Needleman等，分子生物学杂志48443-453(1970)描述的算法)确定了序列相同性百分比。通过将合适的核苷酸变化引入编码多肽的DNA中，或通过多肽合成可制备多肽的氨基酸序列变体。这样的变体包含例如感兴趣的多肽的氨基酸序列中残基的缺失、插入和取代，如果最终构建物具有所需特征，可进行缺失、插入和取代的任何组合来得到最终构建物。氨基酸改变还可以改变多肽的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。例如，在美国专利5,534,615中描述了产生多肽的氨基酸序列变体的方法(纳入本文以供参考)。
“酸性变体”是比感兴趣的多肽更加酸性(例如用阳离子交换层析测定)的感兴趣多肽的变体。酸性变体的例子是脱酰胺基变体。
多肽分子的“脱酰胺基”变体是一种多肽，其中原始多肽的一个或多个天冬酰胺残基已被转换成天冬氨酸，亦即，中性酰胺侧链已被转换成具有总酸性特征的残基。下列实施例中的脱酰胺基humMAb4D5抗体在其一个或两个VL区的CDR1中的Asn30被转换为天冬氨酸。本文所用的术语“脱酰胺基人DNase”指天然的成熟人DNA酶氨基酸序列中位点74的天冬酰胺残基处被脱去酰胺基(美国专利5,279,823；纳入本文以供参考)。
本文用于包含抗-HER2抗体的组合物的术语“混合物”，指存在所需抗-HER2抗体和其一种或多种酸性变体。酸性变体可以包含占多数的脱酰胺基抗-HER2抗体和少量其它酸性变体。已发现例如在获自重组表达的抗-HER2抗体的制备物中，多达约25％的抗-HER2抗体是脱酰胺基化的。
在本发明的优选例中，多肽是重组多肽。“重组多肽”是在宿主细胞中产生的多肽，该宿主细胞已被编码该多肽的核酸转化或转染，或作为同源重组的结果产生多肽。可互换使用“转化”和“转染”，指将核酸引入细胞的过程。在转化或转染后，核酸可以整合到宿主细胞基因组中，或作为染色体外因子存在。“宿主细胞”包含体外细胞培养中的细胞和在宿主动物中的细胞。例如在美国专利5,534,615中描述了重组产生多肽的方法(纳入本文以供参考)。
以最广泛的意义使用术语“抗体”，具体指包括单克隆抗体(含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)，和长度足以展现所需生物学活性的抗体片段。
本文的抗体针对感兴趣的“抗原”。优选的抗原是生物学上重要的多肽，将其抗体施给患病或失常的哺乳动物能在该哺乳动物中得到治疗性效益。然而，也要考虑针对非多肽抗原(例如肿瘤相关糖脂抗原；见美国专利5,091,178)的抗体。当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(如受体)或配体(如生长因子)。示范性抗原包括上文讨论的多肽。本发明包含的抗体的优选分子靶包括CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34等CD多肽；EGF受体、HER2、HER3或HER4受体等HER受体家族的成员；细胞粘着分子如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整联蛋白(包括其a或b亚基)(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11抗体)；VEGF等生长因子；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C等。可将可溶性抗原或其片段，任选的和其它分子偶联，用作诱导抗体的免疫原。对于跨膜蛋白例如受体，受体的片段(例如受体的胞外功能域)可用作免疫原。另外，可将表达跨膜蛋白的细胞用作免疫原。这些细胞可衍生自天然来源(如癌症细胞系)或可以是已用重组技术转化，能表达跨膜蛋白的细胞。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自一群基本同源的抗体，亦即，构成该群体的各个抗体是相同的，除了可能天然存在的少量突变处。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原位点。另外，和通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，各个单克隆抗体针对的是抗原上的一个决定簇。修饰语“单克隆的”表示抗体的特征是获自基本同源的抗体群体，而且不应解释成要求用任何具体方法生产该抗体。例如本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等，自然256495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或通过重组DNA方法(见例如，美国专利号4,816,567)制备。在另一个实施例中，可从用McCafferty等，自然，348552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离得到“单克隆抗体”。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志，222581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离小鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等，生物/技术，10779-783(1992))和作为构建非常大的噬菌体文库策略的组合感染及体内重组(Waterhouse等，核酸研究，212265-2266(1993))生产高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的选择。另外，现在有可能产生能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白，而产生人抗体的所有组分的转基因动物(如小鼠)。例如已描述了在嵌合体和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生被完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中将导致在抗原攻击后产生人抗体。见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno，733(1993)；和Duchosal等，自然，355258(1992)。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合性”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与衍生自某具体动物或属于具体抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一动物或属于另一抗体类或亚类的相应序列相同或同源，只要这些抗体的片段展示出所需生物学活性，它们也包含于其中。(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984)。
本文所用的术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(亦即，轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫学感兴趣的多肽的序列，5thEd，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))的氨基酸和/或“高变环”中的那些残基(亦即，轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物学杂志196901-917(1987))。“构架”或“FR”残基是除了本文定义的高变区残基之外的那些可变区残基。下文实施例中的rhuMAb HER2抗体的CDR和FR残基(humAb4D5-8)由Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)作了鉴定。
非人(如小鼠)抗体的“人源化”形式是含有(衍生自)非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合体抗体。大部分人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者的高变区残基被非人动物(如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类)的、具有所需特异性、亲和性和容量的高变区(供者抗体)的残基所替换。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包含在受者抗体或在供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步精制抗体性能。通常，人源化抗体将基本包含全部的至少一个、通常是两个可变区，其中所有的或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，而所有的或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还可任选的包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。
在制造人源化抗体中所用的人可变区(轻链和重链的)的选择对减少抗原性是非常重要的。根据所谓的“最适”方法，将针对已知的人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变区的序列，然后接受与啮齿类的序列最接近的人序列，作为人源化抗体的人构架(FR)(Sims等，免疫学杂志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物学杂志，196901(1987))。
另一种方法采用衍生自轻链或重链特定亚类的所有人抗体共有序列的特定构架。同样的构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，免疫学杂志，1512623(1993))。
更重要的是，被人源化的抗体应保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。要达到这个目的，根据优选方法，使用亲代和人源化序列的三维模型，通过分析亲代序列和各种概念性人源化产物的过程，来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是一般可得到的，而且对于本领域技术人员是熟悉的。计算机程序也可得到，它描述并显示了所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。对这些演示的检查使得我们能够分析残基在候选免疫球蛋白功能中的可能作用(亦即，对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析)。以此方法，可从受则序列和引入序列中选择FR残基并使它们联合，从而达到所需抗体特征，例如对靶抗原提高的亲和力。通常，CDR残基直接和最实质性的影响到抗原结合。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；二抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。业已开发了不同技术用于抗体片段的生产。传统上，这些片段衍生自对完整抗体的蛋白酶水解消化(见例如，Morimoto等，生物化学和生物物理方法24107-117(1992)和Brennan等，科学22981(1985))。然而，现在能通过重组宿主细胞直接生产这些片段。例如，能从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。另外，能直接从大肠杆菌中回收Fab′-SH片段，并将其化学偶联来形成F(ab′)2片段(Carter等，生物/技术10163-167(1992))。在另一实施例中，用亮氨酸拉链GCN4来启动F(ab′)2分子的装配以形成F(ab′)2片段。根据另一方法，能直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab′)2片段。用于生产抗体片段的其它技术对熟练技术人员是显然明了的。
在其它实施例中，所选的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO 93/16185。“单链Fv”或“sFv″抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中这些功能域存在于一条多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH区和VL区之间的一个多肽接头，它使sFv能形成抗原结合所需的结构。对于sFv的综述，见Pluckthun的单克隆抗体的药物学vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“二抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)。通过使用短至不允许同一链上的两个功能域之间配对的接头，从而迫使此二功能域与另一链的二个互补区配对，形成两个抗原结合位点。二抗体在例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)有更充分的描述。
当在本申请中使用时，词语“线性抗体”指Zapata等在Polypeptide Eng.8(10)1057-1062(1995)中描述的抗体。简单说，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，它形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
“多特异性抗体”具有对至少两个不同表位的结合特异性，其中各表位常常来自不同的抗原。尽管这些分子正常情况下将只结合两个抗原(亦即，双特异性抗体，BsAb)，具有额外特异性的抗体如三特异性抗体也包含在本文所用的该词语的范围内。BsAb的例子包含那些一条臂针对肿瘤细胞抗原而另一条臂针对细胞毒触发分子的抗体(例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗恶性B-细胞(1D10)，抗-CD3/抗p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-肾细胞肿瘤，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗结肠癌)，抗-CD3/抗-促黑素细胞激素类似物，抗-EGF受体/抗-CD3，抗CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗神经细胞粘着分子(NCAM)/抗-CD3，抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛肿瘤相关抗原(AMOC-31)/抗-CD3)；一条臂特异性与肿瘤抗原结合而另一条臂与毒素结合的BsAb(例如抗-皂角苷/抗-Id-I，抗-CD22/抗-皂角苷，抗-CD7/抗皂角苷，抗-CD38/抗-皂角苷，抗-CEA/抗-蓖麻毒蛋白A链，抗-干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型，抗-CEA/抗-长春花生物碱)；用于转换酶活化前体药物的BsAb如抗-CD30/抗-碱性磷酸酶(它催化丝裂霉素磷酸前体药物转化成丝裂霉素醇)；能用作纤溶剂的BsAb，如抗-血纤蛋白/抗-组织纤溶酶原激活剂(tPA)，抗-血纤蛋白/抗-尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)；用于靶向免疫复合物到细胞表面受体的BsAb，例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受体(如FcγRI，或FcγRIII)；用于治疗感染性疾病的BsAb，例如抗-CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)，抗-T-细胞受体CD3复合物/抗-流感，抗-FcγR/抗-HIV；用于体外或体内检测肿瘤的BsAb，例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗-半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb；和作为诊断工具的BsAb，例如抗-兔IgG/抗-铁蛋白，抗-辣根过氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生长素释放抑制因子/抗-底物P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。可以全长抗体或抗体片段(如F(ab′)2双特异性抗体)制备双特异性抗体。
制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。全长双特异性抗体的传统生产是基于两条免疫球蛋白重-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四联瘤(quadroma))可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种有正确的双特异性结构。通常是用多个亲和层析步骤进行该正确分子的纯化，非常麻烦而且产量低。WO 93/08829和Traunecker等，胚胎学杂志，103655-3659(1991)中公开了相似的程序。
根据不同方法，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体—抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选在具有至少一部分铰链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区中。优选使含有轻链结合必须位点的第一重链恒定区存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和如需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入到分开的表达载体中，共转染入合适的宿主生物体中。这对调节实施例中的三个多肽片段的突变性质提供了极大的机动性，即当在构建中使用了不相等的三种多肽链的独特比率时，提供了最适产量。然而，有可能将两个或所有三个台联的编码序列插入到一个表达载体中，当至少两个多肽链的表达比率相等时，或比率无特殊意义时可得到高产量。
在本方法的一个优选例中，双特异性抗体是由一条臂中带有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链，和另一条臂中的杂交免疫球蛋白重链—轻链配对(提供第二结合特异性)构成的。发现这种不对称结构有利于从不要的免疫球蛋白链组合物中分离出所需双特异性化合物，因为在仅一半双特异性分子中免疫球蛋白轻链的存在提供了分离的便捷方法。此方法公开于WO94/04690。产生双特异性抗体的进一步细节，见例如，Suresh等，酶学方法，121210(1986)。
根据WO96/27011中描述的另一个方法，可以工程改造一对抗体分子间的界面而使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比最大化。优选界面包含抗体恒定区CH3区的至少一部分。在该方法中，用具有较大侧链的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链。在第二抗体分子界面上通过用较小侧链的氨基酸(如丙氨酸或苏氨酸)替换大侧链氨基酸来建立与大侧链相同或相似大小的补偿“空穴”。这提供了使异源二聚体的产量增加超过其它不要的终产物如同源二聚体的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”的抗体。例如，异源偶联物中抗体之一可与亲和素偶联，另一个可与生物素偶联。已提议将这些抗体用于例如使免疫系统细胞靶向于不要的细胞(美国专利号4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。可用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的偶联剂是本领域熟知的，而且已在美国专利4,676,980中和多种交联技术一起公开。
从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中有所描述。例如，可用化学键制备双特异性抗体。Brennan等，在科学，22981(1985)中描述了蛋白酶水解切开完整抗体来产生F(ab′)2片段的程序。将这些片段在二硫酚结合剂亚砷酸钠存在下还原，来稳定邻近二硫酚并防止分子间形成二硫键。然后将产生的Fab′片段转变成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，将Fab′-TNB衍生物之一通过用巯基乙胺还原再转变成Fab′-硫，并和等摩尔量的另一个Fab′-TNB衍生物混合来形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
近来的进展已促进了直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，可将该片段化学偶联来形成双特异性抗体。Shalaby等，在实验医学杂志，175217-225(1992)中描述了一种完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。分离出大肠杆菌分泌的各种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联来形成双特异性抗体。
也已经描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的不同技术。例如，已用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostenlny等，免疫学杂志，148(5)1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽和两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合连接。在铰链区还原抗体同源二聚体以形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。该方法还可用来产生抗体同源二聚体。Hollinger等，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中描述的“二抗体”技术已提供了制备双特异性抗体片段的另一种机制。该片段包含通过一个短至不允许同一链上的两个功能域之间配对的接头与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)。因此，这迫使一个片段的VH和VL区和另一个片段的互补VL和VH区配对，从而形成两个抗体结合位点。使用单链Fy(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略也已有报道。见Gruber等，免疫学杂志，1525368(1994)。
也考虑了具有二价以上的抗体。例如可以制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，14760(1991)。
词组“离子交换材料”指带负电(即阳离子交换树脂)或带正电(即阴离子交换树脂)的固相。可以通过在固相上吸附一个或多个带电配体(如通过共价连接)来提供电荷。另外，或此外，电荷可以是固相的固有性质(如以硅为例，它具有全盘负电荷)。
“固相”指一个或多个带电配体能粘附的非水基质。固相可以是纯化柱、一种分散微粒的不连续相、膜或滤膜等。能形成固相的材料的例子包括多糖(如琼脂糖和纤维素)；和硅(如可控孔径玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒和上述任一衍生物等其它机械上稳定的基质。
“阳离子交换树脂”指一种带负电的固相，因其具有自由阳离子，能交换固相上或固相中流过的水溶液中的阳离子。附着在固相上形成阳离子交换树脂的带负电的配体可以是例如羧酸盐或磺酸盐。商业上可购得的阳离子交换树脂包含羧基-甲基-纤维素、BAKERBOND ABXTM、固定在琼脂糖上的硫丙基(SP)(如Pharmacia的SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCETM)和固定在琼脂糖上的磺酰基(如Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)。
本文所用的术语“阴离子交换树脂”指带正电(如具有附着于其上的一个或多个带正电的配体，例如季铵基团)的固相。商业上可购得的阴离子交换树脂包含DEAE-纤维素、QAE SEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM(Pharmacia)。
“缓冲液”是通过其酸-碱偶联组分的作用来抵抗pH变化的溶液。在缓冲液，生物系统中缓冲液的制备和使用指南，Gueffroy，D.Ed.CalbiochemCorporation(1975)中描述了取决于缓冲液所需pH而定的可使用的不同缓冲液。在一个实施例中，缓冲液具有的pH范围从大约5到大约7(如下文实施例1)。将pH控制在该范围内的缓冲液的例子包括MES、MOPS、MOPSO、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵盐缓冲液，以及这些缓冲液的组合。
“加样液”是指用来将含有感兴趣的多肽分子和一种或多种污染物的组合物加到离子交换树脂上的缓冲液。加样缓冲液具有的导电率和/或pH，能使感兴趣的多肽分子(和通常一种或多种污染物)与离子交换树脂结合。
“中间缓冲液”被用来在洗脱感兴趣的多肽前从离子交换树脂上洗脱出一种或多种污染物。中间缓冲液的导电率和/或pH能使污染物从离子交换树脂上被洗脱下来，但不洗脱下显著量的感兴趣的多肽。
本文使用的术语“洗涤缓冲液”指在洗脱感兴趣的多肽分子之前，用来洗涤或重平衡离子交换树脂的缓冲液。方便的，洗涤缓冲液和加样缓冲液可以同一缓冲液，但这不是必须的。
“洗脱缓冲液”用来将感兴趣的多肽从固相上洗脱下来。洗脱缓冲液的导电率和/或pH能使感兴趣的多肽从离子交换树脂上洗脱下来。“再生缓冲液”可以用来再生离子交换树脂，从而使它能被再次使用。再生缓冲液具有所需的能充分将所有污染物和感兴趣的多肽从离子交换树脂上除去的导电率和/或pH。
术语“导电率”指水溶液在两个电极间传导电流的能力。在溶液中，电流是通过离子运输的。因此，当水溶液中离子量增大时，溶液将具有更高的导电率。导电率的度量单位是mmho(mS/cm)，而且能用导电率计测量(由Orion等出售)。溶液的导电率可通过改变其中的离子浓度而变化。例如，可改变溶液中缓冲剂浓度和/或盐(如NaCl或KCl)的浓度，来达到所需导电率。优选的，如下文实施例中，改变各种缓冲液的盐浓度来达到所需导电率。
从含有多肽和一种或多种污染物的组合物中“纯化”多肽，指通过从组合物中(完全或部分的)除去至少一种污染物来提高组合物中多肽的纯度。“纯化步骤”可以是得到“均一”组合物(在本文中“均一”指含感兴趣多肽的重量相对于组合物的总重量至少约70％，优选重量至少约80％的组合物)的总纯化过程中的一部分。
除非另外指出，本文所用的术语“HER2”指人HER2蛋白而“HER2”指人HER2基因。例如在Semba等，PNAS(USA)826497-6501(1985)和Yamamoto等，自然，319230-234(1986)(GeneBank登录号X03363)中描述了人HER2基因和HER2蛋白。
本文所用的术语“humMAb4D5-8”指含有SEQ ID NO1的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO2的重链氨基酸序列或其变体(其保留了结合HER2和抑制过度表达HER2的肿瘤细胞生长的能力)的人源化抗-HER2抗体(见美国专利5,677,171；纳入本文以供参考)。
多肽的“pI”或“等电点”指多肽正电荷与其负电荷平衡的pH。可从多肽氨基酸残基的净电荷来算出pI，或用等电聚焦(如以下实施例中所用的CSx层析)来测定。
将某分子“结合”到离子交换材料上，指在合适的条件下(pH/导电率)使该分子和离子交换材料接触，在该条件下该分子通过分子和离子交换材料上一个或多个带电基团之间的离子相互作用可逆的固定在离子交换材料中或材料上。
“洗涤”离子交换材料，指使合适的缓冲液在离子交换材料中或上通过。
将分子从离子交换材料上“洗脱”下来，指通过改变离子交换材料周围的缓冲液离子强度从离子交换材料上除下该分子，该离子强度能使缓冲液与分子竞争离子交换材料上的带电位点。
“治疗”指治疗性处理和预防性措施。需要治疗的人包含已患疾病和要预防疾病的人。“失常”指任何用如本文所述纯化的多肽治疗将获益的任何状况。这包括具有使哺乳动物易患所讨论疾病的那些病理状态的慢性和急性失常或疾病。
本文所用的词语“标记”指直接或间接偶联于多肽的可检测的化合物或组合物。标记可以是本身可检测的(如放射性同位素标记或荧光标记)或，就酶性标记而言，可以催化可检测到的底物化合物或组合物的化学变化。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞毁坏的物质。该术语包括放射性同位素(如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂和毒素，例如来自细菌、真菌、植物或动物的酶活性毒素或其片段的毒素。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括阿霉素、亚德利亚霉素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、噻替哌、白消安、cytoxin、taxoid，例如paclitaxel(TAXOLTM，Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ)、和doxetaxel、toxotere、氨甲喋呤、顺氯氨铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾、卡铂、鬼臼噻吩苷、道诺霉素、洋红霉素、氨基喋呤、放线菌素D、丝裂霉素、esperamicin(见美国专利号4,675,187)，美法仑和其它相关的芥氮(nitrogen mustard)。该定义中还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的激素制剂，例如它莫西芬和奥那司酮。
实施本发明的模式本发明提供了从含有多肽和一种或多种污染物的组合物(如水溶液)中纯化多肽的方法。该组合物通常是多肽重组生产得到的，但也可以是肽合成(或其它合成方法)生产得到的，或者该多肽可以从该多肽的天然来源纯化得到。该多肽优选是抗体，如结合HER2抗原的抗体。
为了重组生产该多肽，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体中以进一步克隆(DNA扩增)或表达。使用常规程序(例如，当多肽是抗体，使用能与编码该抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)易于分离编码多肽的DNA并对其测序。许多载体是可得到的。载体组分通常包含但不限于，下列的一种或多种信号序列、复制起始点、一个或多个标记基因、增强元件、启动子和转录中止序列(如美国专利5,534,615中描述的，纳入本文以供参考)。
适合于克隆或表达本文载体中DNA的宿主细胞是上述的原核生物、酵母或更高等的真核细胞。适合该目的的原核生物包含真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，如埃希氏菌属(如大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷博氏菌属、变形菌属、沙门氏菌属(如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonnellatyphimurium))、沙雷氏菌(如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescan))、和志贺氏菌属，以及芽胞杆菌如枯草杆菌B.subtilis和地衣芽胞杆菌B.licheniformis(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽胞杆菌41P)、假单胞菌属(如铜绿假单胞菌)、和链霉菌。优选的大肠杆菌宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，虽然其它菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的，这些例子是说明性的，不是限制性的。
除了原核生物，丝状真菌或酵母等真核微生物也是多肽编码载体的合适的克隆和表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母或一般面包酵母是最常用的。然而，一些其它属、种和菌株也是一般可得到的，在本文中可用，例如裂殖酵母(Schizosaccaromycespombe)；克鲁维酵母菌属宿主，如乳酸克鲁维酵母菌K.lactis、脆壁克鲁维酵母菌K.fragilis(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母菌K.bulgaricus(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母菌K.wickeramii(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母菌K.drosophilarum(ATCC36,906)、耐热克鲁维氏酵母菌K.thermotolerans和马克斯酵母菌K.marxianus；yarrowia(EP 402226)；巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris(EP 183070)；念珠菌Candida；木霉Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙脉孢菌Neurospora crassa；许旺酵母Schwanniomyces如许旺酵母Schwannniomyces occidentalis；和丝状真菌如青霉素链孢菌Neurospora Penicillium、Tolypocladium、和曲霉菌Aspergillus宿主如A.nidulans和黑曲霉A.niger。
用于糖基化多肽表达的合适的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包含植物和昆虫细胞。已鉴定了许多杆状病毒株和变体以及对应的来自宿主的得到许可的昆虫细胞，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda(幼虫))、伊蚊埃及伊蚊(Aedes aegypti(蚊))、白纹伊蚊Aedes albopictus(蚊)、果蝇drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕bombyx mori。用于转染的各种病毒株是广泛可得到的，如苜蓿银纹夜蛾Autograoha californica NPV的L-1变种和家蚕NPV的Bm-5病毒株。而且这些病毒可根据本发明作为本文中的病毒使用，具体用于转染草地夜蛾细胞。还能利用棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，兴趣最大在于脊椎动物细胞，而且在培养(组织培养)中增殖脊椎动物细胞已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或用于在悬浮培养液中生长的亚克隆293细胞，Graham等，J.Gen virol3659(1977))；乳仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.reprod.23243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宫癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci，38344-68(1982))；MRC细胞；FS4细胞；和人肝细胞癌系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞来产生多肽，并在常规营养培养基(被修改成适用于诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所需序列的基因)中培养。
用来产生本发明多肽的宿主细胞可在不同培养基中培养。商品上可购得的培养基如Ham′s F10(Sigma)、最低极限必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco′s改进Eagle′s培养基((DMEM)，Sigma)对培养宿主细胞是适合的。此外，在Ham等，酶学方法5844(1979)，Barnes等，生物化学年鉴，102255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基用作培养基，这些培养基之任一种可能必须补充以激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素GENTAMYCINTM药)、痕量元素(定义为通常在最终浓缩物中以微摩尔级存在的无机化合物)和葡萄糖或等价能源。还可包含任何其它本领域技术人员已知的，以合适浓度加入的补充物。培养条件如温度、pH等，是前面用于为表达所选的宿主细胞的那些条件，对本领域一般技术人员将是明显的。
当使用重组技术时，可在细胞内、周质间隙内、产生多肽，或直接分泌到培养基中。如果多肽在细胞内产生，作为第一步，将通过如离心或超过滤除去微粒碎片，宿主细胞或溶解的细胞(如匀浆时产生的)。当多肽分泌到培养基中，通常首先用商业上可购得的蛋白浓缩滤膜如Amicon或MilliporePellicon超过滤单元浓缩这些表达系统的上清液。
然后多肽经过一次或多次纯化步骤，包括本文所要求权利的离子交换层析方法。其它纯化程序的例子可以在离子交换层析步骤之前、之中、或之后进行，包括在疏水反应层析(如苯基琼脂糖)上组分、乙醇沉淀、等电聚焦、反相HPLC，硅层析、HEPARIN SEPHAROSETM层析，进一步阴离子交换层析和/或进一步阳离子交换层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(如用蛋白A、蛋白G、抗体、特异性底物、配体或抗原作为捕获剂)。
如本文权利要求的那样进行离子交换层析。首先决定使用阴离子还是阳离子交换树脂。通常，阳离子交换树脂可用于pI大于7的多肽，而阴离子交换树脂可以用于pI小于7的多肽。
根据已知方法制备阴离子或阳离子交换树脂。通常，在将含有多肽和一种或多种污染物的组合物加到树脂上之前，先使平衡缓冲液通过树脂。方便的，平衡缓冲液和加样液相同，但这不是必需的。
用于层析的不同缓冲液由使用阳离子还是阴离子交换树脂而定。这在图1和2的流程图中有更加清楚的显示。
根据图1(其显示了使用阳离子交换树脂进行的示范性步骤)的具体参照，各缓冲液的pH和/或导电率比前一个缓冲液大，除外的是洗涤缓冲液，其导电率和/或pH比前一个中间缓冲液的导电率和/或pH小。将含有感兴趣的多肽和污染物的水溶液用pH和/或导电率能使该多肽和污染物结合到阳离子交换树脂上的加样缓冲液加到阳离子交换树脂上。如下文实施例中，加样缓冲液可以具有第一低导电率(如从约5.2到约6.6mmhos)。加样缓冲液的示范性pH可以是大约5.0(见图1)。可以将如从大约20mg/ml到约35mg/ml的多肽(如全长抗体)加到离子交换树脂上。
然后用中间缓冲液(其具有第二导电率和/或pH使得基本洗脱污染物，但不洗下实质量的感兴趣多肽)洗涤阳离子交换树脂。这可以通过提高中间缓冲液的导电率或pH或两者达到。加样缓冲液到中间缓冲液的改变按照需要可以是分步或梯度的。在本文实施例中，中间缓冲液具有比加样缓冲液更大的导电率(亦即，中间缓冲液的导电率在约7.3到约8.4mmhos范围内)。另外，如图1所示，在本发明该实施例中使用阳离子交换树脂时，中间缓冲液的pH可以超过加样缓冲液的。例如，中间缓冲液可以具有约5.4的pH。
用中间缓冲液洗涤之后，用导电率或pH或两者比中间缓冲液小的(亦即，导电率或pH或两者的变化和前一步骤相反，即逆向变化，这与文献中的离子交换层析步骤不同。)洗涤缓冲液来洗涤或重新平衡阳离子交换树脂。在下文实施例中，洗涤缓冲液和加样缓冲液具有同样的导电率(亦即，范围在约5.2到约6.6mmhos之间)，因此它的导电率比中间缓冲液的小。在另一个实施例中，只要洗涤缓冲液的导电率比中间缓冲液的小，可以将洗涤缓冲液的导电率降低到比加样缓冲液的导电率小或大。在另一个实施例中，洗涤缓冲液的pH可以比中间缓冲液的pH小(如洗涤缓冲液的pH可以是约5.0)。与中间缓冲液比较，洗涤缓冲液的导电率和/或pH的改变可以通过分步或梯度改变这些参数之一或两者来达到。
前面一段的洗涤步骤之后，将阳离子交换树脂准备好用于从其上面洗脱下所需多肽分子。这采用能使所需多肽不再结合于阳离子交换树脂，从而从树脂上被洗脱下来的pH和/或导电率的洗脱缓冲液来实现。洗脱缓冲液的pH和/或导电率通常比前面步骤中使用的加样缓冲液、中间缓冲液和洗涤缓冲液的pH和/或导电率高。在下文实施例中，洗脱缓冲液的导电率范围是约10.0到约11.0mmhos。另外，或此外，洗脱缓冲液的pH可以比洗涤缓冲液和中间缓冲液的要高(例如，洗脱缓冲液的pH是大约6.0)。导电率和/或pH的改变按照需要可以是分步或梯度的。因此，所需多肽可以在方法的这个阶段从阳离子交换树脂上回收。
在另一个实施例中，离子交换材料包括阴离子交换树脂。本发明的该实施例在本文图2中描述。如该图所示，导电率的改变通常如上述关于阳离子交换树脂的一样。然而，pH改变的方向对于阴离子交换树脂是不同的。例如，如果通过改变pH来达到污染物和多肽的洗脱，则加样缓冲液具有第一pH，而中间缓冲液的pH降低，从而能洗脱出污染物。在第三步中，用洗涤缓冲液洗涤/重平衡柱，而且导电率或pH或两者的变化和前一步中是反向的。因此，洗涤缓冲液pH可以比中间缓冲液大。在该步骤之后，用第四导电率和/或pH的洗脱缓冲液将感兴趣的多肽从阴离子交换树脂上洗脱下来。如果pH改变了，通常它将比加样缓冲液、中间缓冲液和洗涤缓冲液的pH小。渐进的缓冲液pH和/或导电率的改变如上所述，可以是分步或梯度的。
在本发明的优选例中，改变一个参数(即导电率或pH)来达到多肽和污染物的洗脱，而另一个参数(即分别是pH或导电率)保持大致稳定。例如，虽然不同缓冲液(加样缓冲液、中间缓冲液、洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液)的导电率可能不同，但它们的pH基本相同。
在本发明的一个可任选的实施例中，在多肽洗脱后用再生缓冲液再生离子交换树脂，从而使柱能再用。通常，再生缓冲液的导电率和/或pH是能使所有污染物和感兴趣的多肽基本从离子交换树脂上洗脱下来的那些。通常，再生缓冲液具有非常高的导电率来将污染物和多肽从离子交换树脂上洗脱下来。
本文的方法具体用于从至少一种污染物中分离感兴趣的多肽，其中污染物和感兴趣的多肽分子仅在离子电荷上轻微有所不同。例如，多肽和污染物的pI可以仅“轻微不同”，如它们可仅差约0.05到约0.2pI单位。在下文实施例中，该方法可用来从具有8.79pI的单脱酰胺基变体中分离pI为8,87的抗-HER2抗体。另外，该方法可用来例如从未脱酰胺基DNA酶中分离脱酰胺基DNA酶。在另一个实施例中，该方法可用来从某多肽的糖基化变体中分离该多肽，例如和非变体多肽比较，分离具有不同分布唾液酸的某多肽变体。
根据本文的离子交换层析方法获得的多肽制备物如需要，可经过额外的纯化步骤。示范性的进一步纯化步骤在上文已有讨论。
可任选的，按照需要将多肽和一种或多种异源分子偶联。该异源分子可以是比如能提高该多肽血清半衰期的分子(如聚乙二醇，PEG)，或它可以是标记物(如酶、荧光标记物和/或放射性核素)或细胞毒分子(如毒素、化疗药物、放射性同位素等)。
包含多肽、可任选的和异源分子偶联的多肽的治疗配方，可以通过将具有所需纯度的多肽与可任选的药物学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remingtong′s Pharmaceutical Science 16thedition，Osol，A.Ed(1980))混合，以冻干制剂或以水溶液形式来制备。“药物学上可接受的”载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对受体是无毒的，包含如磷酸、柠檬酸和其它有机酸等缓冲液；抗坏血酸和甲硫氨酸等抗氧化剂；防腐剂(如氯化十八烷基甲基苄基铵；氯化己烷双铵；氯化苯甲烃铵；苯索氯铵；酚，丁基或苄基醇；甲基或丙基对羟基苯甲酸酯等烷基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间二苯酚、环己醇；3-戊醇和m-甲酚)；低分子量(小于10个残基)的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；聚乙烯吡咯烷酮等亲水多聚物；甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；EDTA等螯合剂；蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇等糖类；钠等成盐抗衡离子；金属复合物(如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文特别感兴趣的humMAb4D5-8抗体可以制备成冻干制剂，如在WO 97/04801中描述的那样；在此纳入本文以供参考。
本文的配方还可包含一种以上活性化合物，优选的是彼此无不良影响而具有互补功能的那些活性化合物。这样的分子优选以对指定目的有效量联合存在。例如，对于抗-HER2抗体，可将taxoid或它莫西芬等化疗剂加到配方中。
还可将活性成分包裹在胶状药物传递系统(如脂质体白蛋白微球、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳状液中分别通过凝聚技术或通过界面聚合(如羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)制备的微囊中。这些技术在Remingtong′s Pharmaceutical Science 16thedition，Osol，A.Ed(1980)中已公开。
用于体内施药的配制物必须是无菌的。这可容易的通过无菌过滤膜来完成。
可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的合适例子包含含有多肽变体的固态疏水聚合物的半透基块，该基块是异型制品形式，如薄膜或微囊。持续释放基块的例子包含聚酯、水凝胶(如聚(2-羟乙基-异丁酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解乙烯-醋酸乙酯、可降解乳酸-乙二醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(可注射微球，由乳酸-乙二醇酸共聚物和leuprolide乙酸酯构成)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
然后将如本文公开的纯化的多肽或含有多肽和药物学上可接受载体的组合物用于这些多肽和组合物的各种诊断、治疗或其它已知的用途。例如，将该多肽用于治疗哺乳动物的疾病，可通过给予哺乳动物治疗有效剂量的该多肽。
给出下面的实施例用于说明而不是限制。在说明书中所有的引用文献在此纳入本文以供参考。
实施例1在CHO细胞中重组产生含有SEQ ID NO1的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO2的重链氨基酸序列的全长人IgG rhuMAb HER2(humAb4D5-8 Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992))。蛋白产生和分泌到细胞培养培养基后，将CHO细胞通过切向流过滤(PROSTACKTM)从细胞培养基中分离出来。然后将CHO细胞收集的细胞培养液(HCCF)直接加到平衡好的PROSE ATM柱上(Bioprocessing，Ltd)进行蛋白A层析。
蛋白A层析后，用硫丙基(SP)-SEPHAROSE FAST FLOWTM(SPSFF)柱(Pharmacia)进行阳离子交换层析进一步分离所需抗-HER2分子。层析操作以结合和洗脱模式进行。
通过依次用再生缓冲液(0.025M MES/1.0M NaCl，pH5.6)然后用平衡缓冲液(0.025M MES/50mM NaCl，pH5.6)洗涤准备好SPSFF柱用于加样。然后将调节到pH为5.60±0.05和导电率为5.8±0.2的蛋白A合并液上柱。在洗脱前，该柱分三步洗涤(1)最小1个柱体积的加样缓冲液(0.025M MES/50mM NaCl，pH5.6)；(2)中间缓冲液(0.025M MES/70mM NaCl，pH5.6)直到达到280nm峰顶点；和(3)最小为1.2柱体积的洗涤缓冲液(0.025M MES/50mM NaCl，pH5.6)。然后用洗脱缓冲液(0.025M MES/95mM NaCl，pH5.6)将rhuMAb HER2从柱上洗脱出来。洗脱280nm图谱在前导边缘有一个肩部(图3)。在该肩部的拐点，合并开始并继续另5个柱体积。然后用再生缓冲液再生柱(0.025M MES/1.0MNaCl，pH5.6)。
材料和方法柱和加样准备装填一根还原级的SPSFF柱。尺寸是27.0ml体积、1.0cm直径和34.5cm床高。将一等分的蛋白A合并液的pH用1.5M Tris碱滴定到5.6。加入等体积注射用无菌水(SWFI)减小合并液的导电率。
层析该研究的层析用Pharmacia的UNICORNTMHPLC系统进行。以线性流速200cm/h进行平衡、加样和最初洗涤步骤。所有层析步骤以线性流速100cm/h进行。层析步骤的顺序见表1。用加样密度为每毫升SPSFF树脂15、20、25、30、35和40mg rhuMAb HER2进行总共六次层析。
表1-层析步骤1
1.用操作模式进行树脂平衡剩余步骤按照Pharmacia Unicorn Program进行。
2.CV＝柱体积总蛋白通过分光光度扫描各样品测定各层析组分的蛋白浓度(流穿、洗涤步骤、洗脱预合并液、洗脱合并液和再生)。将结果用来计算产物回收量。rhuMAb HER2的消光系数是1.45。用来推算结果的算式(图4)是蛋白质浓度(mg/ml)＝280hm/1.45×稀释系数各组分中的蛋白量(mg)＝蛋白浓度(mg/ml)×组分体积(mL)产量(％)＝组分量(mg)/总量(mg)×100。
rhuMAb HER2抗体变体(CSxHPIEX)的测定rhuMAb HER2 SPSFF层析柱分离抗体变体。通过CSx HPIEX层析测试了所研究的各层析组分中变体抗体的相对量。以1ml/min在55℃进行BAKERBOND WIDEPORETMCSx HPIEX柱(4.6×250mm)。从第三梯度形成流动相(表2)。
表2-梯度流程
跑柱以55℃1ml/min流速。
A缓冲液是0.025M MES，pH5.9；B缓冲液是1M醋酸铵，pH7.0；而C溶液是注射用无菌水。用梯度的初始浓度(49％A；1％B；和50％C)平衡此柱，注入用SWFI稀释并含有＜300微克蛋白的200微升样品。综合得到的各层析图来确定各组分的各峰百分比面积(表3和图5)。
表3-rhuMAb HER2的CSx HPIEX分析
比较层析从Unicorn以ASCII格式输出了各层析文件的吸光度数据(AU280nm)。将0.025M MES/0.07M NaCl，pH5.6洗涤的数据翻译成Excel格式并拷贝到KALEIDAGRAPHTM中，用其将洗涤图展开(图6)并彼此进行比较。
结果和讨论当抗体用重组DNA技术(见图5中的CSx峰a，b和1)制备时，产生了rhuMAb HER2的脱酰胺基变体和其它酸性变体。脱酰胺基和其它酸性变体组成了(用整合曲线下方面积或用CSx层析获得的图谱计算)最初蛋白A层析步骤获得的组合物的大约25％。发现本文所述的离子交换方法能用来充分降低抗-HER2组合物中脱酰胺基变体和其它酸性变体的量，即降到约13％或以下(即经过如本文所述的阳离子交换层析制备物中酸性变体量减少了大约50％或更多)。
如本文上述进行阳离子交换层析得到的吸光度示踪显示于图3。本方法分离出和非脱酰胺基抗-HER2抗体只有轻微不同的抗-HER2抗体的脱酰胺基变体。从最初条件换到中间洗液导电率的增加开始洗脱脱酰胺基抗-HER2抗体。然而，发现在该导电率下继续洗涤会洗脱非脱酰胺基抗-HER2抗体，导致产物损失。观察到直接从中间缓冲液进行到洗脱缓冲液如果合并开始过早会导致从产物中不可接受的除去脱酰胺基抗-HER2抗体太少，或如果将合并延迟至脱酰胺基抗-HER2抗体被还原，会导致不可接受的抗-HER2抗体低产量。发现通过回到最初施用的较低导电率，脱酰胺基抗-HER2抗体的洗脱将继续，但无显著的抗-HER2抗体产物洗脱。
评估了rhuMAb HER2加样对(a)缓冲液的要求，(b)合并液中的产物回收和(c)合并液中的产物质量的效果。
在加样密度为15mg/ml到35mg/ml时，洗脱合并液中的产物量大约是75％。对于加样密度40mg/ml，合并液中的产物量下降到了65％(图4)。合并液中回收降低大部分是因为两个洗涤步骤中抗体损失的增加(分别在70mMNaCl和50mM NaCl)。
如用CSx HPIEX分析测定的(图5)那样，所有洗脱合并液中的rhuMAb HER2的质量是相等的。和加样材料比较；非脱酰胺基抗体(峰3)富集，异-Asp102或Lys450抗体(峰4)量无变化，Asp30脱酰胺基抗体量减少(峰a，b，1和其它)。
这些阳离子合并液中的rhuMAb HER2质量通过中间洗涤步骤得到了提高。由于结合在树脂上的rhuMAb HER2量增加了，达到280nm峰顶点所需的中间缓冲液体积消耗减少了。40mg/ml加样密度所需缓冲液体积是大约2.5柱体积。15mg/ml加样密度所需的缓冲液体积是大约15柱体积。缓冲液需要的准确增加量和这两个极端之间5mg/ml递增的改变不是线性关系。在加样密度为20mg/ml和15mg/ml之间可见最大增加。此时需要从7.5倍柱体积倍增到前面提到的15倍柱体积缓冲液。然而如果达到70mM NaCl洗涤峰顶点，产物质量对任何测定的加样密度来说是相等的。
该研究测定了可将多少rhuMAb HER2加到SPSFF树脂上。在每毫升树脂15到40毫克抗体范围内，在洗脱合并液中回收的rhuMAb HER2质量上没有不同。然而，当用大于35mg/ml加到树脂上时，回收的rhuMAb HER2质量大约下降了10％。为了稳定产量，推荐将35mg/ml设定为rhuMAb HER2制备的最大加样量。另外，由于在20和15mg/ml之间70mM NaCl洗涤体积需要量大为增加；推荐将20mg/ml设定为rhuMAb HER2制备的最小加样量。
权利要求
1.一种从包含多肽和污染物的组合物中纯化该多肽的方法，其特征在于，该方法包括依次进行的下列步骤(a)用加样缓冲液使多肽结合到离子交换材料上，其中加样缓冲液处于第一导电率和pH下；(b)用第二导电率和/或pH的中间缓冲液洗涤离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下污染物；(c)用第三导电率和/或pH的洗涤缓冲液洗涤离子交换材料，其中从中间缓冲液到洗涤缓冲液的导电率和/或pH的变化，和从加样缓冲液到中间缓冲液的导电率和/或pH的变化方向相反；和(d)用第四导电率和/或pH的洗脱缓冲液洗涤离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该离子交换材料是阳离子交换树脂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该离子交换材料是阴离子交换树脂。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述中间缓冲液的导电率和/或pH比加样缓冲液的导电率和/或pH大，而洗涤缓冲液的导电率和/或pH比中间缓冲液的导电率和/或pH小。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，洗涤缓冲液的导电率和/或pH和加样缓冲液的导电率和/或pH大致相同。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，洗涤缓冲液的导电率和/或pH比中间缓冲液的导电率和/或pH大。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述污染物和多肽的洗脱是通过分别改变中间缓冲液和洗脱缓冲液的导电率而实现的。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在(a)-(d)各步骤中，pH保持大致稳定。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽和所述污染物具有略微不同的pI。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述污染物是多肽的脱酰胺基变体。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述中间缓冲液和洗脱缓冲液的导电率是通过改变其中的盐浓度来改变的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述中间缓冲液和洗脱缓冲液的导电率是通过改变其中的NaCl浓度来改变的。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(d)后用再生缓冲液洗涤离子交换材料。
14.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂是固定在琼脂糖上的硫丙基。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽是抗体。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体结合HER2。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中污染物是多肽的脱酰胺基变体。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括将组合物在离子交换层析方法之前、之中或之后经过一次或多次进一步的纯化步骤，来获得该多肽的均一制备物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该方法还包括将纯化多肽和异源分子偶联。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述异源分子是聚乙二醇，标记物或细胞毒制剂。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过将多肽的均一制备物和药物学上可接受的载体混合，从而制备药物组合物。
22.一种根据权利要求1所述的方法纯化的多肽。
23.一种从包含多肽和污染物的组合物中纯化多肽的方法，其特征在于，该方法包括依次进行的下列步骤(a)用加样缓冲液使多肽结合到阳离子交换材料上，其中加样缓冲液处于第一导电率和pH下；(b)用导电率和/或pH比加样缓冲液大的第二导电率和/或pH的中间缓冲液洗涤阳离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下污染物；(c)用导电率和/或pH比中间缓冲液小的第三导电率和/或pH的洗涤缓冲液洗涤离子交换材料，和(d)用导电率和/或pH比中间缓冲液大的第四导电率和/或pH的洗脱缓冲液洗涤离子交换材料，从而从离子交换材料上洗脱下多肽。
24.一种从包含抗体和污染物的组合物中纯化该抗体的方法，其特征在于，该方法包括将组合物加到阳离子交换树脂上，其中加到阳离子交换树脂上的抗体量是每毫升阳离子交换树脂大约20毫克到大约35毫克抗体。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂是固定在琼脂糖上的硫丙基。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将抗体从阳离子交换树脂上洗脱下来。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，该方法还包括在将抗体从阳离子交换树脂上洗脱下来之前，在中间洗涤步骤中将污染物从阳离子交换树脂上洗脱下来的步骤。
28.一种包含抗-HER抗体和一种或多种其酸性变体的组合物，其特征在于，该酸性变体量少于约25％。
29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，该组合物还包含药物学上可接受的载体。
30.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，该抗-HER2抗体是humMAb4D5-8。
全文摘要
描述了一种用离子交换层析纯化多肽的方法，它涉及改变缓冲液的导电率和/或pH来从一种或多种污染物中分离出感兴趣的多肽。
文档编号C07K1/18GK1626548SQ20041006879
公开日2005年6月15日 申请日期1999年5月3日 优先权日1998年5月6日
发明者C·D·贝斯, G·S·布兰克 申请人:基因技术股份有限公司