靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤细胞治疗领域，更具体地，本发明涉及靶向CLD18A2的Τ淋巴细胞 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] Τ淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于Τ淋巴细胞的过继性 免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的 上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[Grupp SA，et al. Adoptive cellular therapy.Curr Top Microbiol Immunol. ,2011 ;344:149_72·]。近年来，根据 CTL 对革巴细 胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体（T Cell Rec印tor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞 相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3 ζ或Fc ε RI γ等胞内信号激活基序融 合成嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR),并将其通过如慢病毒感染等方式 基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物（Major Histocompatibility Complex, MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细 胞并特异性地杀伤肿瘤。CAR T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略 [Schmitz M,et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol, 2010, doi:10. 1155/2010/956304. ]〇
[0003] 嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别 肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪 氨酸活化基序（ITAM)⑶3 ζ或Fc ε RI γ及共刺激信号分子⑶28、⑶27、⑶137、⑶134等的 胞内信号区。
[0004] 胞内信号区仅包含ΙΤΑΜ的为第一代CAR Τ淋巴细胞，其中嵌合抗原受体 各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效 应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et al.Chimeric NKG2D_modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res2007, 67(22):11029-11036.]。
[0005] 随后发展的第二代CAR T淋巴细胞加入了⑶28或⑶137(又名4-1BB)的胞内 信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-⑶28-ITAM或scFv-TM-/ ⑶137-ITAM。胞内信号区发生的B7/⑶28或4-1BBL/⑶137共刺激作用引起T淋巴细胞的持 续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN- γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在 体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011,121 (5):1822-1826. ]〇
[0006] 近些年发展的第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连 接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 或 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了 CAR T 在体 内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C·，et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains. PNAS，2009,106(9):3360 - 3365.]。
[0007] 尽管CAR T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但其较高风险亦需要考 虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR T淋巴 细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳 酸酐酶IX (CAIX)是第一个用于临床的CAR T淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含 CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CAR T淋巴细胞后出现2-4级肝毒性。分析原 因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评 价[Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX:first clinical experience. J clin oncol,2006,24(13):e20-e22. ；Ngo MC. , et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011，R1-R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈 值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化， 导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的"细胞因子风暴"。这种信号外漏（singnal leakage)会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对Her2 的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织 中低表达Her2而引发所谓的"细胞因子风暴"致病人粹死[Morgan RA.，et al.Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy,2010, 18(4) :843-851. ] 〇
[0008] 设计CAR T时，所针对的抗原基因是一种关键性的选择，鉴于体内基因表达的复杂 性以及各种不可控因素，选择到一个合适的用于CAR T的基因是非常困难的。并且，很多肿 瘤特异性的抗原，很难找到针对其的且适合于构建CAR T细胞的特异性分子，在建立CAR T 后，往往无法获得有活性的胞外结合区，这也是发展CAR T技术的难点。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供靶向CLD18A2的T淋巴细胞及其制备方法和应用。
[0010] 在本发明的第一方面，提供表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体（CAR)，所述的 嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包 含特异性识别CLD18A2(claudinl8. 2)的蛋白。
[0011] 在一个优选例中，所述的特异性识别CLD18A2的蛋白是抗体或配体；较佳地，所述 的抗体是单链抗体或结构域抗体。
[0012] 在另一优选例中，所述的跨膜区是包含⑶8或⑶28的跨膜区和铰链区的序列。
[0013] 在另一优选例中，所述的胞内信号区选自：⑶3 ζ，Fc ε RI Y，⑶27,⑶28,⑶137， ⑶134的胞内信号区序列，或其组合。
[0014] 在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的胞外结合区，跨膜 区和胞内信号区：
[0015] 特异性识别CLD18A2的单链抗体、⑶8和⑶3 ζ ;
[0016] 特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD8、CD137和CD3 ζ ;
[0017] 特异性识别CLD18A2的单链抗体、⑶28分子的跨膜区（⑶28a)、⑶28分子的胞内 信号区（⑶28b)和⑶3 ζ ;或
[0018] 特异性识别CLD18A2的单链抗体、⑶28分子的跨膜区、⑶28分子的胞内信号区、 CD137 和 CD3 ζ。
[0019] 在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID Ν0:19~22任一所述的氨基 酸序列。
[0020] 在本发明的另一方面，提供编码所述的嵌合抗原受体的核酸。
[0021] 在一个优选例中，所述的核酸具有SEQ ID N0:15~18任一所述的核苷酸序列。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含所述的核酸。
[0023] 在一个优选例中，所述的表达载体来源于慢病毒质粒pWPT (或pWPT-eGFP)。
[0024] 在本发明的另一方面，提供一种病毒，所述的病毒（如慢病毒）包含所述载体。
[0025] 在本发明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受体、或所述的核酸、或所述的表达载 体、或所述的病毒的用途，用于制备靶向CLD18A2的基因修饰的T淋巴细胞。
[0026] 在本发明的另一方面，提供一种基因修饰的T淋巴细胞，其转导有所述的核酸，或 所述的表达载体或所述的病毒。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗 原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQ ID N0:19-22任一所述的氨基酸序列。
[0028] 在本发明的另一方面，提供所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制 肿瘤的药物，所述的肿瘤是CLD18A2阳性（高表达）的肿瘤。
[0029] 在另一优选例中，所述的CLD18A2阳性的肿瘤包括：胰腺