V)的核糖体跳跃序列（ribosomal skipping sequence2A)(简称F2A)实现eGFP与CAR的共表达的。
[0061] 本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病 毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其 他可用于将外源基因转导入T淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
[0062] 在本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重组载体 (即含有scFv(CLD18A2)-CAR)的慢病毒。
[0063] 本发明还提供了基因修饰的T淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有 本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核 酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法 包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的Nucleofector核转染仪能够直接 将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子（Sleeping Beauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提 高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，et al. Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res， 2010, 70 (10) : 0F1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。 在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转导方法是基于 病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达， 且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因 T淋巴细胞表 面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外 细胞毒实验证明，本发明的抗CLD18A2嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞具有高度特异 性的肿瘤细胞杀伤效果（亦称细胞毒性）。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包 含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因 T淋巴细胞 可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
[0064] 在一个实施方案中，本发明的基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原 受体，所述嵌合抗原受体由SEQ ID Ν0:15-18之一的核酸编码表达。在另一个实施方案中， 本发明的转基因 T淋巴细胞表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列 选自 SEQ ID N0:19-22 之一。
[0065] 鉴于目前尚没有关于靶向CLD18A2的CAR T的报道，本发明人首次从诸多肿瘤 相关基因中成功地找到了一种适用于CAR T细胞的靶基因 CLD18A2,并成功制备了靶向 CLD18A2的CAR T细胞，从而为胰腺癌，胃癌等肿瘤提供一种全新的治疗手段。
[0066] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0067] 实施例1、抗CLD18A2的单链抗体的表达
[0068] 本发明人经过反复地研究分析，鉴定出几个识别CLD18A2的scfv抗体，简称为 125、163 和 175。
[0069] 通过基于PCR搭桥的基因合成技术，合成125(SEQ ID N0:1(核苷酸），2(氨基 酸））、163(SEQ ID N0:3(核苷酸），4(氨基酸））、175(SEQ ID N0:5(核苷酸），6(氨基 酸））单链抗体序列，通过Nhel/BamHl (购自NEB)双酶切，以T4DNA连接酶（购自NEB)于 同样以Nhel/BamHl双酶切载体质粒pCMV-V5-Fc (该载体在多克隆位点下游融合表达人抗 体Fc片段，以下简称V5-Fc，购自上海锐劲生物）连接并转化于宿主菌T0P10中，挑取克 隆通过PCR鉴定阳性克隆并通过测序确认，分别获得V5-scFv-125-Fc、V5-scFv-163-Fc、 V5-scFv_175_Fc真核表达质粒。
[0070] 将上述表达质粒分别转染生长良好的HEK-293F细胞，37°C，5% C02,125rpm摇床 连续培养7天，4000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清，并用0. 45 μ m滤膜过滤，将处理 好的样品以protein A(购自GE)亲和柱进行亲和纯化，最终获得纯化的单链抗体-Fc融 合蛋白 scFv-125-Fc (简称 scFv-125)、scFv-163-Fc (简称 scFv-163)、scFv-175-Fc (简称 scFv-175)，鉴定结果如图3。
[0071] 实施例2、CLD18A1或CLD18A2的稳定表达细胞系的构建
[0072] 1. CLD18A1和CLD18A2的表达载体的构建及慢病毒的制备
[0073] 通过基于PCR搭桥的基因合成技术全系列合成CLD18A1完整编码序列（GenBank : NM_016369)和 CLD18A1 完整编码序列（GenBank :NM_001002026)，在编码的 c 端插入 Flag 标签（DYKDDDK)，并在合成基因片段的两端分别带上Mlul/Sall (购自NEB)酶切位点，通过 Mlul/Sall双酶切，以T4DNA连接同样经Mlul/Sall双酶切的载体质粒pWPT (购自addgene 公司），转化于宿主菌T0P10中，挑取克隆PCR鉴定并测序确认获得正确的慢病毒载体质 粒PWPT-CLD18A1、PWPT-CLD18A2。将上述质粒分别与包装辅助质粒（pGag-pol、pREV、 pVsv_g(均购自addgene公司）按一定比例共转染至293T细胞，分别于转染48h及72h后 收集CLD18A1、CLD18A2病毒液，分装，-80°C保存。
[0074] 2. CLD18A1，CLD18A2外源表达稳定系的建立及及Western blot检测
[0075] 将上述收集的CLD18A1或CLD18A2病毒液分别加至铺于6cm平板内的293T细胞 中，72h后收集细胞，使用细胞裂解液进行裂解。另外，使用CLD18A2病毒液分别感染人的 胃癌BGC-823(购自中国科学院上海细胞库，TCHull)和NCI-N87(购自ATCC，CRL-5822) 细胞系，细胞长满后收集细胞使用细胞裂解液进行裂解。将裂解收集的细胞蛋白取40 μ g 进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后对凝胶进行免疫印迹，并用小鼠抗Flag抗体（购自Sigma Aldrich)染色。PBS洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体（购自Santa Cluz) 孵育后使用ECL试剂显色，最后进行显影。
[0076] Western blot 结果显示，在转染了 CLD18A1 或 CLD18A2 的 293T 细胞（即 293T-CLD18A1，293T-CLD18A2)以及转染 CLD18A2 的 BGC-823 和 NCI-N87 细胞（即 BGC-823-CLD18A2, NCI-N87-CLD18A2)中可检测到分子量大小约28KD的条带，而在未转染 的空细胞中未检测到相应条带（图4)，说明外源表达CLD18A1，CLD18A2的细胞系构建成功。 [0077] 3.流式分析各个细胞系与抗CLD18A2抗体的结合情况实验步骤
[0078] 通过荧光激活细胞分选仪（FACS) (BD公司，FACSCal ibur)分析单链抗体 scFv-125, scFv-163和scFv-175各自与下列各细胞系的结合能力。
[0079] 具体方法如下：
[0080] 1).取对数生长期的 293T，293T-CLD18A1，293T-CLD18A2, BGC-823， BGC-823-CLD18A2, NCI-N87, NCI-N87-CLD18A2肿瘤细胞接种到6cm平皿中，接种细胞密度 约为90 %，37 °C孵箱过夜培养。
[0081] 2).使用10mM的EDTA消化细胞，200gX5min离心收集细胞。以1X106~1X10 7/ mL的浓度重悬于1%含小牛血清的磷酸盐缓冲液（NBS PBS)中，按100ul/管的量加入流式 专用管中。
[0082] 3) · 200gX 5min 离心，弃上清。
[0083] 4).分别加入待测抗体scFv-125, scFv-163和scFv-175,同时以无关抗体作为阴 性对照，抗体终浓度为20 μ g/ml，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
[0084] 5) ·每管加入 2mll % NBS PBS，以 200gX 5min 离心，共二遍。
[0085] 6) ·弃上清，加入1:50稀释的FITC荧光标记的羊抗人抗体（来自上海康成生物工 程有限公司），每管加入l〇〇ul。冰浴，45分钟。
[0086] 7).每管加入 2mll% NBS PBS，以 200gX5min 离心，共二遍。
[0087] 8).弃上清，重悬于300ull% NBS PBS中，流式细胞仪检测。
[0088] 9).应用流式细胞仪数据分析软件WinMDI2. 9分析数据。
[0089] 流式细胞分析结果表明，单链抗体scFv-125不仅能与CLD18A1，也能与CLD18A2稳 定表达的293T细胞结合（图5)，表明该单链抗体缺乏对于CLD18A2的结合特异性。幸运 地，单链抗体ScFv-163和scFv-175可以特异识别CLD8A2稳定表达的293T，而不与稳定表 达CLD18A1的293T细胞结合，表明这两个单链抗体可以特异识别CLD18A2。此外，这两个 单链抗体也可以特异识别稳定转染CLD18A2的BGC-823或NCI-N87细胞系，但不与未转染 CLD18A2