柱洗脱的期望蛋白质部分约45-60分钟以使病毒失活，在这之后将蛋白质溶液通过0.22 μ m的过滤器。
[0109]步骤4:中和和再调节
[0110]低pH处理之后，以受控方式利用添加碱性溶液进行中和步骤。使用30kDa MWC0膜过滤器通过UF/DF调整pH和电导系数而再调节蛋白质溶液，从而与接下来的柱平衡条件相匹配。对于电导系数的调整，添加浓硫酸铵溶液至蛋白质溶液。在再调节之后，将蛋白溶液通过0.22 μ m的膜过滤器并加载在疏水相互作用柱上。
[0111]步骤5:疏水相互作用柱层析
[0112]在再调节之后，为了进一步纯化，以结合-洗脱模式将含有阿达木单抗的蛋白质溶液通过疏水相互作用层析基质苯基琼脂糖凝胶。利用具有大于90mS/cm的电导系数的pH约6.5至pH 7.0的合适缓冲液平衡柱。在结合至柱基质之后，如图3所示，利用降低的盐梯度在相同的缓冲液中从柱中洗脱阿达木单抗。如通过在图4中示出的ΗΡ-SEC所评估的，在此柱步骤之后，实现了阿达木单抗大于99 %的纯度。
[0113]步骤6:超滤-渗滤(UF/DF)
[0114]为了匹配下一个柱(Q柱)步骤的平衡缓冲液条件(例如pH和电导系数)，针对pH 6.5的低离子强度柠檬酸Na缓冲液溶液，使用30kDa MWC0膜过滤器，基本上通过UF/DF再调节疏水柱洗脱的汇集部分。将渗滤的蛋白质溶液通过0.22 μ m过滤器并加载至Q-柱上。
[0115]步骤7:阴离子交换柱层析
[0116]如在图5中所示的，在低于10mS/cm的电导系数，利用pH 6.5的合适的缓冲液将含有期望单克隆抗体的经渗滤的蛋白质溶液以流动-通过-和-冲洗的模式通过Q-琼脂糖凝胶柱。在Q-柱步骤之后，正如通过在图6中示出的ΗΡ-SEC所评估的，观察到阿达木单抗的纯度是>99%。
[0117]步骤8:纳滤
[0118]在Q-柱步骤之后，含有期望单克隆抗体的蛋白质溶液经受纳滤步骤。在纳滤之后，观察到阿达木单抗的纯度保持为大于99%。
[0119]步骤9:超滤-渗滤
[0120]在纳滤之后，为了制备本体(块状，bulk)药物物质，利用期望的媒介渗滤蛋白质溶液。
[0121]步骤10:微滤
[0122]最后，将含有期望单克隆抗体的纯化制剂无菌地通过0.22 μπι的膜滤器，并且以液体形式，在冰冷条件下或在冻结条件下储存。在最终制剂中的蛋白质浓度可以从lmg/mL改变至60mg/mL。正如通过在图7中示出的ΗΡ-SEC所评估的，最终的纯化单克隆抗体阿达木单抗示出大于99 %的纯度。
[0123]实施例2:纯化利妥昔单抗(抗⑶20抗体)
[0124]以在实施例1中描述的方式进行抗⑶20抗体利妥昔单抗的纯化工艺。正如通过在图8中示出的ΗΡ-SEC所评估的，最终的纯化单克隆抗体示出大于99%的纯度。
[0125]实施例3:纯化曲妥单抗(抗HER2抗体)
[0126]以在实施例1中描述的方式进行抗HER2抗体曲妥单抗的纯化工艺。正如通过在图9中示出的ΗΡ-SEC所评估的，最终的纯化单克隆抗体示出大于99%的纯度。
[0127]纯化的制剂随后可以适当地配制为用于人类应用的药用物质。
【主权项】
1.一种用于从细胞培养物中纯化单克隆抗体的方法，包括以下顺次的步骤: (a)亲合层析， (b)疏水相互作用层析，可选的随后的其它合适的纯化步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中亲和层析基质选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。3.根据权利要求1所述的方法，其中亲和层析基质是蛋白A。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括:在用于结合的合适pH和/或电导系数，将含有期望抗体的粗制混合物加载至柱，随后在所述期望抗体以单峰形式洗脱之前进行柱冲洗。5.根据权利要求4所述的方法，其中柱冲洗包括: (i)在合适的pH和/或电导率利用平衡缓冲液的第一冲洗， (?)在与所述第一冲洗缓冲液相同的pH和/或比所述第一冲洗缓冲液更高的电导率的第二冲洗， (iii)在低于所述第二冲洗缓冲液的pH和/或电导率的第三冲洗， (iv)在比所述第三冲洗缓冲液更低的pH和/或更高的电导率的抗体洗脱。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述柱冲洗包括: (i)在约pH7.4和/或在lmS/cm至30mS/cm范围内的电导率利用平衡缓冲液的第一冲洗， (ii)在约pH7.4和/或大于30mS/cm的电导率的第二冲洗， (iii)在pH5至pH 6.5范围内的pH和/或在lmS/cm至5mS/cm范围内的电导率的第三冲洗， (iv)在约pH3.5和/或高于5mS/cm的电导率的抗体洗脱。7.根据权利要求5所述的方法，其中缓冲液组分选自Tris、醋酸盐和柠檬酸盐缓冲液。8.根据权利要求5所述的方法，其中在范围从约pH3.5至pH 4、优选3.5至3.7的pH进行抗体洗脱。9.根据权利要求5所述的方法，其中在所述缓冲液中利用添加剂进行洗脱，所述添加剂如氯化钠、精氨酸、甘氨酸，优选氯化钠。10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之后的抗体制剂中聚集体的量不大于5 %，优选不大于2 %。11.根据权利要求1所述的方法，其中在pH5至pH 7范围内的pH和/或大于100mS/cm的电导率进行步骤(b)。12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中利用梯度降低的盐浓度从柱中洗脱抗体。13.根据权利要求12所述的方法，其中盐选自硫酸铵、氯化钠、氯化铵和硫酸钠，优选硫酸铵。14.根据权利要求1所述的方法，其中疏水柱基质选自苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶，优选苯基琼脂糖凝胶。15.一种用于从细胞培养物中纯化单克隆抗体的方法，包括以下步骤: (a)蛋白A亲和层析 (b)疏水相互作用层析 (c)离子交换层析 其中步骤(b)和步骤(C)可以以任何顺序进行。16.根据权利要求15所述的方法，其中根据权利要求2-10所述进行步骤(a)。17.根据权利要求15所述的方法，其中根据权利要求11-13所述进行步骤(b)。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述离子交换层析选自阳离子交换层析和阴离子交换层析。19.根据权利要求18所述的方法，其中离子交换层析是阴离子交换层析。20.根据权利要求15所述的方法，其中用于阴离子交换层析的柱基质选自DEAE琼脂糖凝胶、Mono Q和Q琼脂糖凝胶XL。21.根据权利要求20所述的方法，其中柱基质是Q琼脂糖凝胶。22.根据权利要求15所述的方法，其中以流动-通过-和-冲洗模式或结合-洗脱模式进行在步骤(c)的抗体洗脱。23.一种用于从细胞培养物中纯化单克隆抗体的方法，包括: a)细胞分离 b)蛋白A层析 c)低pH温育 d)中和和再调节 e)疏水相互作用层析 f)超滤-渗滤 g)阴离子交换层析 h)纳滤 i)超滤-渗滤 j)微滤 其中步骤(e)至(j)可以以任何顺序进行。24.根据权利要求23所述的方法，其中根据权利要求2-9所述进行步骤(a)。25.根据权利要求23所述的方法，其中根据权利要求10-12所述进行步骤(b)。26.根据权利要求23所述的方法，其中渗滤介质选自磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和它们的组合。27.根据权利要求1-26所述的方法，其中利用选自以下的缓冲液组分从柱中回收抗体:柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐，优选柠檬酸盐。28.根据权利要求1-26所述的方法，其中利用选自以下的添加剂从柱中回收抗体:氯化钠、精氨酸、甘氨酸，优选氯化钠。29.根据权利要求1-28所述的方法，其中在pH5至pH 7范围内的pH、优选在pH 6.5进行抗体洗脱。30.根据权利要求1-29所述的方法，其中抗体的总回收率在不小于50%的初始量范围内，优选地在不小于70 %的初始量范围内，更优选地在85 %至90 %的初始量范围内。31.根据权利要求1-30所述的方法，其中纯化抗体制剂含有不大于1%的聚集体。32.根据权利要求1-31所述的方法，其中抗体选自抗HER抗体、抗TNF抗体、抗VEGF抗体、抗⑶20抗体、抗⑶52抗体、抗RANKL、抗IgE抗体。33.根据权利要求1-32所述的方法，其中抗体选自曲妥单抗、帕妥珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、贝伐单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、贝妥莫单抗、依帕珠单抗。34.根据权利要求1-33所述的方法，其中抗体是阿达木单抗、曲妥单抗和利妥昔单抗。
【专利摘要】本发明提供了一种从细胞培养物中纯化单克隆抗体的改善方法。期望单克隆抗体的纯化方法包括亲合层析、疏水相互作用层析和可选的离子交换柱层析。其提供大于99％纯度的期望单克隆抗体。
【IPC分类】C07K1/36, C07K16/00
【公开号】CN105263947
【申请号】CN201480031532
【发明人】桑吉乌·库马尔·门迪拉塔, 桑贾伊·班迪奥帕迪亚伊, 阿万尼什·库马尔·辛格
【申请人】卡迪拉保健有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年6月25日
【公告号】CA2911874A1, EP3013849A1, US20160115195, WO2014207763A1