第三冲洗更低的pH和/或更高的电导率下抗体的洗脱。
[0046]在优选的实施方式中，根据本发明的柱冲洗步骤包括:⑴在约pH 7.4和/或在约20mS/cm，优选地在lmS/cm至30mS/cm范围内的电导率下利用平衡缓冲液的第一冲洗，
(ii)在约pH 7.4和/或大于20mS/cm的电导率下的第二冲洗，(iii)在比pH 7.4更低，优选地在pH 5至pH 6.5范围内的pH和/或小于20mS/cm，优选地在lmS/cm至5mS/cm范围内的电导率下的第三冲洗，(iv)在约pH 3.5和/或高于5mS/cm的电导率下抗体的洗脱。
[0047]在一种实施方式中，用于蛋白A层析纯化步骤的缓冲液组分选自Tris、醋酸盐和柠檬酸盐缓冲液。
[0048]在优选的实施方式中，在范围从约pH 3.5至4，优选地3.5至3.7的pH进行根据本发明的抗体洗脱。
[0049]在一种实施方式中，根据本发明的方法包括选自氯化钠、精氨酸、甘氨酸的添加剂/盐，优选氯化钠。
[0050]本发明还证实了通过蛋白A柱层析去除大部分宿主细胞污染蛋白质，同时在盐存在下在低缓冲液pH条件下以最大回收率将感兴趣的蛋白质洗脱出柱。
[0051]在一种实施方式中，本发明还证实了在从蛋白A柱洗脱之后期望的单克隆抗体的分子完整性，在酸性pH值条件下保持不变至少约1小时，如同通过分析ΗΡ-SEC评估的。
[0052]在另一种实施方式中，本发明提供了以结合-洗脱模式使用疏水相互作用柱层析从期望的蛋白质部分中去除残留的工艺-相关的和产物-相关的杂质。利用梯度降低的盐浓度进行主峰形式的期望蛋白质的洗脱。
[0053]在其它实施方式中，用于疏水相互作用层析的柱基质选自苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶，优选苯基琼脂糖凝胶。
[0054]在此外的实施方式中，在疏水相互作用层析步骤用于洗脱期望蛋白质的盐选自硫酸铵、氯化钠、氯化铵和硫酸钠，优选硫酸铵。
[0055]在另一种实施方式中，在pH 5至pH 7范围内的pH和/或大于100mS/cm的电导率下进行疏水相互作用层析。
[0056]在一种实施方式中，根据本发明的离子交换层析选自阳离子交换层析和阴离子交换层析，优选阴离子交换层析。
[0057]在另一种实施方式中，用于阴离子交换层析步骤的柱基质选自DEAE琼脂糖凝胶、Mono Q和Q琼脂糖凝胶XL，优选Q琼脂糖凝胶。
[0058]在一种实施方式中，本发明也示出了以通过阴离子交换柱层析的流动-通过-和-冲洗模式或通过阳离子交换层析的结合-洗脱模式纯化期望的单克隆抗体。
[0059]在优选的实施方式中，源自细胞培养物的期望单克隆抗体的纯化以如下方式进行:
[0060]1.蛋白A层析
[0061]2.疏水相互作用层析
[0062]3.阴离子交换层析
[0063]在蛋白A柱层析步骤之后，可以以任何次序进行疏水和阴离子交换层析步骤。
[0064]在优选的实施方式中，源自细胞培养物的期望单克隆抗体的纯化如下进行-
[0065]1.蛋白A层析
[0066]2.低 pH 温育
[0067]3.中和和再调节
[0068]4.疏水相互作用层析
[0069]5.超滤-渗滤
[0070]6.阴离子交换层析
[0071]7.纳滤
[0072]8.超滤-渗滤
[0073]其中，在蛋白A层析步骤之后，可以以任何次序进行疏水层析、超滤-渗滤和阴离子交换层析步骤。
[0074]在进一步的实施方式中，渗滤介质选自水、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和它们的组合。
[0075]在一种实施方式中，根据本发明，利用选自氯化钠、精氨酸、甘氨酸，优选氯化钠的添加剂/盐进行从柱中回收抗体。
[0076]在一种实施方式中，根据本发明的抗体的总回收率在不小于50%的初始量范围内，优选在不小于70%的初始量范围内，更优选在85%至90%的初始量范围内。
[0077]在优选的实施方式中，抗体选自抗HER抗体、抗TNF抗体、抗VEGF抗体、抗CD20抗体、抗⑶52抗体、抗RANKL、抗IgE抗体等。
[0078]在更优选的实施方案中，抗体选自曲妥单抗、帕妥珠单抗、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗、贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranizumab)、利妥昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)等。
[0079]在其它实施方式中，本发明在蛋白A亲和层析步骤之后提供了具有不大于5%，优选不大于2%的聚集体的量的纯化抗体制剂。
[0080]在另一种实施方式中，本发明提供了具有不大于1%，更优选不大于0.5%的聚集体的量的抗体制剂。
[0081 ] 期望单克隆抗体的纯化工艺包括以下步骤一
[0082]-通过离心过滤和深层过滤随后再调节进行细胞分离和净化培养物上清液
[0083]-蛋白A柱层析
[0084]-低pH温育
[0085]-中和和再调节
[0086]-疏水相互作用柱层析
[0087]-超滤-渗滤
[0088]-阴离子交换柱层析
[0089]-纳滤
[0090]-超滤-渗滤
[0091]-微滤
[0092]根据本发明的纯化步骤在下面进一步详细描述:
[0093]I)蛋白A柱层析:
[0094]在接近于中性的pH，将含有期望单克隆抗体和其它污染物的源自细胞培养物的澄清上清液加载至利用合适的缓冲液平衡的蛋白A柱上。期望的单克隆抗体结合至亲和基质，而大多数污染物以流动-通过离开柱。在洗脱期望的蛋白质之前，利用多个冲洗步骤冲洗柱。在利用相同的平衡缓冲液完成柱加载之后，进行第一冲洗。利用具有比第一冲洗缓冲液更高的电导率和相同的pH的缓冲液进行第二冲洗。在与第一和第二冲洗步骤不同的pH和电导率缓冲液下进行第二冲洗。在比第二冲洗步骤更低的pH，但是更尚的电导率下进行期望蛋白质的洗脱。最后，利用碱性溶液进行柱清洗。
[0095]II)疏水相互作用柱层析:
[0096]以结合-洗脱模式，通过疏水相互作用柱层析进行从含有至少一种不期望的污染物的混合物中纯化期望的单克隆抗体蛋白质。在完成蛋白质-加载至柱上之后，利用梯度降低的盐浓度，即利用与平衡缓冲液电导率相比降低的电导率，从柱中洗脱期望的单克隆抗体。期望单克隆抗体蛋白的洗脱以单一宽峰的形式产生。以部分收集洗脱的蛋白质并且将含有期望纯度水平的部分汇集(pool)在一起。
[0097]III)阴离子交换柱层析:
[0098]再调节含有期望单克隆抗体的蛋白质溶液以基本上与阴离子交换柱平衡条件的pH和电导率相匹配。利用pH约6.5的缓冲液平衡柱。在流动-通过-和-冲洗部分中，从柱中回收期望的蛋白质。为了进行根据本发明的阴离子交换层析，也可以使用的其它阳离子交换剂选自DEAE琼脂糖凝胶、Mono Q、Q琼脂糖凝胶XL等。阴离子交换剂Q琼脂糖凝胶已在本发明中使用。
[0099]分析技术:在300mM NaCl存在下，通过使用利用pH 6.8的磷酸钠缓冲液平衡的TSK-3000柱，进行分析体积排阻层析(ΗΡ-SEC)。以0.5mL/min的等度-模式(isocratic-mode)洗脱蛋白质。
[0100]实施例
[0101]在这里，利用以下非限制性实施例示出了本发明，这些非限制性实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围:
[0102]实施例1:纯化阿达木单抗(抗TNF α抗体)
[0103]步骤1:细胞分离/净化/再调节
[0104]在批次收获后，为了获得含有感兴趣的蛋白质连同其它可溶污染物的澄清上清液，首先通过离心过滤接着深层过滤，从培养物肉汤中分离细胞。以10，000gX 30分钟进行离心过滤。通过使用0.45 — 0.22 μ m膜进行深层过滤。再调节净化上清液的pH和电导率从而配合蛋白A柱平衡缓冲液条件。
[0105]步骤2:蛋白A柱层析
[0106]通过亲和基质接着在低pH从柱中洗脱阿达木单抗，将再调节后的净化上清液通过蛋白A亲合柱从而捕获阿达木单抗。在加载之前，在10-25mS/cm范围内的电导系数下，利用pH 7.4的合适缓冲液平衡柱。在加载之后，利用相同的缓冲液(第一冲洗)冲洗柱。第一冲洗步骤之后，利用pH 7.4的相同缓冲液但是在更高的电导系数(>25mS/cm)冲洗柱。利用具有在l-5mS/cm范围内的电导系数的pH 5.5的合适缓冲液进行第三冲洗步骤。在第三冲洗步骤之后，期望蛋白质阿达木单抗的洗脱如在图1中所示的，在大于5mS/cm的电导系数利用pH 3.5-3.7的合适缓冲液进行。当通过在图2中示出的分析ΗΡ-SEC分析时，在此步骤之后洗脱的阿达木单抗示出了至少98 %的纯度。
[0107]步骤3:低pH温育
[0108]在室温条件下，在相同的洗脱pH条件下温育蛋白A