专利名称：一种提取螺旋藻小分子肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种提取螺旋藻小分子肽的方法。
背景技术：
螺旋藻是存在于地球已逾30亿年的低等浮游原核植物，其外观为蓝绿色，显微镜观察呈螺旋状，故而得其名。螺旋藻是一种碱性的营养食品，可以使人体的酸性体质变为健康的弱碱性体质，更重要的是螺旋藻含有十分丰富的各种人体必需的营养成分，而且组成比较均衡。其中蛋白质的含量是目前所知所有天然植物中最高的，约占干重的60% 70%。在非洲的乍得湖和墨西哥的Texcoco湖畔，当地居民用螺旋藻作为食物来源已有几百年的历史。作为人类和动物的一种极好的营养补充物，螺旋藻被联合国粮农组织推荐为“21世纪人类最理想的保健食品”。
近些年来，随着科学技术的发展，人们生活水平的不断提高，天然活性物质与功能肽成为当前研究的热点，如抑菌肽、抗氧化肽、降压肽等在医药保健、食品加工和化妆品领域具有广泛的应用空间，然而，一般多肽的提取技术路线为①首先将含有蛋白质的材料进行预处理如溶解，超声波处理、反复冻融等；②将其上清液进行酶解或双酶解等透析除去盐分超滤法；⑤凝胶层析高效液相色谱法和电泳法等，才可获得需要的肽段。据报道天然活性肽分子量大多为5000D以下，要想获得这样的小分子多肽必须进行上述步骤的研究和分析。这些工作技术要求高，仪器设备要求复杂，需要时间长，就是熟练的技术人员也需要几天或几周的时间，不太熟悉的技术人员要完成小分子多肽的提取就需要更长的时间。更为重要的是活细胞的多肽经过这样漫长的提取、分离纯化过程，已部分地失去了原有的活性，造成事倍功半。因此迫切需要一种简便快速的提取螺旋藻小分子肽的方法，以缩短提取小分子肽的时间，避免分离的肽失去活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取螺旋藻小分子肽的方法，以克服上述不足。本发明提供一种提取螺旋藻小分子肽的方法，包括以下步骤I)螺旋藻溶于蒸馏水中配制螺旋藻溶液；2)搅拌、离心，取上清液；3)将上清液加入泡沫分离柱中进行泡沫分离；4)收集泡沫得到螺旋藻小分子肽溶液。所述步骤I)是将螺旋藻溶于蒸馏水中，配制料液比为O. 5-8g/L。其中，步骤I)所述的螺旋藻优选为螺旋藻粉。进一步地，所述步骤I)配成螺旋藻溶液的料液比为f 2g/L。优选地，所述步骤I)配成螺旋藻溶液的料液比为lg/L。其中，所述步骤I)溶液的pH值为5-10。优选地，所述步骤I)溶液的pH值为9。
其中，所述步骤2)搅拌条件为600r/min，时间为O. 5 lh。其中，所述步骤2)离心条件为4000-8000r/min，时间为15 30min。其中，所述步骤3)所述泡沫分离柱气流速度为I. 5^3. 5L/min。本发明提供了上述方法提取得到的螺旋藻小分子肽。本发明提供了上述方法提取得到的螺旋藻小分子肽的抗氧化用途。本发明提供了上述方法提取得到的螺旋藻小分子肽在制备食物添加剂中的应用。评价泡沫分离的效果主要是看溶解率、富集率和回收率。溶解率指原液中所溶解的蛋白质的质量占其藻粉所含蛋白质的质量。富集比指提取液中蛋白浓度与原液中蛋白浓 度的比。回收率指提取出来的蛋白质质量与原液中所含蛋白的百分比。使用本发明提取方法，可获得螺旋藻蛋白的溶解率达12. 6%，富集率达4. 4，回收率可达98%。本发明是将螺旋藻粉和藻泥预处理溶解，直接使用泡沫提取法，收集泡沫层就是5000Da以下的螺旋藻小分子多肽，实验表明本发明方法提取的多肽具有抗氧化、抑菌和抑制α-糖苷酶活性的生物活性，与传统提取方法相比，本发明提取小分子活性肽工艺十分简捷，不需要昂贵的设备和仪器，大大简化了提取的程序，整个提取过程在3小时内完成，缩短了提取所需时间，经济效益显著。本发明提供的提取螺旋藻小分子肽的方法对于天然活性肽的分离纯化和功能研究与利用及其生产开发具有不可估量的价值。
图I为本发明方法提取的螺旋藻小分子多肽提取液的分子量质谱图。图2为本发明方法提取的螺旋藻小分子多肽和Vc的还原能力比较图。图3为不同浓度螺旋藻小分子多肽和Vc对羟基自由基的清除效果图。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的分析方法采用MALDI-T0F-MS质谱扫描((MALDI-TOF MS Autoflex,德国Bruker);真空离心干燥仪(Speed Vac, SAVANT),冻干离心机(LABC0NC0 公司)，115mL10ku超滤离心管(Millipore公司)。下述各实施例中气泡分离体积为400ml，本领域技术人员可根据所选用的气泡分离器的体积不同而改变。实施例I提取螺旋藻小分子肽的方法(I)(I)称取螺旋藻粉(购于内蒙古再回首生物工程有限公司)蛋白质含量65%，溶于蒸馏水中，配制成料液比为2g/L的溶液，pH=7，然后用磁力搅拌机600r/min对溶液进行搅拌40min, 4000r/min 离心 30min。(2)取400ml上清液入泡沫分离柱中进行泡沫分离，气流速度为3. 5L/min,收集泡沫部分待消泡后即得主要含有螺旋藻小分子多肽的溶液，蛋白质溶解率为3. 0%，其富集比为I. 6，其回收率为80%。
实施例2提取螺旋藻小分子肽的方法(2)(I)称取螺旋藻粉(购于内蒙古再回首生物工程有限公司，蛋白质含量65%)溶于蒸馏水中，配制成料液比为O. 5g/L的溶液。控制pH=9. 5，然后用磁力搅拌机600r/min对溶液进行揽拌 40min, 8000r/min 离心 15min。(2)取400ml上清液入泡沫分离柱中进行泡沫分离，气流速度为I. 5L/min,收集泡沫部分待消泡后即得主要含有螺旋藻小分子多肽，蛋白质的溶解率为15. 0%，其富集比为I. 8，其回收率90%ο实施例3提取螺旋藻小分子肽的方法(3)(I)称取螺旋藻粉(购于内蒙古再回首生物工程有限公司，蛋白质含量65%)溶于蒸馏水中，配制成料液比为8g/L的溶液。控制pH=5. 1，然后用磁力搅拌机600r/min对溶液进 行揽拌 40min, 5000r/min 离心 20min。(2)取400ml上清液入泡沫分离柱中进行泡沫分离，气流速度为2L/min，收集泡沫部分待消泡后即得主要含有螺旋藻小分子多肽，蛋白质的溶解率为6. 5%，其富集比为4. 3，其回收率20%。实施例4提取螺旋藻小分子肽的方法(4)(I)称取螺旋藻粉(购于内蒙古再回首生物工程有限公司，蛋白质含量65%)，溶于蒸馏水中，配制成料液比为I. Og/L的溶液。控制pH=9. 0，然后用磁力搅拌机600r/min对溶液进行揽拌40min, 6000r/min离心20min。(2)取400ml上清液入泡沫分离柱中进行泡沫分离，气流速度为2. 5L/min,收集泡沫部分待消泡后即得主要含有螺旋藻小分子多肽，蛋白质的溶解率为12. 6%，其富集比为4. 4，其回收率98. 0%。实施例5利用质谱扫描测定泡沫提取物的分子量分布根据紫外-可见光扫描分析可知，实施例1-4的螺旋藻粉泡沫提取液中多肽的含量比较高。根据单因素实验的结果，当pH=9，料液比为lg/L时，蛋白提取物的提取率最高。选用实施例4制得的提取液浓缩5倍，进行质谱分析。质谱扫描图见图I。图I显示提取液中多肽的分子量主要为2230、2278、2358、2484、2556、2612、2845、2953、2994、3017、3034、3301、3541、3748、3775、3884、4261。可见，通
过泡沫分离法获得螺旋藻多肽的分子量绝大多数小于5000。另外选用实施例1-3制得的提取液浓缩后，用同样方法进行MALDI-T0F-MS质谱扫描，结果与上述一致。实施例6提取的螺旋藻小分子多肽的抗氧化性试验选用铁氰化钾分光光度法测定物质的总还原力，该法以吸光值的大小表示物质总还原力相对值的大小。在测定范围内随着螺旋藻多肽浓度的增加吸光度值(相对还原力)也增加，说明多肽提取物的还原能力具有较好的相关关系。维生素C (Vc)是较强还原剂，低浓度时还原能力已很高，随着浓度增加吸光度值增加缓慢。当螺旋藻小分子多肽在浓度为lOmg/mL时，本发明实施例4得到的螺旋藻小分子肽提取物的还原能力达到同浓度Vc的81. 7%，结果见图2。取实施例1-3提取的螺旋藻小分子多肽提取物进行上述相同的还原能力检测，发现实施例1-3的提取物(浓度为10mg/mL时)也具有还原能力，其还原能力分别达到同浓度lOmg/mL Vc的80. 6%、81. 7%,79. 8%。增加螺旋藻小分子多肽的浓度还可提高其总还原力。随着浓度增加，螺旋藻小分子多肽提取物和Vc对羟自由基的清除率同时增大，螺旋藻小分子多肽提取物的增率较Vc小一些。Vc在2mg/mL时，清除率已达到100%，随后保持不变。多肽提取物在较小浓度5mg/mL时，对羟基自由基的清除率就超过了 85%。由此说明螺旋藻小分子多肽提取物对羟自由基的清除效果较好。且由于螺旋藻多肽本身就是一种营养物质，作为食品添加剂的浓度没有上线 。
权利要求
1.一种提取螺旋藻小分子肽的方法，包括以下步骤 1)螺旋藻溶于蒸馏水中配制螺旋藻溶液； 2)搅拌、离心，取上清液； 3)将上清液加入泡沫分离柱中进行泡沫分离； 4)收集泡沫得到螺旋藻小分子肽溶液。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤I)是将螺旋藻溶于蒸馏水中，配制料液比为O. 5-8g/L。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤I)螺旋藻溶液的料液比为Hg/·L0
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤I)溶液的pH值为5-10。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤I)溶液的pH值为9。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤2)搅拌条件为600r/min，时间为0.5 lh。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤2)离心条件为4000-8000r/min,15 30mino
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤3)所述泡沫分离柱气流速度为1.5 3. 5L/min。
9.权利要求1-8任一项方法提取得到的螺旋藻小分子肽。
10.权利要求9所述的螺旋藻小分子肽的抗氧化用途。
全文摘要
本发明提供了一种提取螺旋藻小分子肽的方法，将螺旋藻进行预处理，调整料液比为0.5~8g/L，pH值为5-10，充分混合后进行泡沫分离，泡沫分离螺旋藻得到的泡沫提取液是分子量为5000Da的小分子生物活性肽。本方法获得螺旋藻蛋白的溶解率可达12.6%，富集比可达4.4，最高回收率可达98%。该方法提取小分子活性肽与传统方法相比工艺十分简捷，不需要昂贵的设备和仪器，大大简化了提取的程序、大幅度节省了提取成本，经济效益显著。
文档编号C07K2/00GK102875640SQ20121037512
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者李博生, 郭准 申请人:北京林业大学