专利名称：淋巴因子激活的杀伤细胞抗菌多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及从人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)的胞浆颗粒中分离纯化具有抗致病微生物活性的多肽技术及其基因重组微生物表达制剂的制备技术。
背景技术：
致病性微生物对传统抗生素的耐药性是当今临床医学的全球性难题之一，而人们对传统抗生素治疗“机会”致病菌感染的疗效也一直有疑义。为此，人们需要着手研究开发新的抗感染药物与措施。内源性抗菌肽成为目前学者们研究开发抗感染药物与措施的关注焦点。
抗菌肽按其结构大致分为两类一类为含二硫键的防御素类分子，另一类为不含二硫键的线形分子。含二硫键的防御素属于相对分子量为3000-4000阳离子小肽，具有抗革兰氏阳性与阴性细菌、口腔厌氧菌、真菌、螺旋体、分枝杆菌等广谱抗菌活性，以及抗疱疹病毒、艾滋病毒等胞膜病毒的生物活性，此外还具有趋化和上皮生长因子样作用，且可影响淋巴细胞的免疫反应。防御素分子的基本特征是由6个半胱氨酸组成链内二硫键，分子结构呈复杂的折叠结构。由于其结构复杂，因此众多的研究机构与学者对其原核重组产品的研制付出了很多努力，但均未获得成功，而人工合成的产品，产量低，造价极其昂贵，难以被市场接受。已有技术所认识的不含二硫键线形分子多肽，包括存在上皮细胞中的LL-37、昆虫中的天蚕抗菌肽、爪蟾抗菌肽、人唾液中的富组蛋白等，对革兰氏阴性及阳性菌、真菌、及一些原虫均有广谱杀菌作用。虽然天蚕抗菌肽和爪蟾抗菌肽作为药物的开发研究已进行了多年的努力，但因来源于低等动物，现还难于用于人的抗全身性感染的治疗试验。由于人富组蛋白极易降解，而人LL-37具有溶血作用，它们也难于作为药物进行开发。
本发明的发明人在开展本发明的研究工作之前的研究工作中发现人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)胞浆颗粒中存在具有强大抗菌活性的多个小分子多肽，但由于未对其进行分离纯化，因而对这些小分子多肽的特性及其生物作用等问题未得到明确，更谈不上其应用。
发明内容
本发明的发明人为明确这些小分子多肽的分子特性及其生物学作用，利用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE)技术和反向高效液相色谱技术对LAK细胞胞浆颗粒内的小分子肽进行了分离纯化，纯化出一个具有抗菌活性的分子，并对其氨基酸序列和cDNA序列进行了鉴定和数据库分析，确认该活性分子为已知蛋白HMG-17，同时鉴定出该活性分子的抗菌活性的结构域，即氨基酸序列从17位至47位之间的α螺旋结构域。发明人进一步以大肠杆菌等为宿主菌对HLP-3P21及其α螺旋结构域进行重组产品的表达，获得了具有抗菌活性的基因工程产品HLP-3P21和HLP-3P21α。
基于发明人己完成的工作，本发明可以解决以下技术问题其一是提供从人LAK细胞胞浆颗粒中分离纯化出表观分子量为16-17KD(道尔顿)的HLP-3P21分子和该分子氨基酸序列17至47之间的α螺旋结构片段小肽。
其二是提供将HLP-3P21和HLP-3P21α螺旋结构片段小肽应用于抗致病性大肠杆菌和绿脓杆菌，及其引起的全身炎症反应综合征。
本发明的具体内容如下1.抗菌多肽的分离纯化将rIL-2、PHA刺激培养一周的人外周血单个核淋巴细胞(人LAK细胞)在5％的乙酸中进行匀浆处理，以提取胞浆碱性蛋白。AU-PAGE电泳及电泳凝胶琼脂糖弥散法检测出人LAK细胞胞浆蛋白中含有的三组杀菌多肽成分，分别命名为HLP-1、HLP-2、HLP-3三个组分，利用制备性AU-PAGE电泳技术初步分离获得这三个组分。再将这三个组分用反向高效液相色谱技术进一步分离纯化，最终纯化出一个对革兰氏阴性杆菌有特异杀菌作用的抗菌活性分子，命名为HLP-3P21。
2.HLP-3P21的cDNA克隆及鉴定采取Edman降解法测定其氮端氨基酸序列。测定结果是HLP-3P21的N端十个氨基酸的序列为脯氨酸(Pro，P)，赖氨酸(Lys，K)，精氨酸(Arg，R)，赖氨酸(Lys，K)，丙氨酸(Ala，A)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，天冬氨酸(Asp，D)，丙氨酸(Ala，A)，赖氨酸(Lys，K)。将该段氨基酸序列登录美国国立医学图书馆(NCBI)，应用Blast检索工具对短序列匹配的人蛋白质数据库进行检索发现与该序列同源的蛋白质共有9个，其中一个为已知人非组蛋白HMG-17，四个为HMG-17的类似物，另外四个为由人mRNA序列推导的理论蛋白。为鉴定抗菌活性组分HLP-3P21究竟为何种蛋白，我们以氨基酸序列PKRKAEGDAK对应的碱基序列CCC AAG AGA AAG GCT GAAGGG GAT GCT AAG为模板设计5‘端特异引物AGA AAG GCT GAA GGG GAT GC进行3’race-PCR扩增出其3’端序列，进行核酸测序，从而获得了HLP-3P21的cDNA序列及其推导出的多肽一级结构，再将该cDNA序列登录NCBI的人mRNA数据库进行检索结果发现编码HLP-3P21的基因就是HMG-17的编码基因，基于上述生物信息学的分析鉴定出我们分离纯化的抗菌活性分子HLP-3P21就是HMG-17。
3.HLP-3P21抗菌活性鉴定观察HLP-3P21对大肠杆菌耐药ML-35P和绿脓杆菌国际标准株ATCC65922的抗菌活性，结果显示有显著抗菌活性。
4.HLP-3P21基因重组产品制备(1)HLP-3P21原核重组产品制备用GST(谷胱甘肽转移酶)基因融合表达载体构建HLP-3P21完整多肽的表达载体，转化大肠杆菌宿主菌，获得了能稳定、高效表达其融合蛋白的菌株，并从转化菌株分离获得了HLP-3P21原核重组表达多肽，抗菌活性检测该重组表达多肽对致病性大肠杆菌及绿脓杆菌均杀菌作用。
(2)HLP-3P21α螺旋结构域原核重组产品的制备克隆出编码HLP-3P21分子从17到47位氨基酸序列碱基序列，按上述方法构建其原核表达载体，转化大肠杆菌宿主菌，获得了能稳定、高效表达其融合蛋白的菌株，并从转化菌株分离获得了HLP-3P21α螺旋结构域原核重组表达的小肽分子，抗菌活性检测该重组表达的该小肽分子对致病性大肠杆菌及绿脓杆菌均杀菌作用。
人LAK细胞胞浆颗粒中的蛋白成分经AU-PAGE电泳及电泳凝胶琼脂糖弥散法检测含有三组杀菌多肽成分，分别命名为HLP-1、HLP-2、HLP-3(Human LymphocytePeptides，HLP)三个组分，再将各组分用反向高效液相色谱技术(RP-HPLC)进一步分离纯化，最终纯化出一个对革兰氏阴性菌有特异杀菌作用的抗菌活性分子，由于该分子在RP-HPLC洗脱过程中第21分钟收集得到，因此命名为HLP-3P21，该分子经N端氨基酸序列测定和cDNA序列分析鉴定为已知分子HMG-17。HMG-17目前被认为是普遍存在于细胞核内的非组蛋白分子，但目前对其功能尚未研究清楚，认为可能与维持DNA分子的构型、基因的活化有关。在人类基因组中，编码HMG-17的基因属于一多基因家族，这一多基因家族中的大多数成员属于加工过的假基因(ProcessedPseudogene)。这种多基因家族一般是细胞功能调节的关键性基因，常被称为看家基因(Housekeeping Gene)。目前国内外文献中尚无对其抗菌功能的报道。
本发明还对HLP-3P21的完整多肽分子及其从17到47位氨基酸序列的α螺旋结构域的小肽分子的抗菌活性进行了实验。实验项目有最小抑菌浓度和最小杀菌浓度两项，实验结果如附表1、2所示。
附表1 HLP-3P21和HLP-3P21α的最小抑菌浓度(ug/ml)
N＝3附表2 HLP-3P21和HLP-3P21α的最小杀菌浓度(ug/ml)
N＝3实验表明HLP-3P21及其α螺旋结构域小肽对大肠杆菌与绿脓杆菌均有很强的抑制与杀伤作用，因此均可以用于制备抗大肠杆菌与绿脓杆菌的药物。实验还表明HLP-3P21及其α螺旋结构域小肽对细菌内毒素有消解作用，因而还可用于制备抗细菌内毒素性休克综合征的药物。
四
附图1 HLP-3P21的cDNA序列附图2 HLP-3P21的氨基酸序列附图3 HLP-3P21的表观分子量SDS-PAGE电泳图附图4 HLP-3P21琼脂糖弥散法杀菌实验结果附图5高效液相色谱图五具体实施方式
实施例1，人LAK细胞的分离培养参照免疫学常用实验方法分离人外周血单个核淋巴细胞。将白细胞混悬液用等倍体积的PBS稀释后，沿离心管壁缓缓加至淋巴细胞分离液上，用水平离心机以2000r/min离心30min，离心后在上中层液体界面处可见乳白色混浊的单个核细胞层。用毛细管吸取界面层单个核细胞，加入5倍体积的PBS离心洗涤细胞，并重复两次。最后细胞沉淀用完全的RPMI1640培养基(含r-IL2100U/ml，PHA100μg/ml)稀释至浓度为2×106/ml进行培养，三天后换液一次，七天后离心收集细胞。如细胞沉淀混杂有红细胞，则在沉淀中加入1ml灭菌双蒸水，轻轻振荡20秒，使混杂的红细胞破裂，再迅速加入灭菌的等量1.8％NaCL溶液混匀后离心收集细胞。
实施例2，人LAK细胞酸溶性提取物的制备加入适量5％乙酸的细胞沉淀在冰浴中电动匀浆，匀浆液在13000r/min×6min，4℃条件下离心收集上清。沉淀再反复匀浆直至镜下看不到完整的细胞。收集的上清液均移入截流量为3.5KD的透析袋中，4℃透析48小时除去乙酸，冷冻干燥后，得到LAK细胞的酸溶性粗提物，-20℃保存备用。
实施例3，人LAK细胞酸溶性提取物抗菌活性成份初筛1、酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(Acid-Urea polyacrylamide Gel Electrophoresis，AU-PAGE)按Panyim方法制胶，胶厚0.75mm，胶浓度为12.5％，预电泳150V，1.5小时，除去凝胶中的TEMED及过硫酸铵。取2mgLAK酸粗提物，溶于50μl0.01％乙酸溶液中，再加入等量2×上样缓冲液稀释。制备1mg/ml溶菌酶于上样缓冲液中，于两侧凝胶梳孔中均加入10μl溶菌酶溶液及LAK粗提物溶液。150V恒压电泳45min，取出凝胶，一侧用考马斯亮兰染色，另一侧用10mMPBS洗涤5min×3次除去乙酸、尿素等杂质后，用作杀菌实验。
2、电泳凝胶琼脂糖弥散法杀菌实验实验前一天，取致病性大肠杆菌ML-35P氨苄青霉素耐药株菌液2接种环于5ml大豆培养基中，摇菌过夜。次晨，取3μl摇活的菌液于3ml大豆培养基中，摇菌2-3小时，紫外分光光度计检测620nm吸光度值达0.2时细菌浓度为5×107个/ml，将菌液30μl加入42℃溶化状态的底层培养基中使菌终浓度为105个/ml，旋涡混匀后，置底层培养基于培养皿中，待凝固后，铺AU-PAGE凝胶于底层培养基上，置于37℃孵箱孵育3小时，弃凝胶，倒入顶层培养基37℃孵育过夜。结果显示LAK细胞酸溶性粗提物有四条主要的杀菌成份，分别对应四条蛋白质条带，第一条为组蛋白条带，第二、三、四条条带分别命名为HLP-1，HLP-2，HLP-3(Human lymphocyte peptides，HLPs)。
实施例4，制备性AU-PAGE分离制备HLP-1，HLP-2，HLP-3采取实施例3相同的方法制备凝胶，胶厚1.5mm，制胶时不插梳子，以水封平胶面。预电泳150V，1.5小时，除去TEMED及过硫酸铵。取60mgLAK细胞酸溶性粗提物溶于800μl上样缓冲液中，上样与凝胶上，电泳45min至甲基绿出胶。
电泳完毕取下凝胶，从一侧切下约3mm宽胶条进行考马斯亮兰染色，至HLP-1，HLP-2，HLP-3蛋白条带清晰可见后，再与剩余凝胶对比，切下对应凝胶条带。切割下的HLP-1，HLP-2，HLP-3条带分别装入透析袋(分子截流量为3.5KD)加入约3-5ml 5％乙酸，透析袋置于电泳缓冲液为5％乙酸的水平电泳槽中，在冰水浴下电泳洗脱1.5小时，取出凝胶，再反向电泳15秒。洗脱液透析除去乙酸，冻干后，-20℃保存。
实施例5，反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离HLP-1，HLP-2，HLP-3RP-HPLC分离条件参照已有文献方法0.1％三氟乙酸--60％乙氰0-60分钟线形梯度洗脱，检测波长214nm，流速1ml/分，收集洗脱液1ml/管。将收集液置于-80℃预冻后，冷冻干燥后再溶于0.01％乙酸待做活性检测。
HLP-3的高效液相色谱图显示HLP-3的主要色谱峰均在40分钟以前出现，第21分钟收集组分为一单峰，且具有强抗菌活性。
实施例6，RP-HPLC分离的各组分的抗菌活性鉴定琼脂糖弥散法测定杀菌活性，同上述方法制备底层含菌培养基，并在培养基上打直径为3mm的孔，加入RP-HPLC分离的各组分样品4μl，37℃孵育3小时后，倒入顶层培养基，37℃孵育过夜。
结果显示HLP-3中，最大抑菌圈出现在B5孔、C1孔、C2孔、C3孔、E2孔、E3孔、E4孔，即组分20、21、22、23、32、33、34具有较强抗致病性大肠杆菌ML-35P氨苄青霉素耐药株的活性。另外组分21还有抗绿脓杆菌标准株ATCC65922的活性，我们将组分21命名为HLP-3P21。
实施例7，抗菌多肽的Tricine-SDS-PAGE分子量测定1、凝胶制备及电泳条件按Schagger方法制胶，胶厚0.75mm，浓缩胶4％T、3％C，分离胶16.5％T、3％C。电泳条件恒压80V，3-3.5h。样品处理样品溶于上样缓冲液中(或样品溶液与2×上样缓冲液等体积混合)，于40℃，30分钟变性处理。
2、Tricine-SDS-PAGE银染电泳完毕后，参照Wary方法，进行氨银染色1)50％甲醇摇床洗胶5min×5次，以固定蛋白质；2)染液染胶15分钟；3)双蒸水洗胶5min×3次；4)加显影液至最佳色泽呈现；5)迅速用双蒸水洗胶两次；6)加终止液终止显影反应。
结果显示HLP-3中经HPLC纯化的具有强抗菌活性的收集组分HLP-3P21经Tricine-SDS-PAGE银染分析为纯化的单一条带，分子量约16-17KD。
实施例8，HLP-3P21氮端氨基酸序列测定将蛋白条带半干转移至PVDF膜上用于氨基酸序列分析，测出HLP-3P21的氮端第一至第十位氨基酸分别为脯氨酸(Pro，P)，赖氨酸(Lys，K)，精氨酸(Arg，R)，赖氨酸(Lys，K)，丙氨酸(Ala，A)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，天冬氨酸(Asp，D)，丙氨酸(Ala，A)，赖氨酸(Lys，K)。
实施例9，3’race-PCR扩增HLP-3P21的3’端cDNA序列1、3’race-PCR的5’端引物设计根据HLP-3P21的氮端氨基酸序列登陆美国国立医学图书馆(NCBI)网站，应用BLAST检索工具对其氮端氨基酸序列进行短序列匹配(short sequence matched)检索，找到其N端匹配的蛋白质及其相应的核酸序列为CCC AAGAGA AAG GCT GAAGGG GAT GCT AAG，再依据该段核酸序列设计引物为AGA AAG GCT GAA GGGGAT GC。
2、提取LAK细胞的总RNA离心收集LAK细胞前，进行细胞计数，离心后约每107个细胞加入1mlTriZOL，轻轻吹打细胞使之充分溶解。室温静置5分钟后，每1mlTriZOL中加入200μl三氯甲烷后剧烈振摇15秒。室温静置2-3分钟后，10500rpm离心10分钟。小心吸取上清，加入500μl异丙醇充分混匀后室温静置10min，10500rpm离心15分钟。去上清，加入已配制好的75％乙醇溶液1ml(用DEPC处理过的超纯水配制)旋涡振荡后，8500rpm离心5分钟洗涤沉淀。去上清空气干燥沉淀后，加入20μlDEPC处理过的灭菌水溶解沉淀。取1μl检测280nm及260nm的吸光度比值以检测其纯度，另取1μl进行琼脂糖凝胶电泳分析，半定量检测其浓度。
3、race-PCR反应条件第一步将mRNA反转录为cDNA，总RNA2μl、OligodTPrimer 1μl、dNTP(10mM)4μl、MgCL2(25mM)2μl、AMV Tranferase 1μl、Rnase Inhibitor 0.5μl其余用DEPC处理的灭菌水将体积调节为20μl。反应条件94℃变性处理30秒，50℃反转录30分钟，5℃5分钟。
第二步扩增3’端cDNA序列，反转录产物4μl、5’端引物1μl、OligodT AnchorPrimer 1μl、dNTP(2mM)4μl、MgCL2(25mM)4μl、rTaqPolymerase0.5μl。循环条件94℃1分钟，57℃45秒，72℃1分钟，30个循环。
race-PCR反应共扩增出三个不同分子量的产物，分别为1100bp，800bp，500bp实施例10，PCR产物的T载体克隆，阳性克隆鉴定及序列测定1、PCR产物的胶回收纯化PCR产物用厚胶进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外显影条件下切胶(胶内含有相应的不同分子量的PCR产物，胶应尽量切薄，不含PCR产物的凝胶应尽量少)。称胶块重量，按每100mg胶加入250μlS1液，置于55℃水浴溶胶10分钟。待胶完全溶化后，加入1/3S1体积的异丙醇混匀，55℃水浴1分钟。将溶化后的液体移入过滤柱中离心(10000RPM 1分钟)，去掉流出液，在柱中加入500μl的Washing Buffer，室温静置1分钟。然后离心(10000RPM 1分钟)去掉流出液。再用500μl的Washing Buffer洗涤沉淀DNA一次。将过滤柱移入一个干净灭菌的EP管中，向柱内加入30μlTE液，室温静置2-3分钟，离心(10000RPM 1分钟)收集流出液得到胶回收的产物。取3μl进行琼脂糖凝胶电泳，半定量测定其DNA含量。
2、感受态细胞的制备复苏本室保存的JM109菌株，摇菌过夜，次晨取0.5ml的菌液加入50ml的LB培养基中，140转/分钟振摇2小时，将菌液移入50ml的离心管中，冰浴10分钟，离心(4000RPM 10分钟)收集细菌。细菌沉淀用冰浴预冷的0.1M的CaCL2溶液10ml重悬。旋涡振荡混匀后，冰浴20分钟，离心收集细菌，再用2ml的0.1M的CaCL2溶液重悬。分装成200μl每管，放入4℃冰箱保存备用(4℃放置12-24小时的感受态细胞转化效率最高)。
3、PCR产物与T载体的连接反应在微型离心管中制备下列连接反应液，全量为10μlpMD 18-T Vector 1μl，PCR胶回收纯化产物1μl(约50ngDNA)，灭菌水3μl，Solution I 5μl。16℃反应3-4小时。连接反应液10μl全量转化JM109感受态细胞。
4、连接反应物转化感受态细胞将连接反应物10μl加入4℃过夜保存的200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。然后在42℃水浴中恰恰放置90秒，再冰浴2分钟，加入800μl的SOB培养基，混匀放入37℃水浴中加温几分钟后，140转/分钟摇菌45-60分钟。离心(4000RPM10分钟)收集细菌，将菌液涂于含有X-Gal、IPTG、Amp的琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选白色菌落进行PCR及酶切鉴定。
5、T载体阳性克隆的鉴定(1)质粒提取用接种环挑取白色菌落，接种于含有氨苄青霉素(浓度为0.1μg/ml)的3mlLB液体培养基中，摇菌14-16小时后离心菌液提取质粒。按照质粒提取试剂盒的操作说明，向细菌沉淀中加入SolutionI 250μl，旋涡振荡使沉淀溶解。再加入SolutionII 250μl，轻轻混匀，待溶液清亮后加入SolutionIII 350μl，轻轻摇晃至白色沉淀产生，然后10000RPM 10分钟离心沉淀。小心吸取上清，移入收集柱中，离心10000RPM 1分钟，弃流出液，向柱中加入750μl的Washing Buffer沉淀DNA，离心弃流出液。将柱放入一灭菌的EP管中，加入50μl的灭菌纯水于柱中静置几分钟溶解沉淀后，离心收集流出液。
(2)酶切鉴定取质粒DNA 5μl，ECOR I 0.5μl，HIND III 0.5μl，10×M Buffer 2μl，灭菌水12μl，反应总体积为20μl，37℃酶切4小时。酶切产物20μl进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切所得片段大小是否与原PCR产物相似。
(3)PCR鉴定将质粒DNA稀释至适当浓度，取1μl为模版，按原PCR反应条件进行PCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳确认T载体中插入片段的长度大小。
6、T载体阳性克隆的测序将经鉴定的阳性克隆用甘油保种，并取部分菌液测序，测序工作由上海基康生物有限公司完成，所用仪器为ABIPRISM377 DNA自动测序仪。
7、根据测序结果推导蛋白质氨基酸的序列，并进行结构分析根据所测的寡核苷酸序列，在基因BANK中查出其全序列及其对应的氨基酸序列。应用OMIGA蛋白分析软件分析其碱性氨基酸的含量，亲疏水性、α螺旋结构等重要指标。
将三个不同片段T载体阳性克隆的测序结果登陆基因BANK，查询其全序列。结果显示仅有1100bp片段的5’端序列所编码的N端10个氨基酸与HLP-3P21的N端氨基酸序列完全相符，故可以确定该序列为HLP-3P21的编码序列，而其与已知蛋白HLP-3P21 100％同源，其余两个PCR产物为非特异性扩增。
HLP-3P21分子中碱性氨基酸的含量较高，约为28％，碱性氨基酸的总数为26，其中赖氨酸数目为22，精氨酸为4个。在HLP-3P21分子的17-47氨基酸区域有一疏水区，并形成α螺旋跨膜区。
实施例11，重组质粒的构建1、体外扩增HLP-3P21的全长编码序列及α螺旋区的编码序列按照上述的质粒DNA提取的方法提取阳性克隆1100bp的质粒DNA，适当稀释作为模板，以引物P15’ACGGA TCCCCC AAG AGA AAG GCT G3’P2TAGAA TTCCTT GGC ATC CTC CAG CAC3’，扩增HLP-3P21的全长编码序列；以P3CAGGATCCAAG GAC GAA CCA CAG，P4GCGAA TTCCTT CTT TGC AGG GGC CT，扩增HLP-3P21的α螺旋区的编码序列。循环条件分别为94℃1分钟，57℃45秒，72℃1分钟，30个循环；94℃1分钟，57℃30秒，72℃45秒，30个循环。
经PCR反应扩增出HLP-3P21的全长编码序列，片段大小为270bp；α螺旋区的编码序列，片段大小为110bp。
2、含有PGEX-1λT质粒宿主菌的复苏及质粒DNA的提取质粒PGEX-1T含有氨苄青霉素耐药基因，将-20C甘油保种的含有PGEX-1T质粒的宿主菌JM109涂于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养，次晨用接种环挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇菌14-16小时后提取质粒。
质粒DNA的提取与实施例10同，提取质粒应用5ml的菌液共得到100μl的质粒，取50μl用于酶切反应，3、PGEX-1λT质粒DNA酶切反应总体积为120μl，反应体系如下质粒DNA50μl10×KBuffer12μlECOR I 6μlBAMH I 6μl灭菌水 46μl酶切4小时后应进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切效果，如未完全切开，则须适当加大酶量，或延长酶切时间。酶切完全的DNA用2倍体积的乙醇，1/10体积的3M乙酸钠(PH7.0)于-20℃沉淀DNA 15分钟，4℃12000RPM离心10分钟回收DNA，用灭菌纯水44μl重溶DNA。
4、PGEX-1λT质粒DNA酶切后的脱磷酸化反应反应体系如下
10×去磷酸化缓冲液 5μl牛小肠碱性磷酸酶 1μl酶切后的质粒DNA44μl37℃反应1小时，再向反应液中加入0.5mol/L的EDTA(PH8.0)0.5μl至终浓度为5mmol/L，75℃温育10分钟。将反应的50μl体积扩大至250μl，加入等体积的酚、氯仿各抽提一次。上清用2倍体积的乙醇，1/10体积的3M乙酸钠(PH7.0)于-20℃沉淀DNA15分钟，再离心回收沉淀干燥乙醇，用25μl的纯水重溶，储存于-20℃。
5、PCR产物的纯化将100μl的PCR产物用ECOR1和BAMH1酶切后，按照PCR产物纯化试剂的操作说明，向100μlPCR产物中加入Binding Buffer500μl，混匀后移入过滤柱中，12000RPM离心30秒，弃流出液，加入500μl Washing Buffer12000RPM离心30秒，弃流出液，再用200μl Washing Buffer洗涤一次。然后将过滤柱装入一个灭菌的EP管中，加30-40μl的Elution Buffer室温静置几分钟后离心收集流出液。
6、连接反应物转化宿主菌将PCR产物与质粒DNA按摩尔比10/1的比例加入总体积为10μl，同时加入等体积的Solutionl 10μl，反应条件同前4。用10μl的连接产物转化感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序鉴定。测序结果显示重组表达的目的基因的方向及序列均正确，重组质粒构建成功。
实施例12，重组大肠杆菌的蛋白诱导表达及纯化1、重组蛋白的诱导表达接种测序正确的阳性克隆菌于LB培养基中，摇菌过夜，次晨将5ml的菌液加入500ml的LB培养基中，快速摇菌3小时。然后加入IPTG诱导融合蛋白的表达(IPTG的终浓度为1ug/ml)，30℃摇菌10-12小时。菌液离心收集，用PBS洗涤两次后，重悬于20ml的PBS中，再加入40μl的10mg/ml的溶菌酶，反复冻融细胞10次，使细菌彻底破碎，释放出融合蛋白。离心收集上清约15ml置于离心管中，加入吸附胶200μl。室温反复混匀30分钟使融合蛋白与GST(glutathione S transferase)完全结合。离心4000RPM 5分钟，胶沉淀用PBS洗涤两次后，再用Glutathione Elution Buffer400μl反复洗脱4-5次，将胶中结合的融合蛋白洗脱下来。SDS-PAGE鉴定其纯度及浓度。
2、重组蛋白的酶切及纯化在含有融合蛋白的洗脱液500μl中(蛋白浓度约为0.5mg/ml)加入50U的凝血酶酶切融合蛋白，酶切后的蛋白混合溶液用AU-PAGE加以分离，并将若干次分离后的目的蛋白收集在一起，待作功能实验。
实施例13，重组表达目的蛋白HMG17及HMG17α的抗菌功能研究1、MIC实验(最小抑菌浓度测定)MIC实验所用的菌株为氨苄耐药株ML-35P及绿脓杆菌标准株ATCC65922。将对数生长期的细菌用紫外分光光度计测定620nm的OD值，按照公式菌浓度＝OD值×5×107/0.2(个/ml)，推算出菌浓度，用灭菌的大豆培养基稀释至浓度为2×105个/ml，加入等体积对倍稀释的蛋白溶液，使细菌终浓度为1×105个/ml，蛋白浓度梯度为400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml，1.6μg/ml，0.8μg/ml。充分混匀后，将样品置于37℃孵箱孵育10-12小时，再用紫外分光光度计测定620nm的OD值，记录样品OD值的变化。
2、MBC实验(最小杀菌浓度测定)将MIC实验中OD值不再发生变化的样品涂于事先准备好的不含抗生素的琼脂糖平板上，孵育10-12小时，观察有无细菌生长，无细菌生长的最小浓度即为最小杀菌浓度(MBC)。
测定结果见前面附表1、2。
权利要求
1.人淋巴因子激活的杀伤细胞抗菌多肽，其表观分子量为16-17KD，具有附图2所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述抗菌多肽中的α螺旋结构域小肽，氨基酸序列从第17位至47位。
3.权利要求1所述淋巴因子激活的杀伤细胞抗菌多肽在制备抗致病大肠杆菌药物中的应用。
4.权利要求1所述淋巴因子激活的杀伤细胞抗菌多肽在制备抗绿脓杆菌药物中的应用。
5.权利要求1所述淋巴因子激活的杀伤细胞抗菌多肽在制备抗细菌内毒素性休克综合征药物中的应用。
6.权利要求2所述抗菌多肽中的α螺旋结构域小肽在制备抗致病大肠杆菌药物中的应用。
7.权利要求2所述抗菌多肽中的α螺旋结构域小肽在制备抗绿脓杆菌药物中的应用。
8.权利要求2所述抗菌多肽中的α螺旋结构域小肽在制备细菌内毒素性休克综征药物中的应用。
全文摘要
致病性微生物对传统抗生素的耐药性是当今临床医学的全球性难题之一，也是人类为了自身的健康迫切需要解决的问题。本发明从人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)胞浆颗粒内分离纯化出一个命名为HLP－3P21的抗菌多肽，并测定了HLP－3P21的cDNA序列和氨基酸序列。抗菌实验表明该抗菌多肽及其α螺旋结构域小肽HLP－3P21α均对致病性大肠杆菌和绿脓杆菌有很强的活性。本发明的公开，为进一步研究开发治疗大肠杆菌和绿脓杆菌感染及其引起的全身炎症反应综合征的药物奠定了基础。
文档编号C07K14/435GK1445240SQ0311772
公开日2003年10月1日 申请日期2003年4月22日 优先权日2003年4月22日
发明者王伯瑶, 吴琦, 杨华蓉 申请人:四川大学