专利名称：抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种具有抗体活性的卵黄抗体物质——抗奶牛乳腺炎病原菌卵复合黄抗体(抗-MasIgY)产品，并涉及其制备工艺及在兽类药学和饲料添加剂中的应用。
奶牛乳腺炎(Mastitis)主要是病原微生物感染引起，革兰氏阳性菌是最常见引起乳腺炎的细菌，乳腺炎的80％-90％由葡萄球菌及链球菌所引起。葡萄球菌中以金黄色葡萄球菌感染最多，链球菌属又以无乳链球菌感染最多。近年来研究发现革兰氏阴性杆菌(G-)也能引起急性乳腺炎、乳腺坏疽。病原微生物可以由损伤的皮肤和乳头进入乳腺，随着乳腺内牛奶的充盈，病原体能漂浮到乳腺上部，自下而上，呈渐进性上行感染；也可通过消化道、呼吸道、生殖道及受伤的皮肤进入体内，经体液转至乳腺引起感染。若得不到及时治疗，感染范围扩大，感染程度加剧，引起乳腺化脓、破溃，丧失泌乳功能。奶牛乳腺炎按照目前临床上常用的分类方法，可分隐性乳腺炎、临床型乳腺炎和慢性乳腺炎三种。
奶牛乳腺炎目前主要的治疗方法是应用抗生素，如β-内酰胺类抗生素、氨基糖甙类药物、大环内脂类抗生素、土霉素类及林可霉素和克林霉素等，靠该类药物防治奶牛乳腺炎疾病虽有一定的帮助，却直接导致奶制品抗生素残留大大超过我国自订的绿色无污染标准和国际出口标准，造成巨大的经济损失；另有部分养殖企业采用中药制剂方式对奶牛进行该类疾病的防治，但中药制剂的效果不甚理想，因而疾病在奶牛中无法从根本上得到控制。近年来许多国家都逐渐在使用包括活菌苗、灭活苗等生物制剂来控制这类疾病，这种生物制剂防治乳腺炎感染的效果多数情况下是单一的，对混合感染的疾病无能为力，疫苗对健康动物传染病的预防是根本，但对临床上一定比例发病群体和混合感染的治疗至今是一个难题。以上几点是我国现行奶牛乳腺炎疾病的的主要防治方式，均各有弊端，不利于我国奶制品质量得到确切有效的提高。长期食用这样的食品，将给人们的身体健康带来严重的损害。
鸡卵黄抗体(IgY)是来自鸡血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的结构与IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。研究表明IgY具有高度的稳定性，在热、酸、碱环境中具有优良的耐受性，同时IgY还具有成本低、易于形成规模化生产的优点。目前国内已有病毒、细菌等颗粒性抗原诱导鸡卵黄表达特异性抗体的研究报告。
现有技术中未见有通过采用奶牛乳腺炎病原菌(葡萄球菌、链球菌、G-杆菌)作为抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗-MasIgY报道。
本发明所要解决的技术问题是针对以上问题，提供一种方便、高效、无毒副作用的非抗生素生物制剂，用于因葡萄球菌、链球菌、G-杆菌感染所引起的奶牛乳腺炎疾病的防治。针对以往产品只能采取针剂的形式注射使用，使用不便，而加以改进。该抗体稳定性较强、耐酸、碱，可以采取口服形式使用，能保持产品的活性与效价，使用方便，易于推广。因其制备免疫球蛋白的方法较以往的要简单、快速、易于掌握，提取回收率理想、经济效益可观，适于产业化制作。
本发明通过以奶牛乳腺炎病原菌为抗原，免疫健康产蛋母鸡，提取活性成分(抗-MasIgY)。为治疗奶牛乳腺炎感染提供一条新思路和新方法，并为进一步制备抗奶牛乳腺炎的免疫生物制剂奠定基础。
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种具有抗体活性的抗奶牛乳腺炎卵黄抗体(抗-MasIgY)；本发明所要解决的技术问题之二是提供上述抗奶牛乳腺炎卵黄抗体(抗-MasIgY)的制备方法；本发明所要解决的技术问题之三是提供上述抗奶牛乳腺炎卵黄抗体(抗-MasIgY)在制备用于因病原菌引起的奶牛乳腺炎的预防或治疗的药物制剂或饲料添加剂应用。
本发明解决上述技术问题之一所采用的技术方案是这样的，即一种抗奶牛乳腺炎卵黄抗体(抗-MasIgY)，其特征在于所述抗-MasIgY按SDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。
本发明解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗奶牛乳腺炎卵黄抗体(抗-MasIgY)的方法，其特征在于采用如下的步骤完成1、制备奶牛乳腺炎病原菌抗原(1)菌体抗原制备分别将葡萄球菌、链球菌、G-杆菌菌株，涂布于血琼脂和营养琼脂上，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体。
(2)荚膜亚单位抗原的制备菌种按1∶100接种于新鲜牛肉汤中、37℃培养24h后置60C水浴灭活1h，振荡几次后置冰箱过夜，次日4000g离心25min，收集上层清液，加入适量CTAB〔预先水浴溶解〕，充分振荡后冰箱过夜，4000g离心45min，弃上层清夜、收集沉淀、用原菌液量2.5％的去离子水研磨，再加入等量2mol/L的CaCl2溶液.振荡1h，按体积比加入25％(v/v)预冷无水乙醇，充分振荡，冰箱过夜，4000g离心25min，弃沉淀，收集上层清夜继续加入无水乙醇，使乙醇总量为80％(V/V)，冰箱过夜，4000g离心45min，弃上层清夜，收集沉淀。
(3)结合抗原制备根据三类菌的主要致病因子(葡萄球菌肠毒素、链球菌外毒素、G-杆菌内毒素)，构建含有以上三种细胞毒素的基因表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化制备。
以上所得按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原2、将菌体抗原按以下的步骤制备抗体(1)对产卵母鸡的免疫I、基础免疫选用产卵母鸡(健康)隔离饲养，进行鸡皮下多点注射复合抗原，0.5ml/只。
II、强化免疫基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂复合抗原0.5ml/只。
III、超强化免疫21天后需超强化免疫1-3次，注射量1ml/只，以保持抗体滴度。
于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。
(2)卵黄抗体的提取①.采用水溶法提取卵黄抗体从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上层清夜浓缩、冷冻干燥，得到抗-MasIgY；
或②采用膜过滤法提取卵黄抗体分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为300KD和100KD的膜分别过滤，收集蛋白物质，冷冻干燥得到抗-MasIgY。
本发明所提供的上述抗-MasIgY产品由奶牛乳腺炎病原菌免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治奶牛乳腺炎感染引起的疾病具有良好的效果。本发明采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。
由于解决上诉技术问题抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体(抗-MasIgY)可制成粉剂、散剂、水剂等剂型，可以口服、灌注应用，使用方便。
附图
的说明附图给出了本发明制备方法的工艺流程图。
实施例2菌体抗原的制备，病原菌菌株，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。
实施例3荚膜亚单位抗原的制备菌种按1∶100接种于新鲜牛肉汤中、37℃培养24h后置60℃水浴灭活1h，振荡几次后置冰箱过夜，次日4000g离心25min，收集上层清夜，加入适量CTAB〔预先水浴溶解〕，充分振荡后冰箱过夜，4000g离心45min，弃上层清夜、收集沉淀、用原菌液量2.5％的去离子水研磨，再加入等量2mol/L的CaCl2溶液.振荡1h，按体积比加入25％(v/v)预冷无水乙醇，充分振荡，冰箱过夜，4000g离心25min，弃沉淀，收集上层清夜继续加入无水乙醇，使乙醇总量为80％(V/V)，冰箱过夜，4000g离心45min，弃上层清夜，收集沉淀。按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。
实施例4结合抗原制备根据三类菌的主要致病因子(葡萄球菌肠毒素、链球菌外毒素、G-杆菌内毒素)，构建含有以上三种细胞毒素的基因表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化制备。按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。
实施例5采用如下方式分离提取抗-MasIgY从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上层清夜浓缩、冷冻干燥，得到抗-MasIgY。
实施例6分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为300KD和100KD的膜分别过滤，收集的蛋白物质，冷冻干燥得到抗-MasIgY。
实施例7取实施例1、5、6中的产品进行IgY纯度检查用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带，即为提纯的卵黄抗体。
实施例8取实施例1、5、6中的产品进行IgY浓度检查将提取的抗体用PBS作5-10倍的稀释，然后用采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。
实施例9取实施例1、5、6中的产品进行IgY效价测定采用奥氏双扩散方法进行IgY效价测定，IgY效价为1∶320-1∶12800。
实施例10采集抗-MasIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，0.22u滤过除菌，浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在95％以上)的IgY抗-MasIgY10克，分装安瓿50mg/瓶，冷冻干燥，用于治疗仔猪大肠杆菌感染引起的细菌性疾病。
实施例11采集抗-MasIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在99.5％以上的IgY抗-MASIgY)10克。超滤液按5-10％加入淀粉，混合均匀，冷冻干燥。用于预防仔猪大肠杆菌感染引起的细菌性疾病。
实施例12体外实验①.分子量检测SDS-PAGE电脉，分离胶浓度7.5％，浓缩胶浓度5％，电流11mA，电压200V，时间45min，Marker采用低相对分子质量标准蛋白质，取下凝胶用于常规银染色法。
②.纯度分析双向免疫扩散法，参照文献进行。
③.活性检测ELISA间接试验，操作方法参照常规ELISA间接法，所用抗原、抗-MasIgY、酶标抗体均按棋盘滴定法确定工作浓度，抗原浓度为100ug/ml，包被板每孔加样100ul，被测抗-MasIgY浓度为5ug/ml，每孔加样100ul，辣板过氧化物酶标抗IgY-IgG(Sigma公司)工作稀释度为1∶1000，底物为OPD，2ml/浓硫酸终止反应，酶标仪492nm下测定OD值。
实施例13IgY抗体抑制细菌粘附的作用抗-MasIgY和葡萄球菌、链球菌、上皮细胞一起培养，每1ml添加0.5mg抗体就观察到粘附在上皮细胞上的葡萄球菌和链球菌减少，抗体浓度达到5mg/ml时，效果更好。说明抗-MasIgY抗体能抑制葡萄球菌和链球菌粘附在上皮细胞上，进而阻断了细菌的繁殖和产生毒素。
实施例14抗-MasIgY体外抑制细菌生长的生物活性实验抗-MasIgY(20ug-400ug/ml)与细菌(105-107ug/ml)在无菌条件下11混合。37℃24h后，取0.1ml上层清夜加入营养琼脂培养中，发现IgY浓度在400ug/ml可明显抑制细菌的生长。其后的系列稀释，其抑制保护活性亦随之减低。
实施例15口服抗-MasIgY在体生物学活性观察参照相关文献建立小鼠乳腺炎细菌感染的模型，试验分为(15mg/Kg和40mg/Kg)两个治疗组、对照组。口服治疗72h后，观察母鼠乳腺的外观变化、乳腺的病理组织学检查，组织切片中的细菌检查等指标。结果发现对照组感染72h后的乳腺明显充血，间质明显增宽，高度水肿，有大量浆性和炎性细胞浸润，渗出严重区域的腺泡上皮大多变性、坏死、脱落、崩解以致消失，许多腺泡中散在中性粒细胞，其中有些中性粒细胞坏死崩解，乳腺淋巴结充血，淋巴窦严重扩张，大部分窦腔有浆液渗出，其中散在少量的中性粗细胞、淋巴细胞；淋巴髓索中有少量的浆细胞。治疗组治疗后72h的乳腺充血，间质水肿，有浆性和炎性细胞浸润，腺泡间隔增宽，散在有中性粒细胞，但腺泡腔中白细胞很少，少数腺上皮细胞增生、变性、坏死、脱落，乳腺淋巴结轻度充血，淋巴组织增生，淋巴滤泡变大，生发中心扩大，网状细胞增生，髓索可见大量浆细胞，淋巴窦很小，淋巴结免疫反应明显。组织切片中的细菌检查对照组和治疗组泌乳母鼠乳腺组织切片镜检均见有大量球菌，治疗组的乳腺组织切片中大多数球菌被中性粒细胞吞噬，少数附着在腺泡上皮表面。
实施例16抗-MasIgY灌洗治疗在生物学活性观察参照相关文献建立大鼠乳腺炎细菌感染的模型，试验分灌洗治疗组和对照组治疗组每日灌洗2次，治疗48h后，观察母鼠乳腺的外观变化、乳腺的病理组织学检查，组织切片中的细菌检查和乳中体细胞计数等指标。结果发现对照组感染48h后的乳房红肿，腺体严重充血，有的出血，多数区域腺上皮成片状坏死脱落，中性粒细胞坏死、崩解，有脓球形成。治疗组治疗后48h的乳房轻微红肿，乳腺充血，间质水肿，有浆性和炎性细胞浸润，腺泡腔中白细胞很少，少数腺上皮细胞变性、坏死。组织切片中的细菌检查对照组和治疗组泌乳母鼠乳腺组织切片镜检，均见有大量G+球菌，治疗组的乳腺组织切片中球菌被中性粒细胞吞噬，少数附着在腺泡上皮表面，乳中体细胞计数治疗组明显低于对照组。
权利要求
1.一种抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体(抗-MasIgY)，其特征在于上述抗-MasIgY按SDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度；经体外拮抗细菌生物活性检测，抗-MasIgY浓度在400μg/ml时可明显抑制奶牛乳腺炎病原菌(葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌)的生长，经奥氏双扩散法对抗-BAIgY进行效价测定效价为1∶320-1∶12800。
2.一种制备抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体，即抗一MasIgY的方法，其特征在于采用如下的工艺步骤(1)制备抗原①菌体抗原制备分别将葡萄球菌、链球菌、G-杆菌菌株，涂布于血琼脂和营养琼脂上，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原；②荚膜亚单位抗原的制备菌种按1∶100接种于新鲜牛肉汤中、37℃培养24h后置60℃水浴灭活1h，振荡几次后置冰箱过夜，次日4000g离心25min，收集上层清夜，加入适量CTAB〔预先水浴溶解〕，充分振荡后冰箱过夜，4000g离心45min，弃上层清夜、收集沉淀、用原菌液量2.5％的去离子水研磨，再加入等量2mol/L的CaCl2溶液.振荡1h，按体积比加入25％(v/v)预冷无水乙醇，充分振荡，冰箱过夜，4000g离心25min，弃沉淀，收集上层清夜继续加入无水乙醇，使乙醇总量为80％(V/V)，冰箱过夜，4000g离心45min，弃上层清夜，收集沉淀；③结合抗原制备根据三类菌的主要致病因子(葡萄球菌肠毒素、链球菌外毒素、G-杆菌内毒素)，构建含有以上三种细胞毒素的基因表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化制备。；以上所得按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原(2)再将所得的菌体抗原按以下的步骤制备抗体①对产卵母鸡的免疫I、基础免疫选用产卵母鸡(健康)隔离饲养，进行鸡皮下多点注射复合抗原，0.5ml/只；II、强化免疫基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂复合抗原0.5ml/只；III、超强化免疫21天后需超强化免疫1-3次，注射量1ml/只，以保持抗体滴度；于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用；②卵黄抗体的提取I、采用水溶法提取卵黄抗体从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上层清夜浓缩、冷冻干燥，得到抗-MasIgY；或II、采用膜过滤法提取卵黄抗体分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为300KD和100KD的膜分别过滤，收集蛋白物质，冷冻干燥得到抗-MasIgY。
3.抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体，即抗-MasIgY在制备用于治疗因奶牛病原菌引起的乳腺炎相关疾病药物中的应用。
4.抗奶牛乳腺炎卵黄抗体，即抗-MasIgY在制备用于预防奶牛乳腺炎病原菌引起的相关疾病的制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗体活性的抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体(抗－MasIgY)、制备该抗体的方法及其在制备用于治疗因奶牛乳腺炎感染引起的相关疾病药物或饲料添加剂中的应用。上述抗－MasIgY按SDS－PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western－blotting检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带，采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。上述方法为制备奶牛乳腺炎病原菌抗原，将该抗原免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗－MasIgY。该抗体可用于制备治疗或预防因奶牛病原菌引起的乳腺炎相关疾病药物。
文档编号C07K16/02GK1438247SQ03117508
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者雁杰, 陈君 申请人:重庆和润实业(集团)有限公司