专利名称：预防和治疗sars的新型疫苗的设计方法及其成分的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒疫苗，更具体地涉及SARS病毒疫苗以及预防或治疗由SARS病毒感染引起的疾病的方法。
背景技术：
SARS是一种呼吸系统疾病，2002年11月首次报道在中国南部的广东省发现。该疾病从此开始蔓延，发病范围超过了12个国家，全世界有超过8,000人被感染。估计SARS患者总死亡率为14-15％，而在65岁以上的患者中，总死亡率则超过50％。
SARS的一般症状包括发热超过100.4F0、干咳、身体疼痛、呼吸困难。普遍认为SARS通过人与人之间密切接触传播，但也可能由于人接触污染物品，再触摸鼻子和嘴而感染疾病。
美国疾病控制中心和其它一些实验室的科学家从SARS患者体内检测到一种以前没有见到过的冠状病毒，这种新型病毒可能是造成SARS的主要原因。
发明内容
本发明提供了包含一段编码SARS冠状病毒基因产物的核酸序列的SARS病毒疫苗。在具体实施中，可将编码一个或多个SARS病毒基因产物的核酸序列与药学相容性载体上的调控序列相连形成重组载体。
在具体应用时，SARS冠状病毒基因选自S蛋白、Orf8蛋白、M蛋白、N蛋白、E蛋白、Orf1a蛋白、Orf1b蛋白和其联合体。药物成分包括一个调控序列，通常指一个启动子。例如，将CMV启动子作为启动子。
药物相容性载体，可以是病毒载体、质粒载体或者RNA载体。例如，病毒载体选用复制缺陷型腺病毒。在具体应用中，所使用的腺病毒是5型复制缺陷型腺病毒。
在一个实施例中，SARS病毒疫苗由一段克隆在药学相容性载体上的编码两个SARS冠状病毒基因产物的核酸分子组成，其中第一个基因产物至少包含一个SARS冠状病毒基因细胞外结构域，或其衍生物。另一个基因产物包含一个细胞内蛋白，或其衍生物。在具体应用时，第一个基因选自一个SARS-CoV基因群，包括S、M、Orf8和E，第二个基因选自包括N、Orf1a和Orf1b的SARS-CoV的基因群。
在另一个实施例中，第一个基因产物可以是SARS冠状病毒S蛋白的一部分，或者其结构域的抗原决定簇，或者其类似物，其中S蛋白有一个截短的C末端，除去了跨膜锚定和细胞内结构域。
在一个相关的实施例中，第一个基因产物包含两个SARS冠状病毒基因产物片段，第一个片段包含SARS冠状病毒S蛋白的一部分或者其结构域的抗原决定簇，或者其类似物，其中S蛋白有一个截短的C末端，以除去膜锚定和细胞内结构域；另一片段包含SARS冠状病毒Orf8蛋白的一部分，或者其结构域的抗原决定簇，或者其相似物，其中Orf8蛋白有个截短的C末端，以除去跨膜锚定和细胞内结构域。
在另一个实施例中，SARS疫苗的核酸分子由优化的密码子组成，这些优化是根据哺乳动物高表达基因密码子的使用频率来进行。在一个具体实施例中，经过优化后的基因中至少含有50％的GC碱基。在另一个实施例中，至少50％优化后的密码子在第三位上是G或者C碱基。
在另一个实施例中，SARS冠状病毒基因产物还包含一个分泌的信号肽片段。在具体应用时，信号肽片段可以是Igk信号序列。
SARS疫苗以多肽的形式提供。这些多肽可以是上述的任何基因产物的一种，并且，这些肽在体外经过了充分纯化。
本发明还涉及一种在某个体内诱导针对某抗原的免疫反应的方法，通过提供给此个体上述药物成分来实现。
在一个实施例中，药物成分给药约1周、2周、3周、4周或6周，或者，首次给药后，在不同时间再联合给药。
在另一个实施例中，药物成分与一个佐剂联合给药。
在具体应用时，质粒载体的药物成分的给药剂量是每次注射1mg至5mg。在另一应用时，病毒载体的药物成分的给药剂量是每次注射1×106-1×1013个病毒颗粒。
在一个实施例中，将药物成分进行肌内注射给药。或者，将药物成分进行皮内、皮下、鼻内或口服给药。
在另一个实施例中，诱导针对某一抗原的免疫反应的方法包括药物成分的给药，使用不同载体的药物成分进行第一次给药，以激发对上述抗原的免疫反应。
图1是合成的基因片段的结构示意图。
图2是SARS冠状病毒、HPV和人的密码子偏向性比较，优化基因的G/C含量是两个密码子优化后合成基因的G/C百分比的平均值。
图3是具有分泌信号的融合肽的示意图和全长DNA序列。融合蛋白包括S1结构域和Orf8蛋白的细胞外结构域。两个结构域通过一个可弯曲的连接子相联。编码融合蛋白的序列针对灵长类动物的最优表达进行了优化。
图4是具有分泌信号的S1-orf8融合蛋白示意图和氨基酸序列。
图5是N蛋白示意图和全长DNA序列。编码该融合蛋白的序列针对灵长类动物的最优表达进行了优化。
图6是N蛋白的氨基酸序列。
图7是经质粒SV1000免疫后的小鼠抗原特异性T细胞反应。雌性Balb/c小鼠在0天、14天和28天免疫，在第42天收获全部脾细胞。用覆盖整个基因1和基因2的长度为20个氨基酸(其中每个多肽与前一个多肽有10个氨基酸重叠)的多肽库来刺激脾细胞20hr。每个肽库约有12种肽，孔中每种肽的终浓度是1uM。
图8是单一注射SV8000质粒免疫后小鼠的抗体反应。
抗SARS冠状病毒IgG抗体滴度测定使用灭活的SARS冠状病毒粒子包被ELISA板，进行直接ELISA反应。
图9是使用重组腺病毒SV8000进行免疫后小鼠IFNg T细胞反应。肌内注射渐增剂量的SV8000来免疫小鼠，3周后收获全部淋巴细胞，并用多肽库刺激脾细胞。使用安慰剂组的小鼠用作对照(数据未显示)。
图10显示免疫诱导联合加强免疫的方法大大增强了抗体反应。单独使用DNA、腺病毒，或DNA和腺病毒联合使用免疫小鼠。在腺病毒激发前后收集血清样品。
图11是在恒河猴中单次注射重组腺病毒疫苗有效诱导中和抗体反应的情况。三只猴子分别注射安慰剂和1E12重组腺病毒颗粒(SV8000)。每周收集血清样品，用系列稀释血清样品与活SARS病毒温育后感染Vero E6细胞进行标准中和试验，测定其中和滴度。
图12是恒河猴抗体反应的时间变化情况。在ELISA试验前，将不同时间点的血清样品作40倍稀释。测定HRP的酶活用来表示相对抗体滴度。
图13是病毒攻击前后总IgG抗体的反应情况。分别收集病毒攻击2天前和7天后的动物血清样本，用灭活SARS冠状病毒颗粒包被的96孔板进行抗体测定。
图14是在感染PUMC-1病毒株的猴子中检测SARS冠状病毒的情况。在病毒攻击后第2天、第5天和第7天收集咽拭子样品。首先将每份样品与DMEM温育，并在接种Vero细胞前用0.22um的滤器过滤。负值表示经连续3次传代后，没有可见的细胞病变效应(CPE)。用定量RT-PCR反应确定咽拭子样品中存在的病毒RNA的量。按照操作手册绘制标准曲线以测定基因组的拷贝数。
图15是感染活SARS冠状病毒的恒河猴尸解肺组织切片的组织化学研究结果。在病毒攻击后第7天对动物实施安乐死，按照方法部分所描述的方法对取自多种器官的样品进行处理。
肺组织切片作为代表性数据在此列出，a.对照组；b/c.高剂量组；d.低剂量组；e/f.安慰剂组。箭头所指的气泡部位充满了蛋白质样液体，箭头指向安慰剂组的透明质膜。
图16是活SARS病毒攻击猴子的尸解肺组织切片的免疫组化分析结果。用抗SARS冠状病毒的单克隆抗体来确定肺组织切片的抗原，a.阴性对照；b.高剂量组；c.低剂量组；d.安慰剂组。箭头指向的是SARS抗原表达阳性的细胞。
发明详述在叙述这些蛋白和核酸序列在疫苗接种和治疗上的应用以及应用的方法之前，我们应理解本发明并不仅限于这里具体叙述的方法、方案、细胞株、载体和试剂，因为这些可以不同。以下详述也应理解为此处所使用的术语只是为了描述具体的实施例，其目的不是为了限制本发明的范围，要求保护的范围仅在附加的权利要求中进行描述。
必须注意，除非有明显的说明，此处和附加权利要求中所使用的单数形式包含复数形式。因此，例如，所述的一个宿主细胞包含该宿主细胞的复数形式，所述的抗体指一个或多个抗体，其含义是本行业技术人员所熟知的。
除非另外说明，本发明所使用的所有技术和科学术语与本行业普通技术人员一般理解的含义相同。尽管任何相似或等同于此处所述的方法和材料可以用于实施，或者检测本发明，但是现在描述优选的一些方法、设备和材料。此处所提及的出版物都是为了描述和说明细胞株、载体和方法，这些在出版物中都有报道，而且与本发明相关。
这里所述的任何一点都不能作为本发明未被授权提前公开在先申请的内容的理由。
定义这里使用的“核酸序列”是指一种寡核苷酸、核苷酸或多聚核苷酸，及其中的片段或部分，来源于DNA或RNA基因组或是合成的单链或双链，既可以是正义链也可以是反义链。
同样地，这里使用的“氨基酸序列”是指一种寡肽、肽、多肽或蛋白序列及其片段或一部分，可以是自然存在的也可以是合成的分子。
这里提到的“氨基酸序列”是指一种自然存在的蛋白质分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”及类似的术语，如“多肽”或“蛋白质”，并不仅仅局限于与所叙述的蛋白分子相关的完整的、天然的氨基酸序列。
这里使用的“SARS基因”是指SARS冠状病毒所编码的基因或基因片段。一些基因已由Marra，MA et al(2003)在Sciencexpress，1-16中描述过。这些基因包括，但不仅限于以下所列的基因Spike蛋白(S)、膜蛋白(M)、核壳蛋白(N)、复制酶1A、复制酶1B、小包膜E蛋白、orf3、orf4、orf6、orf8、orf9、orf10、orf11、orf13及orf14。
这里使用的“SARS蛋白”是指由SARS基因或基因片段编码的多肽，这些SARS蛋白可以是从各种物种中充分纯化来的，特别是哺乳类动物，包括牛、绵羊、猪、鼠、马，尤其是人类，来源可以是天然的、合成的、半合成的或重组的。
这里使用的SARS蛋白的“突变体”是指其中一个或多个氨基酸发生变化的氨基酸序列。该“突变体”可以含有“保守的”的改变，即替代的氨基酸有着相似的结构上和化学上的特性，比如用异亮氨酸代替亮氨酸。比较少见的情况下，这个突变体也可以含有“非保守性”的改变，比如用色氨酸代替甘氨酸。类似的微小的突变也可以是氨基酸的删除或插入，或同时删除和插入。确定哪些氨基酸残基应该被替代、插入或删除而又不影响生物学或免疫学活性的方法可以在现有的计算机软件中获得，例如，DNASTAR软件。
这里使用的“删除”是指氨基酸或核酸序列的变化，即一个或多个氨基酸或核酸残基分别地缺失。
这里使用的“插入”或“添加”是指与天然存在的分子相比，氨基酸或核酸序列的变化而分别导致了一个或多个氨基酸或核酸残基的增加。
这里使用的“替代”是指一个或多个氨基酸或核酸分别被不同的氨基酸或核酸替代。
术语“生物学活性”是指蛋白具有天然存在的分子在结构、调节、或生物化学等方面的功能。同样地，“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成的SARS蛋白或任何相关的多肽引发相应的动物或细胞特异性的免疫反应并与特定的抗体结合的能力。
这里使用的术语“激动剂”是指一种分子，当该分子与由SARS基因编码的蛋白结合时可以引发这些蛋白的改变从而调节这些蛋白的活性。激动剂可以是蛋白、核酸、碳水化合物或任何其他的能够与SARS蛋白或蛋白片段结合的分子。
这里使用的术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指一种分子，当该分子与SARS蛋白或蛋白片段结合时可以抑制或调节SARS蛋白的生物学或免疫学活性。拮抗剂和抑制剂可以是蛋白、核酸、碳水化合物或任何其他的可与SARS蛋白结合的分子。
这里使用的术语“调节”是指SARS蛋白的生物学活性的改变或变化。调节可以是蛋白活性的增强或降低，或结合特性的改变，也可以是SARS蛋白在生物学、功能或免疫学性质的任何其他的改变。
这里使用的术语“模拟物”是指一种分子，该分子的结构是通过SARS蛋白或其中一部分的结构的知识发展而来的，而成为具有部分或全部SARS蛋白活性的类SARS蛋白分子。
这里使用的术语“衍生物”是指发生在编码SARS蛋白的核酸或编码的SARS基因上的化学修饰。举例说明，这种化学修饰可以是氢被羟基、酰基或氨基基团取代。该核酸衍生物可以编码一种多肽，而该多肽保留了天然分子必要的生物学特性。
这里使用的术语“充分地纯化”是指从自然环境中分离到的核酸或氨基酸序列是与自然相关的其他的成分分隔或分开的，其纯度至少是60％，更好的达75％，最好能达到90％。
这里使用的“扩增”是指核酸序列的更多拷贝的生产，通常是通过众所周知的多聚酶链式反应(PCR)技术来实现的(Dieffenbach，C.W.and G.S.Dveksler(1995)PCR Primer，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)。
这里使用的“杂交”是指任何一条核酸链与一条互补链通过碱基配对结合的过程。
这里使用的术语“杂交复合体”是指两条核酸序列通过互补的碱基G与C之间和互补的碱基A与T之间形成氢键而结合成的复合体。这些氢键也可以通过碱基堆积效应而变得更加稳定。两条互补的核酸序列的氢键具有一种反平行的构象。这种杂交复合体可以在溶液中形成(如C.sub.Ot或R.sub.Ot analysis)，也可以是一条核酸序列在溶液中而另一条核酸序列被固定在一种固体支持物上(如膜、滤器、芯片、针尖或载玻片等，细胞被固定来进行原位杂交)。
这里使用的术语“互补的”或“互补性”是指在适宜的盐浓度和温度的条件下，多核甘酸通过碱基配对而自然结合。例如，序列”A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两条单链分子之间的互补性可以是“部分的”，即只有一些核酸结合，这种互补性也可以是完整的，即两条单链分子之间完全地互补。核酸链间的互补程度极大地影响着它们杂交的效率和强度。在扩增反应中这是尤其重要的，因为扩增反应依赖两条互补链的结合。
这里使用的术语“同源性”是指互补的程度。可以是部分同源，也可以是完全同源(如，一致性)。一条部分互补的序列至少能够部分地抑制一条同样的序列与目标核酸杂交；这种序列也可以用功能术语“充分同源”来表示。完全互补序列与目标序列的杂交被抑制情况可以通过低严谨性的杂交实验来检测(Southern或northern blot、溶液杂交和其他类似的实验)。在低严格度条件下，一条充分同源的序列或探针可以与完全同源的序列和探针竞争并抑制完全同源的序列的结合(也就是杂交)。这并不是说低严格度的条件下允许非特异性的结合的发生；低严格度条件需要两个序列之间的结合是特异性的(也就是，选择性的)反应。是否没有非特异性的反应需要用第二条目的序列来检测，该目标序列应是只有小部分的互补性的(如相似性低于30％)；由于没有非特异性结合，那么探针就不会与第二条非互补的目标序列杂交。
众所周知，许多相当的条件因素都可以用来构成低严格度或高严格度的条件。许多因素如序列的长度和性质(DNA、RNA、碱基复合物)，目标序列的性质(DNA、RNA、碱基复合物、存在于溶液中还是固定等)、盐和其他组分的浓度(如甲酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙烯乙二醇的存在与否)等都应被考虑在内，杂交溶液的不同会产生出虽与上述条件不同却相当的低严格度或高严格度的条件。
这里使用的术语“严谨性”是指“从低于Tm-5℃(低于探针解链温度5℃)到低于Tm20-25℃之间的”严格度”。具备专业知识的人员都能理解，杂交的严格度是可以改变的，用来鉴别或检测同样的或相关的多核甘酸序列。
这里使用的术语“反义”是指与一条特定的DNA或RNA序列互补的核甘酸序列。这里使用的术语“反义链”是指与“正义”链互补的核酸链。反义分子可以通过任何方法生成，包括通过将感兴趣的基因与一个支持互补链合成的病毒启动子反向连接来合成。一旦进入细胞，这条转录链就会和细胞内生成的天然序列结合成二聚体。然后这些二聚体就会抑制进一步的转录或翻译。通过这种方式就可以产生突变的表型。“阴性”有时用来指反义链，而“阳性”有时用来指正义链。
这里使用的术语“部分”是针对一种蛋白而言的(如“某特定蛋白的一部分”)，是指该蛋白的片段。该片段的大小可以从4个氨基酸残基到只比整个氨基酸序列少一个氨基酸。因此该“至少含有SARS蛋白的一部分氨基酸序列”的蛋白包括全长SARS蛋白及其片段。
这里定义的“转化”是指外源DNA进入和改变受体细胞的过程。这个过程可以在自然或人工的条件下通过众所周知的各种方式来实现。转化可以依赖于任何现有的将外源核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的方法。该方法是基于宿主细胞被转化的情况来选择的，可以包括但不仅限于以下这些方法病毒侵染法、电穿孔法、脂质转染法和粒子轰击法。这种“转化”的细胞包括稳定的转化细胞，即插入的DNA能够作为可以自主复制的质粒或是作为染色体的一部分来进行复制。同时也包括仅在有限的时间里瞬时表达插入的DNA或RNA的转化细胞。
这里使用的术语“抗原决定簇”是指与特定的抗体联结的分子的一部分(即一个抗原表位)。当用一种蛋白或蛋白的一部分来免疫宿主动物，该蛋白的许多区域都可以引发抗体的产生，而这些抗体能够与该蛋白的特定区域或三维空间构象相结合；这些区域或构象就是所说的抗原决定簇。抗原决定簇可以与完整的抗原(即用来刺激免疫反应的免疫原)竞争性地与抗体结合。
这里使用的术语“特异的结合”或“特异性结合”是当提及抗体与蛋白或多肽之间的相互作用时特指这种相互作用是依赖于蛋白分子上的存在的一种特定的结构/构象(即抗原决定簇或抗原表位)的；换句话说就是，抗体是在识别和结合一种特定的蛋白质结构/构象而不仅仅是蛋白本身。例如，如果一种抗体对表位A是特异的，那么在含有被标记的“A”和抗体的反应体系中加入一种带有表位A的蛋白(未标记的A)就会降低标记的A与抗体结合的水平。
这里使用的术语“样本”是广义的概念，是指任何可能含有编码SARS蛋白及其片段的核酸的生物样本，包括细胞、从细胞中分离的染色体(如细胞分裂中期的染色体)、基因组DNA(处于溶液中或像在Southern分析实验中一样结合于固体支持物上)、RNA(处于溶液中或像在Northern分析实验中一样结合于固体支持物上)、cDNA(处于溶液中或结合于固体支持物上)、细胞或组织的提取物，等等。
这里使用的术语“与多核苷酸表达相关”是指在Northern分析实验中检测到与被SARS病毒编码的多核苷酸相似的核糖核酸预示样本中存在着编码SARS蛋白的mRNA，从而与编码该蛋白的多核苷酸的转录物的表达相关。
这里使用的由SARS基因编码的多核苷酸的“改变”包含了SARS基因编码的多核甘酸序列的任何改变，包括删除、插入和可以用杂交实验来检测的点突变。这个定义中还包含有编码SARS蛋白的基因组DNA序列的改变的检测、SARS病毒编码的多核苷酸片段与基因组DNA样本杂交的能力的缺失(如使用等位的特异寡核甘酸)以及不正确或意外的杂交，如杂交发生在编码SARS蛋白的多核苷酸序列的正常染色体位点以外的位点(如对分裂中期染色体进行荧光原位杂交)。
这里使用的术语“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如能够与抗原决定簇结合的Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段。与SARS蛋白结合的抗体能够用完整的多肽或小的肽段作为免疫原来制备。用来免疫动物的多肽或肽可以用相应的RNA翻译合成或用化学的方法直接合成，如果需要的话，也可以与载体蛋白结合。通常使用的载体是与多肽通过化学键联结的，包括牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白。然后联结的多肽就可以用来免疫动物(如小鼠、大鼠或兔子)。
这里使用的术语“人源化抗体”是指非抗原结合区的氨基酸被替代的抗体分子，以此使它更接近人类的抗体，但仍保留原始的结合特性。
这里使用的术语“载体”是指任何能在适宜的环境下(如细胞和体外的不含细胞的转录/翻译系统)表达多肽的核苷酸或核酸序列。载体包括但不仅限于DNA质粒、病毒表达载体和RNA复制子。
优选实施例详细描述本发明提供了一种预防和治疗SARS的新型疫苗的设计，包括SARS冠状病毒的单一或多基因和基因片段、基因产物、蛋白和蛋白片段。
SARS病毒的基因组为单股正链RNA，由于RNA依赖的RNA聚合酶的低保真性，SARS基因组可能会经历快速突变。事实上，世界上几个研究机构已经对SARS冠状病毒的基因组进行了测序，并且将结果提交至数据库，如GenBank。标准的序列比对显示，不同病毒分离株之间存在少数序列改变。
对于突变率高的病毒，其有效疫苗的开发存在巨大挑战，因为对某一株病毒的免疫反应提高，可能对其它变异株没有效果。SARS病毒也会出现同样的问题。为了将病毒变异带来的影响降到最低，可以同时将SARS病毒基因组的多基因或蛋白选为疫苗的靶标。
在本发明的一个实施例中，能够表达一个或多个SARS基因编码产物，或其中一段片段或其衍生物的载体，可以作为疫苗以预防或治疗SARS。这些基因包括刺突糖蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、复制酶1A、复制酶1B、小包膜E蛋白、orf3、orf4、orf6、orf8、orf9、orf10、orf11、orf13和orf14，但不限于此。这些基因称为SARS基因(见定义)。其中部分基因已有描述(Marra，MA等，2003，Sciencexpress.1-5)。疫苗的制作方法也有描述(Raz，E等1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，9519-9523；Donnellly，J.J等，1996，J.Infect.Dis.，173，314-320)。在一个具体的实施例中，一个能够表达S和N，或其片段，或其衍生物的载体，可以用作预防或治疗SARS的疫苗。
在另一个实施例中，两个或更多的SARS蛋白(见定义)或片段或其衍生物，能在一个合适的宿主中表达，可用作预防和治疗SARS的疫苗。
在另一个实施例中，一个能够表达两个或多个SARS基因片段或其衍生物的融合蛋白的载体可以用作预防和治疗SARS的疫苗。这些基因可以直接连接，或通过一个或多个氨基酸的连接子连接。
在另一个实施例中，一个能够表达病毒表面蛋白细胞外结构域或其衍生物的融合蛋白载体，可以作为预防和治疗SARS的疫苗。这些病毒表面蛋白包括刺突糖蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、小包膜蛋白(E)、orf3和orf8，但不限制与此。在一个具体的实施例中，一个能够表达S和orf8细胞外结构域，或基因片段，或其衍生物的融合蛋白载体，可以用作预防或治疗SARS的疫苗。
在另一个实施例中，S、M、E、orf8和orf3的两个或多个基因的细胞外结构域，或其片段，或其衍生物可以融合在一起，在合适的机体中以融合蛋白的形式表达，可以作为预防或治疗SARS的疫苗。在详细实施例中，S和orf8的细胞外结构域，或者一个片段或其衍生物可以融合在一起，并可以表达出融合蛋白，用于预防或治疗SARS。
在另一个实施例中，一个能够表达SARS融合蛋白的联合物，或片段，或其衍生物，和单个SARS蛋白或蛋白片段的载体能用于预防和治疗SARS。
任何编码SARS基因的核酸序列，或其片段，可以用作产生表达SARS基因或其片段的重组分子。在详细实施例中，本发明包括编码S、orf8和N的多聚核苷酸的应用。
本行业技术人员很欣赏遗传密码的兼并性，因为这样可以产生众多与任何已知的和自然存在的基因同源性很小的编码SARS基因的核酸序列。因此，本发明充分考虑到每个可能的核酸序列变异，根据可能的密码子选择，通过选择不同组合核酸密码子而达到发明目的。依据标准三联体遗传密码应用于自然存在的SARS基因的状态来设计密码子组合，对考虑到的这些变异下面将有具体描述。
在恰当的严格度条件下，编码SARS基因的核酸序列和其变异体都可以很好的与自然产生的SARS基因片段杂交，但是在某些时候选择使用不同于自然产生的密码子可能更有利。在个别原核和真核细胞宿主中，可以按照宿主密码子的使用频率来选择独特的密码子，从而增加其表达率。改变SARS基因和其衍生物的核酸序列而不改变编码的氨基酸序列的其他原因包括由它得到的RNA转录产物比由自然存在序列转录得到的产物拥有更好的特性，比如半衰期更长。
编码SARS基因的DNA序列或其部分序列或其衍生物都可以通过化学合成方法得到，合成的序列可以插入任何可用的表达载体和细胞系统。另外，用化学合成的方法将编码SARS基因的序列引入突变，在本发明中包括缺失、插入、或者替换不同的核苷，结果可以产生编码相同的或功能相同的蛋白。编码的蛋白也可能包含缺失、插入、或氨基酸残基的替换，这将产生无义突变，结果产生功能等同的SARS基因。根据氨基酸残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性分子的特点，可以进行有目的性的氨基酸替换，只要这些蛋白相应的生物学活性可以保留，如免疫原性，但不限制于此。例如，带正电的氨基酸可以为天冬氨酸和谷氨酸，带负电的氨基酸可以为赖氨酸；不带电荷极性的氨基酸群具有相似的亲水性，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、甘氨酸和丙氨酸、谷氨酸盐、丝氨酸和苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明的范围还包括编码SARS基因的等位基因的使用。正像此处所用到的，一个“等位基因”或“等位基因的序列”是基因可以选择的形式，这可能是由于核酸序列的至少一个突变造成的。等位基因可能造成mRNA或多肽的改变，其结构或功能可能改变也可能不改变。任何已知的基因可能不存在，也可能存在一个或多个等位基因形式。可导致等位基因的常规突变通常是核苷的自然缺失、添加、或者替换。这些突变形式可以单独发生，也可以与其他一起发生，可以一次或多次出现于一个已知序列中。
DNA测序的方法是本行业熟知和常用的方法，且可以应用于本方明的任何实施例。该方法使用的酶有Klenow片段DNA聚合酶I、SEQUENCE DNA聚合酶(美国BiochemicalCorp，Cleveland，Ohio)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐热T7聚合酶(Amersham，Chicago Ill)、或联合应用重组聚合酶和具有校正功能的核酸外切酶，如ELONGASE扩增系统(GIBCO/BRL，Gaithersburg，Md)。优选地，测序过程可以在机器上自动进行，如HamiltonMICROLAB 2200(Hamilton，Reno，Nev.)，Peltier热循环仪(PTC200，MJ Research，Watertown，Mass.)和ABI 377DNA测序仪(Perkin Elmer)。
编码SARS基因、基因产物、融合蛋白或其功能相似物的多聚核苷酸序列或其片段可以用于重组DNA分子，在适当的宿主细胞中，可以指导蛋白表达。由于遗传密码兼并性，可能产生其他编码十分相似或功能等同的氨基酸序列的DNA序列，这些序列可以用于克隆和表达这些蛋白。
正像本行业技术人员所理解的，使用非天然存在的密码子，可能有助于产生编码SARS基因的核苷序列。例如一个特殊的原核和真核宿主可能优选一些密码子，以增加蛋白表达的效率或产生优化的的重组RNA转录体，例如其半衰期比天然存在的序列产生的转录体要长。
为了不同的目的改变SARS基因编码的序列，可以使用本行业技术人员所熟知的技术改造核苷序列，包括对克隆的修饰、加工、和/或基因产物的表达，但不限制于此。随机片段DNA重排，基因片段的PCR重组和寡核苷酸的合成可以用于改造核苷酸序列。例如定点突变可用于插入新的限制性内切酶位点，改变糖基化模式，改变密码子偏向性，产生剪切变体或者引入突变等。
在发明的另一个实施例中，编码SARS基因的天然的，修饰后的或重组的核苷酸序列可以连接于异种序列，以编码融合蛋白，用于SARS的诊断，预防和治疗。例如，从多肽库中筛选蛋白抑制子，SARS嵌合体基因可能是有用的，因为商品化的抗体可以认知此融合蛋白。构建融合蛋白时，可以在SARS基因编码序列和异源序列之间加入剪切位点，这样S或ORF8可以从异源部分中剪切和纯化出来。
可以采用本领域熟知的化学方法完全或者部分合成编码SARS基因的序列(参见Caruthers，M H.等，1980，Nucl.Acids Res.Symp.72315-223；Horn，T.等，1980，Nucl.AcidsRes.Symp，7225-232)。也可以选择化学方法合成SARS基因或其部分的氨基酸序列。例如使用不同的固相技术(Roberge，JY.，1995，Science.269202-204)和自动合成技术进行肽的合成，例如使用ABI公司的肽合成仪(Perkin Elmer)。
新合成的肽可以通过高效液相色谱技术高度纯化(如，Creighton，T.1983，Proteins，Structures and Molecular Principles，WH Freeman and Co.，New York，N.Y.)。合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序来证实(如Edman降解法，Creghton，supra)。此外，在直接合成时，和/或用化学方法与其他蛋白全序列或部分序列连接，产生一个变体肽时，SARS基因氨基酸序列或其任何部分，都可能发生改变。
为了表达一个具有生物学活性的SARS基因，可以将编码SARS基因或其功能相似物的核苷序列插入适当的表达载体，载体包括插入序列所必需的转录和翻译元件。
使用本行业技术人员所熟知的方法，可以构建包含编码SARS基因序列和适当转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内遗传重组技术。上述方法可参考Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，and Ausubel，F.M.et al.(1989)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.。
可以容纳和表达编码SARS基因或基因产物的序列的表达载体和宿主系统有许多种，包括微生物，如转化了重组噬菌体，质粒或粘粒DNA表达载体的细菌，酵母表达载体转化的酵母，感染病毒表达载体(如腺病毒或杆状病毒)的昆虫细胞系统，转化病毒表达载体(如花椰菜镶嵌体病毒，烟草花叶病毒)的植物细胞系统，或转化细菌表达载体(如Ti或Pbr322质粒)的植物细胞系统，或动物细胞系统，但不限于此。
“控制序列”或“调控序列”是载体增强子、启动子、5′和3′非翻译区，这些区域与宿主细胞蛋白相互作用，以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能不同。根据所使用的载体系统和宿主不同，可以使用合适的转录和翻译元件，这些元件包括基础的和可诱导的启动子。例如，当克隆入细菌系统，像BLUESCRIPT phagemid的杂合lacZ诱导型启动子(Stratagene，LaJolla，Calif)或PSPORT1质粒(Gibco BRL)，或其类似产品都可以使用。在昆虫细胞中可以使用杆状病毒启动子。来源于植物细胞基因组的启动子、增强子(如热休克，RUBISCO，和贮存蛋白基因)或植物病毒(如病毒启动子或先导序列)可以克隆入载体。在哺乳动物细胞系统中，优选来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果必须获得包含编码SARS基因序列多个拷贝的细胞株、可以使用带有适当选择性标记的基于SV40或EBV的载体。
在细菌系统中，根据SARS基因使用的目的，可以选用多种表达载体。例如，当需要大量的SARS基因诱导抗体时，可以使用容易纯化的，直接影响融合蛋白高水平表达的载体。类似载体有多功能E.coli克隆表达载体，如BLUESCRIPT phagemid(Stragene)，可以将编码SARS基因的序列插入载体，SARS基因的N-末端蛋氨酸在载体的阅读框内，C-末端紧随7个残基的β-半乳糖苷酶。也可以选用pIN载体(Van Heeke，G.and S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)和类似PGEX载体(Promega，Madison，Wis.)以融合蛋白的形式表达具有谷胱甘肽转移酶(GST)的杂合蛋白，但不限于此。一般情况下，这些蛋白是可溶性的，可以方便的从裂解细胞中获得，可将其通过柱子，使其吸附于谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠，在无谷胱甘肽存在时即可洗脱。设计用于该系统产生的蛋白有肝磷脂、凝血酶、XA因子蛋白酶剪切位点，这样，目的蛋白可以轻易的从杂合体中释放。
在酵母，啤酒酵母中，有许多携带组成型或诱导型启动子的载体可被使用，这样的启动子如a因子，乙醇氧化酶和PGH等。参见Ausubel等，(supra)和Grant等，(1987)，Methods Enzymol.153516-544。
在使用植物表达载体的例子中，可以使用多数启动子来启动编码SARS的基因序列的表达。例如病毒启动子，CaMV的35S和19S启动子可以单独使用，也可以与TMV的ω先导序列联合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6307-311)。另外也可以使用植物启动子，像RUBISCO的小亚单位，或热休克启动子。(Coruzzi，G等，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie，R.等，1984，Science 224838-843；Winter，J.等，1991，Results Probl.Cell Differ.1785-105)。这些构建好的载体可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染而引入植物细胞。这些技术在一些综述中有描述(参见如Hobbs，S或Murry，L.E.inMcGraw Hill Yearbook do Science and Technology(1992)McGraw Hill，New York，N.Y.；pp.191-196)。
昆虫系统也可以用来表达SARS基因。例如，在这样一个系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为载体，可以在草地夜蛾细胞或粉蚊蛾幼虫中表达外源基因。编码SARS基因的序列可以克隆入病毒的非必需部位，例如romote n基因，将其放入romoten基因的控制下。SARS基因的成功插入将使得romote n基因灭活，产生缺乏包膜蛋白的重组病毒。将重组病毒感染草地夜蛾细胞或粉蚊蛾幼虫，以表达S或ORF8(Engelhard，E.K.et al.(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.913224-3227)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以采用多种以病毒为基础的表达系统。在使用腺病毒作为载体的例子中，编码S或ORF8的序列可以与由晚期启动子和三联先导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体连接。在病毒基因组非必需的E1和E3部位插入片段可以获得一个有活力的病毒，该病毒能在感染的宿主细胞中表达SARS基因(Logan，J.and Shenk，T，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659)。此外，转录增强子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子，可以用来增加哺乳动物宿主细胞的表达。
特异的起始信号可以提高编码SARS基因序列翻译的效率，这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在编码SARS基因序列的例子中，将其起始密码子和上游序列插入适当的表达载体，不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在只有编码序列或部分插入时，需要提供包括起始密码子ATG在内的外源翻译控制信号。此外，起始密码子必须位于正确的读码框，以确保整个插入序列的正确翻译。外源翻译元件和起始密码子来源可能不同，但都是天然的或合成的。正像文献中所描述的，在特定的表达系统中加入增强子，其表达的效率可以增加(Scharf，D.等，1994，Results Probl.Cell Differ.20125-162)。
另外，可以根据调控插入序列表达或者按照所要求的方式加工蛋白的能力，选择宿主细胞株。这些多肽的修饰包括，乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化，和酰化，但不限于此。翻译后加工可以是剪切蛋白前体，也将有利于校正插入、折叠和/或功能。不同的宿主细胞，如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，针对翻译后修饰活动，都有其独特的细胞器和机制特点，可以根据需要进行选择，以确保外源蛋白正确的修饰和加工。
长期来看，重组蛋白产量高，且能稳定表达是首选。例如，稳定表达SARS基因的细胞株可以通过转化包含病毒来源的复制元件和/或内部表达元件，以及一个选择性标记基因的表达载体来获得，这些元件和标记基因存在于同一个载体或独立的载体中。在引入这些载体以后，细胞在丰富的培养基中培养1-2天，之后转移至选择性培养基中。选择性标记的目的是抗性选择，其存在允许成功表达了引入序列的细胞的生长和获得。只要使用适合细胞类型的组织培养技术，稳定转化细胞的抗性克隆可以扩大培养。
为了获得转化细胞株，多数的选择系统可以使用，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等，1977，Cell.11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，I.等，1980，Cell.22817-23)，分别用于tk或aprt细胞，抗代谢物、抗生素、或除草剂也可以用作抗性选择标记，例如dhfr对甲氨蝶呤的抗性(Wigler，M.等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)，npt对氨基糖苷新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F.等，1981，J.Mol.Biol.1501-14)，als或pat分别对氯磺隆和PPT乙酰转移酶的抗性(Murry，supra)，但不限制于此。其它可以选择的基因也有描述，如trpB基因，可以使细胞用吲哚替代tryptolphan；hisD基因，可以使细胞使用histinol替代组氨酸(Hartman，S.C.and R.C.Mulligan(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.858047-51)。近来，大家都喜欢使用可视的标记，如花色糖苷，β-葡萄糖苷酸酶和其底物GUS，荧光素酶和其底物荧光素，其使用广泛，不但是为了鉴定转化子，而且也是为了确定某一特定载体系统瞬时或稳定表达蛋白的数量(Rhodes，C.A.等，1995，Methods Mol.Biol.55121-131)。
尽管标记基因是否表达可以显示目的基因是否存在，但是其存在和表达同样需要证实。例如，如果编码SARS基因的序列插入标记基因里，则标记基因功能的缺失，可以用来鉴定重组细胞能否表达SARS基因。或者，将SARS的S或ORF8基因和标记基因串联排列于一个启动子下游，则在药物诱导和选择性培养的条件下，标记基因的表达通常也预示了SARS基因的表达。
另外，包含编码SARS基因核苷酸序列的宿主细胞表达SARS基因的鉴定方法是本行业技术人员所熟知的，包括DNA-DNA或DNA-RNA杂交、如膜和溶液等的蛋白生物测定或免疫测定技术，以及核酸或蛋白检测和/或定量的芯片技术，但不限制于此。
编码SARS基因序列的多聚核苷酸可以通过DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交，或用编码SARS基因的多聚核苷酸探针、其部分序列或片段进行扩增的方法来检测。使用编码S或ORF8序列的寡核苷酸或寡聚物进行核酸扩增试验，以检测包含编码S或ORF8的DNA或RNA的转化子。此处所用的，“寡核苷酸”或“寡聚物”指至少包含10个核苷酸的序列，最多约为60个核苷酸的序列，优选约15-30个核苷，最优选约为20-25个核苷，这些“寡核苷酸”或“寡聚物”可以用作探针或扩增引物。
检测和测定S或ORF8表达的方案有很多种，通常是使用本行业所熟知的针对某蛋白的多克隆或单克隆抗体的方案，例如.酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验(RIA)、流式细胞仪(FACS)。首选应用两个单克隆抗体分别认知两个互不干扰的SARS基因表位的免疫分析方法，也可以用竞争性birding实验的方法。上述分析方法见Hampton，R.et al.(1990；Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，Minn.)和Maddox，D.E.et al.(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)。
本行业的技术人员所熟知的多种多样的标记和耦连技术，可以用于不同的核酸和氨基酸试验。探针标记方法包括标记寡聚物，缺口翻译，末端标记或用一种标记的核苷酸进行PCR扩增，这些探针为杂交或PCR探针，用于检测与编码SARS基因的多核苷酸相关的序列。另外，SARS基因或其它任何蛋白基因都可以克隆进载体，获得mRNA探针。如此的载体已经商品化，给予合适的RNA聚合酶如T7，T3或SP6和标记的核苷酸后，能够在体外合成RNA探针。制备方法可见商业试剂盒说明(Pharmacia&Upjohn，(Kalamazoo，Mich.)；Promega(Madison Wis.)；and U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，Ohio)。合适的标记物和报告分子包括放射性核素，酶，荧光素，化学发光物质，生色基团和底物，辅因子，抑制物，磁珠等。
转入了编码SARS基因核苷酸序列的宿主细胞的培养条件，应适于蛋白的表达，并且适于从细胞培养液中收获蛋白。根据所使用的序列和/或载体的不同，重组细胞产生的蛋白可以分泌的形式或包涵体的形式存在。正像本行业技术人员所熟知的，编码SARS基因的多聚核苷酸表达载体，多含有信号序列，它可指导蛋白分泌到原核或真核细胞膜外。其他重组体可以将编码SARS基因的序列与一段编码多肽结构域的序列相连，该多肽结构域有利于可溶性蛋白的纯化，这些结构域包括金属螯合肽，如组氨酸-色氨酸分子可以在固化的金属上纯化，蛋白A可以在固化的免疫球蛋白上纯化，或利用FLAG延伸/亲和系统纯化(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)，但不限制于此。纯化的结构域和SARS基因之间的可以剪切的连接子序列有利于纯化，这样的序列如特异的XA因子和肠激酶(Invitrogen，San Diego，Calif.)。类似的表达载体可以提供包含SARS基因和一个编码6个组氨酸残基的融合蛋白的表达，这6个组氨酸残基可以位于硫氧还蛋白或肠激酶剪切位点之前。组氨酸残基有利于IMIAC(固定金属离子亲和色谱，见Porath，J.等，1992，Prot.Exp.Purif.3263-281)的纯化，然而，肠激酶剪切位点提供了一种从融合蛋白中纯化SARS基因的方法。融合蛋白载体的讨论见Kroll，D J.等(1993，DNA Cell Biol.12441-453)。
除了重组蛋白的产生之外，SARS基因片段可以使用固相合成技术直接进行肽的合成(Merrifield J.，1963，J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。蛋白合成可以使用操作指南提供的方法，或自动化合成技术。自动化系统有许多种，如使用ABI 43 IA肽合成仪(PerkinElmer)，不同的SARS基因片段，可以分别进行化学合成，并使用化学方法连接，以产生全长分子。
SARS基因的特异性抗体，可以作为靶标或传送工具，引导药学试剂至细胞或组织，表达S或ORF8。
在另一实施例中，任何治疗性蛋白、拮抗物、抗体、激动剂、反义序列或如上所述的载体，可以与其他适当的治疗试剂联合使用。根据常规制药原则，在联合治疗中，适当试剂的选择是本行业中一般技术之一。治疗试剂联合使用可以相互协同作用于治疗或预防阶段的不同紊乱现象。使用这种方法，每种试剂采用较低的剂量可能就会出现治疗效果，因此减少了潜在的副反应。
将可以高水平表达S或ORF8片段的载体转化细胞或组织，SARS基因的表达可能被关闭。这样的载体将可能引入了非翻译的正义或反义序列，即使没有整合入DNA序列，载体也可以继续转录出RNA分子，直到它们被内源性核酸酶失活。具有非复制型载体时，瞬时表达可能持续一个月或更长时间，如果载体系统中有适当的复制元件时，持续时间可能更长。
将载体引入细胞或组织的方法有许多种，而且这些方法同样适用于体内、体外、或活体外。对于活体外治疗，可以将载体引入患者干细胞，克隆增殖后再经自体移植，反输入同一患者。使用本行业所熟知的方法，可以通过转染和脂质体注射来实施传输。
上述任何治疗方法可以应用于需要治疗的任何对象，包括，哺乳动物如狗、猫、牛、马、兔、猴，首选人类。
针对上述任何治疗效果，发明的另一个实施例与药物成分和药物的载体联合给药有关。这些药物成分包括S或ORF8、S或ORF8的抗体、类似物、激动剂、拮抗剂、或S或ORF8的抑制剂。这些成分可以单独给药，或与至少一种其他试剂联合给药，如稳定剂。这些稳定成分可以在任何无菌、生物学相容的载体中给药，这些载体包括盐、缓冲盐、葡萄糖和水，但不限制于此。这些可以单独给药，或者与其他试剂、药物或激素联合给药。
本发明所使用的药物成分的给药途径有多种，包括口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓质内、鞘内、心室内、皮内、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下、或直肠给药的方法，但不限制于此。
除了活性成分外，这些药物成分可能包括适当的药物相容性载体，包括赋形剂、辅助物，这些成分有利于将药物成分加工成药学上使用的配制品。关于配方和给药技术的具体细节可以在Remington药物科学(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)中找到。
口服给药的药物成分的配方设计可以使用本行业所熟知的药物相容性载体，按照口服给药的适合剂量给药。这些药物成分可以设计成片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶体、糖浆、浆、悬浮物，或者相似物，方便患者摄取。
口服药物配制品可以通过活性成分与固体赋形剂联用的方式获得，任选的，磨成混合物的形式，加工混合物小粒，加入适当的辅助物，如果需要，可以加工成药片或糖衣丸核心。适当的辅助物是碳水化合物或蛋白质装填物，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖、或山梨醇、玉米、小麦、稻、马铃薯或其它植物淀粉，纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠，橡胶包括romot和黄芪胶，蛋白包括凝胶和胶原质。如果需要，可以加入分解或溶解试剂，如交联聚乙烯比咯烷酮，琼脂，海藻酸，或其盐，如海藻钠。
糖衣丸核心使用时可与适当的包膜相连，如浓缩的糖溶液，可能也饱含胶romot，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波沫胶，聚乙烯乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。在药片或糖衣丸包膜可以加入染料或色素，为了药物辨认或为了说明有效成分的数量，如剂量。
可以口服使用的药物配制品包括由凝胶制成的容易服用的胶囊，也有软的、密封的凝胶制成的胶囊和包膜，如甘油或山梨醇。容易服用的胶囊可能包括活性成分与填料或粘合剂，例如乳糖或淀粉，润滑剂如滑石或镁硬脂酸盐和任选的稳定剂。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮于适当的液体中，如油脂、液体、或聚乙烯乙二醇液体，是否存在稳定剂都可。
非肠道给药的药物配方设计可以以水溶液的形式，尤其是与生理相容的溶液，如Hawks溶液，Ringer溶液或生理缓冲盐溶液。水溶液中也可加入增加粘性的物质，如羧基纤维素钠、山梨醇或右旋糖苷。另外，活性成分悬浮物可以制备为适当的油性注射悬浮物，或合成的脂肪酸酯，如乙烷油酸盐、甘油三酸酯或脂质体。可选的，悬浮物也可以包含适当的稳定剂或可以增加可溶性物质，便于制备浓度更高的溶液。
对于局部或鼻腔给药，在配方设计中，允许使用针对具体屏障的适当渗透剂。这些渗透剂是本行业中一般使用的。
本发明中的药物成分可以按照本行业中所熟知的一种方法制备，如常规的混合、溶解、粒化、糖衣丸制作、研碎、乳化、装入胶囊、包埋或冻干处理。
药物成分可以以盐的形式提供，可以与许多酸一起组成，包括盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等，但不限制于此。与相应的自由基形式相比，在水溶液中或其他质子溶液中，盐更容易溶解。在其它例子中，优选的制备物是冻干粉状，包括任何/或所有下列物质1-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖和2-7％的甘露醇，pH范围在4.5-5.5，与前述缓冲液联合使用。
在药物成分制备好后，可以放入适当的容器中，并打上标签，指出适应症。对于S或ORF8的给药，这些标签应包括数量、频率和给药的方法。
本发明中使用的药物成分包含了活性成分的有效剂量。有效剂量的测定是本行业中技术人员所熟知的。
对任何成分，在细胞培养试验(如瘤细胞)或动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中，都可以对治疗有效剂量进行最初估计。也可以使用动物模型来测定合适的浓度范围或给药途径。这些资料也可以作为测定人类有效剂量和给药途径的参考。
治疗的有效剂量指活性成分的数量，包括SARS基因或其片段，SARS基因的抗体、激动剂、拮抗剂，S或ORF8的抑制剂，这些有效成分会改善症状。治疗效果和毒性可以通过标准的药物试验方法来进行细胞培养和试验动物试验，如ED50(半数有效量)和LD50(半数致死量)。治疗和毒性效果的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50/ED50。通常会选用有高的治疗指数的药物成分。从细胞培养试验和动物试验获得的数据可以用于设计人用剂量范围。在循环中的药物的有效剂量应达到ED50量而且有很少或没有毒性。根据所使用的剂量形式，患者的敏感性，以及给药途径，有效剂量通常会有所变化。
根据需要治疗对象的具体情况，由医生确定确切的剂量。剂量和给药要经过适当调整，以便得到足够的活性部分或者想要的治疗效果。应该考虑到下列因素疾病的严重性，对象的总体健康状态、年龄、体重和性别，饮食、给药的时间和频率、药物联合物、反应敏感性和对治疗的耐受/反应。根据具体配方的半数存活和清除率不同，长效药物可以每隔3-4天给药，隔周或隔两周给药。
由于给药途径的不同，正常用药量从0.1-100,000ug不等，有时可以高达1g。关于给药的具体剂量和方法，本行业的医生可以从一般文献中获得。本行业的技术人员将使用不同的核苷药物配方，而不是蛋白或抑制剂。同样，多聚核苷或多聚肽的给药方式应根据具体的细胞、状态和位置等来确定。
为了更全面的说明本发明的优点，给出下列实施例。应理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是限制发明的范围。
按照下列两个原则设计合成基因1)包括与病毒吸附和感染可能相关的表面蛋白；2)至少包括一个相对保守的蛋白。
根据预测的SARS-CoV基因组序列，选择了S1和orf8两个表面蛋白。突起蛋白的S1域调控病毒粘附到细胞表面，orf8蛋白功能未知，但是具有一个深长的细胞外结构域，也可能与病毒感染有关。N蛋白是相对非常保守的蛋白，已经表明它能强烈活化T辅助细胞功能，因此，该基因包含于基因包装中。
为了同时表达3个蛋白，S1和orf8的结构域与一个灵活的连接子融和，该连接子有助于蛋白独立的折叠。
通过一个核糖体进入位点(IRES)，N蛋白在转录时与S1-orf8融和蛋白融和。如图1所示，通过一个CMV启动子，两个蛋白可以同时表达。
如上所述，病毒与人的密码子偏向性有很大不同。许多病毒，像HIV和HPV，在其编码序列中，G-C含量较低。相反，人类基因的G-C含量较高，密码子的第三位碱基尤其如此。偏向于具有较高G-C含量的密码子时，可能是由于各自密码子的细胞内tRNA的浓度较高，这样蛋白可以更有效的翻译。此外，高G-C含量与mRNA稳定性高有关，这可以增加目的蛋白的表达。
使用优选的人密码子对目标抗原编码序列进行优化，以确保有效转录，如图2所示，SARS-CoV S和N基因G-C含量较低，在第3个碱基位置G-C含量少于40％，有典型的病毒偏向性；相反，G-C百分比在高效表达的人类蛋白中为77％。
在第3个碱基位，优选基因的平均G-C含量为66％，使之符合人类平均百分比。为了进一步优化合成基因，使用内含子-外显子连接区法则对潜在的选择性mRNA剪切位点进行鉴定。通过沉默突变对这些位点进行去除，以确保仅表达正确的目标蛋白。
在一个优选的实施例中，S1结构域和orf8细胞外结构域融和，如图3所示。在融和蛋白的N末端加入一个IgK分泌信号，这样融合蛋白可以分泌出来，产生更多潜在的抗体反应。如图3所示，这些融合蛋白的序列已经经过优化，对灵长类优化表达。这些融合蛋白的氨基酸序列见图4。
在另一个优选的实施例中，N蛋白序列经过优化，见图5。相应的氨基酸序列如图6所示。
将这些合成基因克隆入不同的载体，包括病毒和质粒载体。
在一个试验中显示了DNA质粒载体(SV1000)疫苗的有效性。使用100ug无内毒素的DNA质粒SV1000，于第0周，2周，5周免疫6-8周的雌性Balb/c小鼠，在第3周和第6周收集血清样本。在实验终止的第6周收集总淋巴细胞。大多数小鼠在3周前出现血清转换现象，尽管抗体滴度相对较低。在第6周时，抗体滴度上升至1∶640，这与文献中报道的其他DNA疫苗诱导抗体反应的范围一致。
同时检测了一份血清样品中和活SARS病毒感染Vero E6细胞的能力。在感染Vero E6细胞之前，将血清作2倍系列稀释，与病毒孵育。经过计算，最终中和滴度约为1∶300。
使用IFNg特异的ELISPOT试验对抗原特异性T细胞反应进行定量。合成一个覆盖2个全长基因并有10个氨基酸的重叠的20-mer的多肽。分别用12个肽库刺激免疫小鼠的全部淋巴细胞反应。如图7所示，针对疫苗的多个区域，SV1000能够诱导潜在的Th1 T细胞反应。重要的是，S1-orf8和N的区域被识别，表明这两个基因在体内都表达，并参与产生特异的免疫反应。
同时也构建了一个带有合成基因的重组5型腺病毒，即SV8000。如图8所示，单一注射SV8000引起了小鼠很强的免疫反应，抗体滴度超过1∶1000。这一反应也是剂量依赖的，在1E9病毒粒子中诱导了很强的抗体反应，超过1E8病毒粒子。
IFNg T细胞反应也通过ELISOPT进行了分析。如图9所示，单一注射SV8000，合成基因的众多区域诱导了潜在的T细胞反应。反应的程度明显大于SV1000 DNA疫苗诱导结果。有趣的是，疫苗剂量和T细胞反应之间没有线性相关关系。IE8粒子诱导的T细胞反应最强，然而，无论是1E9还是1E7粒子，免疫小鼠后，免疫反应都比较弱。
最近的研究表明，不同的引物-增强方式能够大大增强任何单一疫苗成分产生的免疫反应。当DNA疫苗用作引发抗原时，这一说法尤其正确。据说，由于DNA疫苗比重组病毒中抗原浓度低，并且缺少重组病毒中通常有的“噪音”抗原，因此DNA引发可以激活和扩大抗原特异性T细胞反应，在引发期，具有很高的亲和力。病毒增强进一步扩大了存储库，与单一疫苗相比，产生了很强的免疫反应。
如图10所示，与单一的DNA或重组腺病毒相比，引发-增强(prime boost)方法诱导了至少高于其10倍的抗体反应。
据文献报道，单一注射重组腺病毒疫苗能够完全保护非人灵长类免受埃博拉病毒的攻击。当长期免疫计划不可行时，这对于处理公共卫生突发事件，如SARS爆发，特别有利。单一注射，快速作用的疫苗能够提供很快的保护，可以减少突发反应工作组面临的潜在危险。
使用SV8000疫苗的1E12对两只恒河猴进行了免疫。第3只猴子只用培养基进行免疫。在免疫之前收集血清样品，免疫后10周内，每周收集血清样品。分离PBMCs，并储存于液氮中，以进行后续的批次分析。血清样品用于标准的病毒中和实验。从数据可以观察到免疫反应的明显趋势。如图11所示，中和抗体在第4周出现高峰，以后3周相对平稳。值得注意的是，康复期患者的平均中和抗体滴度仅约为1∶64。尽管这可能表明，单独注射SV8000可能提供保护作用，但是并不清楚是否仅有中和抗体就可以起到保护作用。T细胞，尤其CTLs在其他冠状病毒感染动物模型中，如IBV和MHV，起着重要的作用。而且，由于SARS-CoV的历史较短，不知道这一病毒是否会以不同的S蛋白再次入侵，在这个粒子中，T细胞活化对交叉株的保护非常关键。
在猴子中对疫苗的功效进行了检测。在第0周和第4周，肌肉注射SV8000免疫恒河猴。在前4周，抗体反应相对较低。在加强免疫后，抗体反应很快增加(图12)。在第8周，所有免疫过的猴子产生了高滴度的IgG抗体。
为了检测疫苗的保护效率，使用高剂量、低剂量和安慰剂组的猴子分别用105TCID50活病毒鼻内攻击，对照组的两只猴子在同一个动物饲养设备中饲养，但是没有感染活病毒，作为实验的阴性对照。接种病毒三天后，安慰剂组的4只猴子变的嗜睡，进食显著减少，两只猴子显示出呼吸窘迫症状。相反，免疫过的动物或对照组动物都没有显示出可见的临床症状。
与攻击前相比，免疫组SARS冠状病毒特异IgG的浓度在攻击后显著增加(图13)。病毒攻击7天后，增加的范围在3倍到近30倍之间变化，表明疫苗注射后，已经有效的引发了体液免疫反应。
在攻击病毒后第2天，第5天和第7天收集咽拭子和血清样本。通过RT-PCR或病毒培养的方法检测SARS冠状病毒的存在。在高剂量组的4只动物中，2只在病毒攻击后2天能够检测出病毒RNA(图14)，5天时病毒RNA消失。另外两只在任何时间都没有检测出病毒RNA。低剂量组的4只动物在第2天或第5天不能检测出病毒RNA，只有一只动物在第7天可检测到较低水平的RNA。相反，安慰剂组的4只动物在病毒攻击后，病毒RNA检测均为阳性。
为了在攻击之后重新分离活病毒，用咽拭子样本接种Vero细胞。如图14所示，在安慰剂组的4只动物中，3只可以分离出活病毒。高剂量组和低剂量组都可以保护动物免受病毒感染。
安慰剂组的动物，肺部损坏严重，广泛的肺泡壁损毁，肺泡腔的蛋白样液体堆积(图15e)。由于单核细胞严重渗透，肺泡壁增厚，透明质膜呈线性排列于肺泡壁。(图15f)。在最严重的例子中，可以观察到上皮细胞层广泛损毁和局部出血现象。尽管在极少数病例中，在肺泡壁发现了较少的水肿和单核细胞渗透(图15c)，高剂量组(图15b)与对照组(图15a)在组织学上有明显的区别。低剂量组的表现型介于高剂量组和安慰剂组之间(图15d)。
为了找到疾病病理与病毒复制间的关系，同时采用免疫组化方法分析了肺组织切片，如图16所示。高剂量组切片中有极少量的阳性染色，与阴性对照组很相似。相反，安慰剂组的肺组织切片显示出许多阳性细胞，有明显的胞质染色，表明这些细胞中连续的抗原表达。低剂量组也表现出中间型，在肺泡壁和上皮细胞中出现了抗原阳性细胞。
权利要求
1.一种药物成分，包含一个编码一个或多个SARS冠状病毒基因产物的核酸分子，此核酸分子与一个调控序列相联，存在于一个药物相容性载体中。
2.根据权利要求1所述的药物成分，其中，SARS冠状病毒基因选自S蛋白、Orf8蛋白、M蛋白、N蛋白、E蛋白、Orf1a蛋白、Orf1b蛋白和其联合体。
3.根据权利要求1所述的药物成分，其中，调控序列是一个启动子。
4.根据权利要求3所述的药物成分，其中，启动子是CMV启动子。
5.根据权利要求1所述的药物成分，其中，药物相容性载体是病毒载体、质粒载体或RNA载体。
6.根据权利要求5的药物成分，其中，病毒载体是一种复制缺陷型的腺病毒。
7.根据权利要求6所述的药物成分，其中，病毒载体是一种5型复制缺陷型腺病毒。
8.根据权利要求1所述的药物成分，其中，核酸分子编码两个SARS冠状病毒基因产物，在一个药物相容性载体中，第一个基因产物包括至少一个SARS-CoV基因细胞外结构域，或其衍生物，第二个基因产物包含一个细胞内蛋白，或其衍生物。
9.根据权利要求8所述的药物成分，其中，第一个基因选自一个SARS-CoV基因群，包括S、M、Orf8和E，第二个基因选自包括N、Orf1a和Orf1b的SARS-CoV的基因群。
10.根据权利要求8所述的药物成分，其中，第一个基因产物包含SARS-CoV S蛋白的一部分，或其抗原决定簇结合结构域，或其相似物。其中，S蛋白有一个截短的C末端，去除跨膜锚定和细胞内结构域。
11.根据权利要求8所述的药物成分，其中，第一个基因产物包含第一个基因片段，SARS冠状病毒S蛋白的一部分或其抗原决定簇结合结构域，或其相似物，其中S蛋白有一个截短的C末端，以去除跨膜锚定和细胞胞内结构域；第二个基因片段包含SARS-CoV Orf8蛋白的一部分或其抗原决定簇结合结构域或其相似物，其中Orf8蛋白有一个截短的C末端，去除了跨膜锚定和细胞内结构域。
12.根据权利要求1所述的药物成分，其中，核酸分子由基于高表达的哺乳动物密码子使用率优选的氨基酸密码子组成。
13.根据权利要求12所述的药物成分，其中，优选的密码子的GC含量至少为50％。
14.根据权利要求12所述的药物成分，其中，优选密码子的第3个碱基位的G-C含量至少为50％。
15.根据权利要求1所述的药物成分，其中，SARS-CoV基因产物还包括一个分泌信号肽片段。
16.根据权利要求8所述的药物成分，其中，第一个基因产物还包括分泌信号肽片段。
17.根据权利要求16所述的药物成分，其中，分泌信号肽片段是一个Igk信号序列。
18.一种肽或肽联合体，选自如权利要求1-17之任一所述的基因产物，其中这些肽在体外纯化。
19.一种在机体内诱导针对某抗原的免疫反应的方法，包括提供给此个体如权利要求1-17之任一所述的药物成分。
20.一种如权利要求19所述的诱导针对某抗原的免疫反应的方法，其中，在药物成分首次给药以后，分别在约1周、2周、3周、4周或6周给药，或联合给药。
21.一种如权利要求19所述的诱导针对某抗原的免疫反应的方法，其中，药物成分联合佐剂给药。
22.一种如权利要求19所述的诱导针对某抗原的免疫反应的方法，其中，质粒载体药物成分的给药剂量为每次注射1-5mg.。
23.一种如权利要求19所述的诱导针对某抗原的免疫反应的方法，其中，病毒载体药物成分的给药剂量为每次注射1×106-1×1013个病毒颗粒。
24.一种如权利要求19所述的诱导针对某抗原的免疫反应的方法，其中，药物成分通过肌肉内、皮内、皮下、鼻内或口服给药。
25.一种如权利要求19所述的诱导针对某抗原的免疫反应的方法，还包括在第一次给药物成分后，再给不同载体的药物成分，以引发对上述抗原的免疫反应。
全文摘要
本发明提供了一种能够诱导对SARS病毒的免疫反应的药物成分，以及这种药物成分的使用方法。设计的疫苗能表达多种SARS基因产物，包括S1结构域，orf8细胞外结构域，N蛋白和其它。研究表明此疫苗能有效地诱导免疫反应，并保护灵长类免受SARS病毒感染。
文档编号C07K4/02GK1791427SQ200480013933
公开日2006年6月21日 申请日期2004年5月29日 优先权日2003年5月31日
发明者陈一友 申请人:陈一友