专利名称：一种用于结核病预防的新型重组疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域和新型结核疫苗领域，具体涉及一种重组的卡介苗。
背景技术：
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，近年来随着流 动人口增加、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株 的出现，使全球结核病疫情增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。卡介苗(Bacille CalmetteGuerin,BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗，但是其免疫保护效果极不稳定， 不同地区的人群接种BCG后其免疫保护作用差异很大(保护率为0-80%不等)。开发比 BCG更为有效的抗结核病疫苗已成为当今迫切需要解决的问题，但目前尚没有任何一种新 型疫苗能完全替代BCG免疫，因此对卡介苗进行分子改造，研制更为安全有效的新型抗结 核病疫苗具有重要的意义。BCG作为一种活疫苗，应用于免疫力低下的人群(如HIV感染 者或艾滋病患者等)有较大的局限性，而将外源基因导入卡介苗构建重组卡介苗(rBCG)是 TB疫苗改造的方向之一，通过BCG的生长繁殖，在体内表达保护性抗原，能更有效地激发机 体免疫应答，增强BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入编码MTB 30kD主要分泌型 和细胞外蛋白(Ag85B)的质粒来观察rBCG的效力，发现rBCG均能稳定表达这种蛋白分子， 与亲本BCG免疫的豚鼠相比，rBCG免疫的豚鼠尽管体重变化不明显，但动物存活率和组织 抑制细菌生长的能力均超过BCG，已计划开始进行I期人体试验。Bao构建了两株分别表达 Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6分泌蛋白的rBCG，前者比BCG诱导更高滴度的特异性抗体 和更强烈的细胞免疫应答，而后者的免疫原性与亲本BCG株相似，两株rBCG的毒力未见增 强，都能明显抵御MTB感染，但免疫保护效力方面尚低于BCG。MTB早期分泌抗原靶6 (earlier secreted antigenic taget 6，ESAT_6)是分枝杆 菌毒株培养液中的一种分泌蛋白，它是分枝杆菌感染的人或动物免疫回忆应答过程中T细 胞识别的主要靶抗原之一，是MTB特有而BCG缺乏的一种小分子量分泌性蛋白，由位于MTB 基因组的RD (Regions of deletion, RD) 1位点上RV3875基因编码，该区只存在于结核分枝 杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中，所有BCG菌株基因组中均缺乏该区域，是BCG 减毒传代过程中最先缺失的一段区域，与结核分枝杆菌毒力和抗原性相关，能被宿主免疫 系统高度识别。ESAT6是一种重要的T细胞抗原，具有多个T、B细胞表位，能刺激免疫记忆 细胞早期高效分泌IFN- Y，在MTB感染早期阶断即可被机体识别，可激活CD4+T细胞和主要 组织相容性抗原复合物(MHC) I类分子限制性CD8+T细胞，在保护性细胞免疫中发挥重要作 用，被看作是新型结核疫苗研究的优势抗原。机体对结核病的免疫主要通过ra4+T、细胞等的细胞免疫来完成，BCG是一 种强的CD4+T细胞型免疫应答诱导剂，但它诱导MHC I类限制性CD8+T细胞的作用较弱， 这可能是BCG的主要缺陷之一，而细胞可通过多种机制在宿主防御结核杆菌感染 和潜伏感染中发挥重要作用。粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factorGM-CSF)是一种能够刺激粒细胞、巨噬细胞形成集落的细胞因子，可调控粒细胞、单核/巨噬细胞的分化、增殖和存活，激活单核-巨噬细胞、释放炎性介 导因子，杀死某些微生物和肿瘤，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF在体内外 都能影响巨噬细胞的活性，促进树突状细胞发育，并增加其表面MHC分子的表达，有效促进 抗原提呈，作为免疫佐剂已广泛应用于免疫学领域。利用GM-CSF作为佐剂的动物模型试验 均表明，GM-CSF能增强感染的免疫原性，在与BCG —起免疫的小鼠中，GM-CSF能显著增强小 鼠对结核分枝杆菌二次攻击的免疫保护作用。ra4+Thi型细胞免疫反应和ra8+CTL反应是机体抗结核必需的保护免疫，有效的 疫苗既要能刺激产生上述参与保护免疫的T细胞，又要产生所需的细胞因子，由单个靶抗 原同时产生这两种效果可能存在一定困难，理想的结核疫苗应为含多个靶抗原的多价疫 苗，以期提高TB疫苗效果，因此，多价疫苗是结核病疫苗研制的重要研究方向之一。由于 GM-CSF能诱导强的CD8+T细胞反应，可以弥补卡介苗功能上的缺陷，选择其作为佐剂与结 核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT6共同转入卡介苗，构建能表达人GM-CSF和结核分枝杆菌 ESAT6蛋白的重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力，对今后结核新疫苗的开发、发 病机制的研究及结核病的防治有重大意义。
发明内容
1、本发明的目的是提供一种重组卡介苗的制备方法。根据Genbank中报道的hGMCSF和ESAT6基因CDS序列设计引物，分别扩增hGMCSF 和 ESAT6 基因，用 S0E 法(重叠延伸，Gene splicing by overlap extension)进一步扩增 GMCSF-ESAT6嵌合基因，将此嵌合基因与大肠杆菌-结核分支杆菌穿梭质粒pMV361同时双 酶切插入穿梭质粒的多克隆位点处，构建重组穿梭质粒rpMV361GMCSF-ESAT6，先用卡那霉 素筛选阳性重组子，再用PCR、酶切及基因序列分析进行鉴定。PCR、酶切及测序结果均显示， 在穿梭质粒PMV361中插入了一个765bp的特异性片段，与预期的GMCSF-ESAT6嵌合基因大 小一致，重组穿梭表达载体构建成功。将-70°C冻存的BCG菌株快速解冻后，迅速转移至37°C预热的Sauton培养基中， 放入37°C培养箱静置培养4-5周，待菌膜长出，直至菌体恢复正常生长状态，菌体呈白色或 略带黄色，有皱褶并覆盖整个培养基液面，将其转种并扩大培养，待菌膜覆盖满液面后用于 电转化。将测序正确的重组质粒rpMV361GMCSF-ESAT6用电转化的方法转入至感受态BCG 中，构建rBCG:GMCSF-ESAT6重组卡介苗。通过卡那霉素筛选阳性重组子，一方面提取重组 卡介苗的基因组行PCR鉴定，另一方面，通过热诱导的方法，用小鼠抗hGM-CSF单克隆抗体 进行Western-blot分析，观察其蛋白表达水平。以提取具有卡那霉素抗性的重组BCG菌的 基因组为模板，经PCR扩增出765bp的目的片段，证明重组质粒pMV GMCSF-ESAT6已成功转 化进BCG菌；重组BCG经热诱导后，菌体裂解液上清用GM-CSF单克隆抗体为一抗，HRP标 记的羊抗鼠IgG为二抗，经ECL显色后显示在25kDa左右出现一特异性的条带，和目的蛋白 的预期分子量吻合，而空质粒(PMV361)电转化组未出现阳性条带，表明重组BCG可以表达 GMCSF-ESAT6外源目的蛋白，重组卡介苗rBCG GMCSF-ESAT6构建成功。2、本发明的另一个目的是提供一种效果优于目前市售卡介苗的重组卡介苗。取6周龄的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每组8只，随机分为PBST组、BCG 组、rBCG361组和rBCGGMCSF-ESAT6组，各组适应性饲养1周后，于背部皮下多点分别注射PBST、BCG 及 rBCG(5X106CFU/ 只，用 PBST 稀释成 0. lmL)，共免疫 1 次。免疫后 6、8、10、12 周四个时间点各组随机抽取小鼠2只，摘眼球取血，分离血清，检测各组小鼠血清特异性抗 体滴度。同时无菌分离脾脏，收集脾淋巴细胞，经台盼蓝染色后细胞计数，活细胞数在90% 以上，调整细胞密度为2X106/L进行下述实验(1)特异性脾淋巴细胞增殖试验分离培养的脾细胞加入96孔圆底培养板，每组 小鼠脾细胞做6个复孔，并设阴性对照孔和调零孔，试验孔加入25mg/L TB-PPD,对照孔不 加特异性蛋白，调零孔不加淋巴细胞。于37°C 5% C02培养68小时后加入XTT再培养4h， 用酶标仪测定A450吸光值，结果用刺激指数表示，SI =刺激组/非刺激组。(2)细胞因子的诱生上述分离培养的脾细胞加入24孔圆底培养板(0. 5mL/孔)， 每组小鼠脾细胞做3个复孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，收集培养液上清，按ELISA检测试 剂盒说明书测定IFN- y和IL-4水平。(3)流式细胞术检测T淋巴细胞⑶4+及⑶8+细胞亚群脾淋巴细胞转入6孔板，每 组做3个复孔(lmL/孔)，同时加入25mg/L TB-PPD刺激，培养72h后，加入PE荧光素标记 的抗小鼠CD4+和FITC标记的⑶/抗小鼠一抗，流式细胞仪检测T淋巴细胞表面⑶/及 细胞亚群所占比例。结果显示，免疫后6、8、10、12周rBCG361组和卡介苗组各时间点血清抗体滴 度相差不明显，而rBCG GMCSF-ESAT6组免疫小鼠的抗体滴度明显高于rBCG361组和 卡介苗组，在第8周达到高峰，然后逐渐降低，但仍然高于卡介苗组和rBCG361组；各 免疫组脾淋巴细胞增殖活性均较PBST组明显升高，在第10周时达到最高，rBCG361组 和卡介苗组比较，刺激指数差异不显著，而rBCG:GMCSF-ESAT6组脾淋巴细胞增殖活性 显著高于卡介苗组和rBCG361组；各免疫小鼠IFN-Y水平均较PBST明显升高，10周 达到高峰，rBCG GMCSF-ESAT6组IFN- Y含量显著高于卡介苗组和rBCG361组；卡介 苗组、rBCG361组和重组BCG GMCSF-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD4+T细胞均有增高的趋 势，在免疫后10周达到最高，其中，卡介苗组和rBCG361组细胞的比例相当，而重 组卡介苗rBCG GMCSF-ESAT6组细胞比例在各个时间点明显高于其它各组，重组 BCG:GMCSF-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞细胞比例自免疫8周就明显增加，至12周达到 最高，在各个时间点CD8+T细胞比例均显著高于其它组。体液免疫反应和细胞免疫反应均提示重组BCG:GMCSF-ESAT6免疫原性强于BCG。本发明的疫苗具有以下优势1、重组表达了人GM-CSF和结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT6。2、将人GM-CSF基因与ESAT6通过基因工程技术融合在一起。3、能稳定的在卡介苗中表达外源蛋白GMCSF-ESAT6。4、重组疫苗的免疫原性优于传统卡介苗。
附图及说明
图1为hGMCSF基因、ESAT6基因和GMCSF-ESAT6嵌合基因的PCR图。1，DNA分子 量标准；2，hGMCSF 条带；3，ESAT6 条带；4，GMCSF-ESAT6 条带。 图2为rpMV361 GMCSF-ESAT6的PCR及酶切鉴定图。1，DNA分子量标准1 ；2，PCR 鉴定；3，pMV361 空质粒双酶切；4，rpMV GMCSF-ESAT6 单酶切；5，rpMV361 GMCSF-ESAT6 双
5酶切。图 3 为 rBCG:GMCSF-ESAT6 基因组 PCR 鉴定图。1，DNA 分子量标准；2，GMCSF-ESAT6 条带。图4为pMV361的质粒图谱。图 5 为 ffestern-blot 检测 rBCG GMCSF-ESAT6 细胞裂解液中 GMCSF-ESAT6 蛋 白表达图。1，rBCG:361菌体蛋白Western-blot检测。2，rBCG:GMCSF_ESAT6菌体蛋白 ffestern-blot 检测。图6为血清特异性抗体滴度。图 7 血清 IgG2a/IgGl。图8为免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应。图9为脾细胞培养上清中IFN- Y水平。图10为免疫小鼠脾淋巴细胞⑶4细胞百分比。图11为免疫小鼠脾淋巴细胞⑶8细胞百分比。图12为免疫小鼠脾淋巴细胞亚群分析。1，PBST组；2，BCG组；3，rBCG361组；4， rBCG:GMCSF-ESAT6 组。
具体实施例方式1、以pORF-hGMCSF质粒和结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，根据发表的人 粒-巨噬细胞集落刺激因子结核分枝杆菌H37Rv株的CDS序列分别设计人GM-CSF和ESAT6 基因的引物，克隆人GM-CSF和结核分枝杆菌ESAT6基因。2、通过基因工程手段，将克隆的人GMCSF和ESAT6基因末端加上连接肽段，获得 GMCSF-ESAT6嵌合基因。3、将嵌合基因转入pMV361穿梭质粒，构建rpMV361 GMCSF-ESAT6重组质粒。4、提取重组质粒，分别进行PCR、酶切及测序鉴定。5、运用电转化的方法将重组质粒转入卡介苗，构建重组BCG:GMCSF_ESAT6。6、用卡那霉素进行初步筛选。7、提取重组卡介苗的基因组并进行PCR鉴定。8、通过热诱导的方法诱导重组卡介苗蛋白表达并用Western-blot的方法鉴定。9、分别用重组卡介苗、传统卡介苗和PBS免疫小鼠，观察并分析各组小鼠的体液 免疫和细胞免疫反应。实施例实施例1 hGMCSF_ESAT6嵌合基因重组卡介苗的构建、表达与鉴定1 材料1. 1菌株及质粒BCG上海株由成都生物制品研究所提供，质粒PMV361由本室保存，p0RF_hGMCSF质 粒购自Invitrogen公司。1. 2主要试剂prime STAR HS DNA 聚合酶、dNTP、DNA 连接试剂盒是 Takara 公司产品；EcoR I、 HindHI及蛋白分子量标准购自晶美公司；Omega质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒及
6胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自宝信生物 ’人GM-CSF单克隆抗体为Abeam公司 产品；HRP酶标羊抗鼠IgG和ECL显色试剂盒购自北京中杉公司。1. 3主要仪器PCR仪、电转仪购自百乐公司，低温冰箱购自三洋公司。2 方法2. 1人GM-CSF和结核分枝杆菌ESAT6基因的PCR扩增根据Genbank中报道的hGMCSF和ESAT6基因⑶S序列设计2对引物，引物序列为 hGMCSF 上游5，-CG GAATTC ACATGTGGCTGCAGAGCCTG-3，，hGMCSF 下游5，-GCTGCCGCCACCGC CGGATCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTGGACTGGCTC-3，，上游黑体字是 EcoR I 的酶切位 点，下游删除终止密码子TGA，下划线部分是含有45个碱基的linker序列。ESAT6上游5’_ GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGCAGCATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCG _3’， ESAT6 下游5，-TA AAGCTT CTATGCGAACATCCCAGTGACGTT-3，，上游下划线部分是含有 45 个 碱基互补的linker序列，下游黑体字是Hind III的酶切位点。以pORF_hGMCSF质粒和结 核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，分别PCR扩增hGMCSF基因和ESAT6基因。hGMCSF 基因 PCR 扩增体系总体积为 50ii L，5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 lOmmoL/L)，pORF-hGMCSF 质粒 DNA 1 u L, hGMCSF 基因上下游引物各 1 u L, prime STAR HS DNAPolymerase 1U，去离子水 32. 5 ii L。PCR 反应条件如下95°C预 变性5分钟，94 V变性30秒，60 V复性45秒，72 °C延伸1分钟，30个循环，72 °C延伸10分钟。 ESAT6 PCR 扩增体系总体积为 50ii L，5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 lOmmoL/L)，H37Rv 株基因组 DNA 1 u L, ESAT6 基因上下游引物各 1 P L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U，去离子水32. 5 ii L，PCR反应条件同上，扩增得到下游 带linker的hGMCSF基因和上游带linker的ESAT6基因。2. 2GMCSF-ESAT6嵌合基因的扩增与纯化取设计的hGMCSF基因上游引物1 P L，ESAT6基因的下游引物1 P L，以上述扩增的 hGMCSF 禾口 ESAT6 的 PCR 产物各 1 ii L 为模板，dNTP 4 u L, 5 X prime STAR Buffer 10 u L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U,去离子水 31. 5 ii L，总体积 50 ii L，用 S0E 法扩增 GMCSF-ESAT6嵌合基因。PCR反应条件95°C预变性5分钟，94°C变性45秒，68 °C复性1分 钟，72°C延伸1分30秒，30个循环，72°C延伸10分钟。将GMCSF-ESAT6嵌合基因PCR产物 用柱式胶回收试剂盒纯化，具体实验步骤参照说明书。2. 3 重组质粒 rpMV361GMCSF-ESAT6 的构建用质粒提取试剂盒提取pMV361空质粒，和上述GMCSF-ESAT6嵌合基因纯化产物 用EcoRI和Hind III同时进行双酶切，反应体系分别为pMV361空质粒5 y L，5 X Tango buffer 4u L, EcoR I 0. 5 u L, Hind III0. 5u L,总体积 20 u L ；GMCSF-ESAT6 嵌合基因 PCR 纯化产物 5ii L，5XTango buffer 4u L, EcoR I 0. 5 u L, Hind III0. 5 ii L，总体积 20 ii L。 反应条件37°C水浴5小时。纯化空质粒和PCR产物的双酶切产物，按照PCR 空质粒浓度 比1 10的比例混合，再加入等体积的连接试剂，轻轻混勻后，16°C连接3小时。取5yL 连接液加入至50ii L DH5a感受态菌液中，轻轻混勻，冰浴30分钟，42°C水浴静置90秒，取 出迅速转入至冰浴中2分钟，加入不含抗生素的LB液体培养基250 u L，37°C缓慢振摇60分 钟，取转化后的菌液100 u L铺于含卡那霉素50 u g/mL的LB平板上，37°C过夜培养。
2. 4 重组质粒 rpMV361GMCSF-ESAT6 的鉴定随机挑取3个生长菌落分别接种于3mL LB液体培养基中(含卡那霉素50 u g/ mL)，37°C振摇过夜，提取质粒后电泳初步观察质粒DNA大小。取较空质粒略大者进行PCR 鉴定，其中阴性对照以PMV361为模板，待检样本则以含有插入片段的重组质粒DNA为模板 进行PCR扩增，引物为hGMCSF上游和ESAT6下游，PCR反应体系及循环参数同前述，另一方 面用EcoR I和Hindlll双酶切消化，电泳检测有无插入片段及其大小。初步鉴定重组质粒 插入片段大小与预期相符后，将重组质粒送至Invitrogen公司进行DNA序列分析，测序引 物分别为hGMCSF上游和ESAT6下游。2. 5 重组卡介苗 rBCG:GMCSF-ESAT6 的构建将-70°C冻存的BCG菌株快速解冻后，迅速转移至37°C预热的Sauton培养基中， 放入37°C培养箱静置培养4-5周，待菌膜长出，直至菌体恢复正常生长状态，菌体呈白色或 略带黄色，有皱褶并覆盖整个培养基液面，将其转种并扩大培养，待菌膜覆盖满液面后用于 电转化。转化前加入甘氨酸至终浓度为4%，继续培养24小时。用无菌玻璃珠振摇3小时 以打碎菌膜。冰浴1小时后，4000rpm 4°C离心10分钟集菌，菌团用预冷的10%甘油洗涤4 次后重悬于10%甘油中。取200iiL菌液加入10 iiL重组质粒，冰浴30分钟，转入预冷2mm 电穿孔杯中，在2. 5KV/cm, 25uF,720Q条件下电转化。放电完毕后立即冰浴10分钟，轻柔 加至10mL Sauton培养液中，37°C静置培养。待长出菌膜后转入含20 y g/mL卡那霉素的 Sauton培养液中，于37°C继续静置培养3 4周。2. 6 重组卡介苗 rBCG:GMCSF-ESAT6 的鉴定待菌膜长满液面后，离心集菌，依据基因组提取试剂盒提取重组卡介苗总DNA，以 其为模板按前述扩增条件，分别以hGMCSF上游和ESAT6下游为引物，进行PCR扩增。含外 源基因的重组卡介苗在Sauton培养液(含20 yg/mL卡那霉素)中静置培养两周，迅速加 入等体积53°C的Sauton培养液，置45°C水浴热诱导30分钟。5000rpm离心15分钟集菌。 收集培养液上清备用。菌体用冰预冷的PBS(pH7.2)洗涤2次，振荡混勻，超声波裂解菌体 40分钟，-20°C备用。根据Laemmli等介绍的方法，依次灌制12%的分离胶5mL和5%的浓 缩胶2mL，待胶完全凝固后，将上述制备的蛋白样品及蛋白质分子量标准各取10yL上样于 梳齿孔中进行电泳，先80V稳压电泳至分离胶，再120V电泳至结束。电泳完毕后，剥下凝胶 块，先剪与凝胶块相同大小的2张滤纸和1张硝酸纤维素膜。连同凝胶块一起浸入转移电 泳缓冲液(25mmoL/L Tris，0. 2moL/L氨基乙酸，20%甲醇)中浸泡30分钟，然后在BR10592 型半干转移装置的阳极板上依次平铺滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸，盖上阴极板，接通电 源，于10V稳压电泳45分钟；取出硝酸纤维素膜，将膜置5%脱脂奶粉中封闭1小时后用 TTBS(10mM/L Tris-HCl, 150mmoL/LNaCl,0. 05% Tween20,pH7. 5)室温轻摇洗涤 3X5 分钟， 然后浸入含小鼠抗GM-CSF单克隆抗体(1 1000)的一抗中于室温孵育2小时，TTBS洗膜 3X5分钟，浸入含竦根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(l 5000)的二抗稀释液液中，室温 孵育1小时；TTBS洗膜3X5分钟，ECL显色，观察嵌合蛋白在卡介苗中的表达。3 结果3. 1人GM-CSF基因、结核分枝杆菌ESAT6基因和GMCSF-ESAT6嵌合基因的扩增以设计的GM-CSF基因上下游为引物，通过PCR方法从p0RF_hGMCSF质粒获得 477bp的人GM-CSF基因片段(不含终止密码子)，以ESAT6基因上下游为引物，从结核分枝
8杆菌标准株H37Rv基因组DNA中获得333bp的结核分枝杆菌ESAT6基因，以GM-CSF基因上 游、ESAT6基因下游为引物，GM-CSF和ESAT6基因为模板，扩增得到765bp的特异性片段，与 预期的GMCSF-ESAT6嵌合基因大小一致(见图1)。3. 2 重组质粒 rpMV361GMCSF-ESAT6 的鉴定以抗生素筛选阳性重组子提取的质粒为模板，以GM-CSF基因上游、ESAT6基因下 游为引物进行PCR扩增，同时用EcoR I.Hindi 11双酶切该重组质粒，均证实有大小为765bp 的目的片段插入PMV361质粒(见图2)，测序结果和GenBank中人GM-CSF基因、结核分枝杆 菌ESAT6基因序列比对，均100%匹配，表明重组质粒构建成功。3. 3重组BCG的PCR鉴定以提取具有卡那霉素抗性的重组BCG菌的基因组为模板，经PCR扩增出765bp的 目的片段，证明重组质粒pMV GMCSF-ESAT6已成功转化进BCG菌(图3)。3. 4重组BCG表达产物的Westrn-blot分析重组BCG经热诱导后，菌体裂解液上清用GM-CSF单克隆抗体为一抗，HRP标记的 羊抗鼠IgG为二抗，经ECL显色后显示在25kDa左右出现一特异性的条带，和目的蛋白的预 期分子量吻合，而空质粒电转化组未出现阳性条带，表明重组BCG可以表达GMCSF-ESAT6外 源目的蛋白(见图5)，重组卡介苗rBCG:GMCSF-ESAT6构建成功。4 结论运用分子生物学技术成功构建了能表达hGMCSF_ESAT6外源蛋白的重组卡介苗 BCG:GMCSF-ESAT6。实施例2重组卡介苗rBCG GMCSF-ESAT6免疫原性研究1 材料1. 1实验动物BALB/C小鼠购自四川大学华西校区实验动物中心。1. 2主要试剂IFN-Y、IL_4 ELISA检测试剂盒购自R&D公司，PE标记的0)4和FITC 标记的抗小鼠一抗购自eBioscience公司，RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司。1. 3 主要仪器 FACSCalibur 流式细胞仪(BD Biosciences)，酶标仪(Bio-Rad)。2 方法2.1动物免疫取6周龄的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每组8只，随机分为PBST组、BCG 组、rBCG361组和rBCGGMCSF-ESAT6组，各组适应性饲养1周后，于背部皮下多点分别注射 PBST (0. 05% Tween80)、BCG 及 rBCG(5X 106CFU/ 只，用 PBST 稀释成 0. lmL)，共免疫 1 次。 免疫后观察动物注射部位有无红肿、溃疡、化脓等，同时观察动物皮毛、精神状态、饮食及大 小便。2. 2血清特异性抗体水平检测免疫后6、8、10、12周四个时间点各组随机抽取小鼠2只，摘眼球取血，待血液固体 成分凝结固缩，离心吸取血清，分装后-70°C冻存备用。用TB-PPD标准品(lOOyL/孔)包 被酶标板，4°C避光过夜。PBST洗涤，5%脱脂奶粉封闭90分钟，再次洗涤后依次加入2倍 系列稀释的待检血清，37°C温育90分钟，洗板后分别加入1 1000稀释的HRP酶标记羊抗 鼠IgG、IgGl和IgG2a，再次37°C温育90分钟，洗板，加入底物液(含0. 4mg/mL邻苯二胺的0. 05M磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH5. 0，临用前加5uL 30% H202/10mL) 100 u L/孔，室温避 光15-30分钟。加入50 u L/孔H2S04(2M)终止反应，于波长490nm测定吸光度。实验中以 PBST组为空白对照、以rBCG-361及BCG组血清为阴性对照，以结核病人血清作为阳性对照 (1 100稀释)，检测各组小鼠血清特异性抗体滴度。结果以双复孔A值均值表示，当A值 > 0. 05，A实验组/A对照组> 2. 0时，判为阳性，以出现阳性反应的最高稀释度作为该样本 的抗体滴度。2. 3脾淋巴细胞分离免疫后6、8、10、12周各组随机抽取2只小鼠，无菌分离脾脏，同组脾脏混合后，用 玻璃勻浆器研磨，经200目筛网过滤，PBS洗涤1-2次，加入0. 83%NH4C1溶液(0. 15M NH4C1, 10mMNaHC03, ImM EDTA_Na2)混勻后静置5分钟以裂解红细胞，1500rpm离心5分钟，收集细 胞，加入含10% FBS和双抗的RPMI1640，经台盼蓝染色后细胞计数，活细胞数在90%以上， 调整细胞密度为2X106/L进行后续实验。2. 4特异性脾淋巴细胞增殖试验(XTT)将上述分离培养的脾细胞加入96孔圆底培养板(0. lmL/孔)，每组小鼠脾细胞做 6个复孔，并设阴性对照孔和调零孔，试验孔加入25mg/L TB-PPD,对照孔不加特异性蛋白， 调零孔不加淋巴细胞。于37°C 5 % C02培养68小时后加入XTT (含lmg/mL XTT和0. 125mmoL/ L PMS)再培养4h，用酶标仪测定A450吸光值，结果用刺激指数表示，SI =刺激组/非刺激组。2. 5细胞因子的诱生将上述分离培养的脾细胞加入24孔圆底培养板(0. 5mL/孔)，每组小鼠脾细胞做 3个复孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，3000rpm离心5分钟收集培养液上清，-70°C冻存备 用，按ELISA检测试剂盒说明书测定IFN-y和IL-4水平。根据标准品各孔的0D值及其 所对应的标准品含量绘制标准曲线，然后根据待测样品孔0D值从标准曲线上求出样本中 IFN-y和IL-4的含量。采用方差分析对各组的测得值进行差异显著性分析，P < 0. 05为 具有统计学意义。2. 6流式细胞术检测T淋巴细胞⑶4+及⑶8+细胞亚群将上述分离培养的小鼠脾淋巴细胞转入6孔板，每组做3个复孔(lmL/孔)，同时 加入25mg/L TB-PPD刺激，培养72h后，3000rpm离心5分钟收集细胞，用PBS洗涤2次，细 胞悬液加入PE荧光素标记的抗小鼠⑶/和FITC标记的抗小鼠一抗，4°C避光30min，再 用 PBS-BSA-NaN3 (含 2 % BSA 和 0. 5 % NaN3 的 PBS)洗涤 2 次，再加入 400 u L PBS_BSA_NaN3， 流式细胞仪检测T淋巴细胞表面⑶/及⑶/细胞亚群所占比例。3 结果3. 1血清特异性抗体滴度测定rBCG361组和卡介苗组各时间点血清抗体滴度相差不明显(P > 0. 05)，而 rBCG:GMCSF-ESAT6组免疫小鼠的抗体滴度明显高于rBCG361组和卡介苗组，在第8周达 到高峰，然后逐渐降低，但仍然高于卡介苗组和rBCG361组(P < 0. 05)(见图6) ；BCG组和 rBCG:361组血清特异性IgG2a/IgGl比值在各个时间点变化趋势基本一致，6周时IgG2a/ IgGl较高，然后逐渐降低，8-10周降至最低，12周时比值稍有增高，rBCG:GE组IgG2a/IgGl 在前3个时间点变化趋势与rBCG:G组一致，但至12周迅速增高，IgG2a/IgGl达到8，显著
10高于其它各免疫组(见图7)。3. 2特异性淋巴细胞增殖实验各组经皮下免疫小鼠后，脾淋巴细胞增殖活性均较PBST组明显升高，且有增高的 趋势，并在第10周时达到最高；其中，rBCG361组和卡介苗组比较，刺激指数差异不显著(P > 0. 05)，而rBCG:GMCSF-ESAT6组脾淋巴细胞增殖活性显著高于卡介苗组和rBCG361组(P < 0. 05)(见图 8)。3. 3细胞因子的诱生各免疫小鼠IFN-Y水平均较PBST明显升高，且有增高的趋势，在免疫后10 周达到高峰；其中，rBCG361组和卡介苗组比较，IFN-Y产生差别不大(P > 0. 05)，而 rBCG:GMCSF-ESAT6组IFN- y含量显著高于卡介苗组和rBCG361组(P < 0. 05)(见图9)。 各组细胞因子IL-4在各时间点产生均不明显，未达到试剂盒检测的最低浓度。A450值维持 在0.015左右。3. 4免疫小鼠脾淋巴细胞亚群的变化卡介苗组、rBCG361组和重组BCG GMCSF-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD4+T细胞均 有增高的趋势，在免疫后10周达到最高，其中，卡介苗组和rBCG361组细胞的比例相 当(P > 0. 05)，而重组卡介苗rBCG:GMCSF-ESAT6组细胞比例在各个时间点明显高于 PBST组、卡介苗组和rBCG361组(P < 0. 05)(见图10)；重组BCGGMCSF-ESAT6组小鼠脾淋 巴细胞细胞比例自免疫8周就明显增加，至12周达到最高，在各个时间点CD8+T细胞 比例均显著高于其它组(见图11，12)。4 结论共表达人GMCSF和结核分枝杆菌ESAT6外源蛋白的重组卡介苗rBCG GMCSF-ESAT6 免疫原性优于传统卡介苗，为研制具有特异性抗结核杆菌免疫保护和佐剂增强双重效应的 新型重组BCG疫苗奠定了基础。
1权利要求
一种重组卡介苗rBCGGMCSF-ESAT6，其特征在于，能够稳定的表达GMCSF-ESAT6嵌合蛋白。
2.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，免疫原性强于传统卡介苗。
3.如权利要求1所述的重组卡介苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下几个步骤(1)hGM-CSF基因的扩增、结核分枝杆菌ESAT6基因的扩增；(2)GMCSF-ESAT6嵌合基因的扩增；(3)将GMCSF-ESAT6嵌合基因插入至大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361中，构 建rpMV361GMCSF-ESAT6 ；(4)将(3)中的重组质粒电转化入卡介苗。
4.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，通过抗生素筛选、提取基因组、PCR及 诱导表达后进行Western-blot鉴定，得到rBCG :GMCSF_ESAT6。
5.一种重组质粒，其特征在于，用基因工程技术将人粒_巨噬细胞集落刺激因子 (hGM-CSF)序列和结核分枝杆菌ESAT6基因序列嵌合后插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭 质粒序列中。
6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，大肠杆菌_结核分枝杆菌穿梭质粒为 PMV361。
7.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，将人GM-CSF基因序列和结核分枝杆菌 ESAT6基因序列连接后插入大肠杆菌_结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点处。
8.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，用PCR、酶切和测序鉴定，得到重组质粒 rpMV361GMCSF-ESAT60
9.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，将如权利要求5所述的重组质粒电转 化入卡介苗，得到rBCG :GMCSF-ESAT6o
全文摘要
本发明涉及一种人GM-CSF基因与结核分枝杆菌ESAT6基因嵌合表达GMCSF-ESAT6蛋白重组卡介苗的构建及其免疫原性研究，即利用基因工程技术将人GM-CSF基因和结核分枝杆菌ESAT6基因序列插入到同一大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361的序列中，构建重组穿梭质粒rpMV361GMCSF-ESAT6。然后采用电穿孔的方法将上述载体导入卡介苗，构建重组卡介苗rBCGGMCSF-ESAT6。本发明构建的重组卡介苗可以稳定的表达人GM-CSF与结核分枝杆菌ESAT6嵌合蛋白GMCSF-ESAT6，其免疫原性优于传统卡介苗。本发明提供了一种重组卡介苗的制备过程，并研究了其免疫性，属于基因工程领域和结核疫苗领域。本发明将更有效的预防结核病的发生及传播。
文档编号A61K48/00GK101850112SQ20101014037
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月7日 优先权日2010年4月7日
发明者杨晓玲, 邓仪昊, 鲍朗 申请人:四川大学