专利名称：：一种预防黄颡鱼红头病的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种鱼用疫苗，特别是一种预防黄颡鱼红头病的疫苗。
背景技术：
：黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，俗称黄腊丁，属于餘形目(Siluriformes)鳕科(Bagridae)黄颡鱼属(Pelteobagrus)。其具有肉质细嫩，味道鲜美，无肌间刺，营养丰富，低脂肪高蛋白特点，深受消费者欢迎，因此，黄颡鱼养殖在全国范围内得到了迅速发展，其养殖规模与养殖产量都逐年增加。但近年来在各黄颡鱼养殖区发生了一种以头部皮肤充血、出血，发红，甚至破裂，形成开放性溃疡为病变特征的“红头病”，具有传染性强，死亡率高等特点。目前对该病的病原学不清楚，一些养殖户认为是寄生虫性疾病；也有人认为是细菌性疾病；还有人认为是病毒性疾病。由于对病原学的不清楚，生产中一旦发生该病都是采用下大包围的方式用药物，这不仅导致治疗成本的增加，同时由于药物的滥用也导致耐药性的产生，给该病的治疗带来很大困难，同时，由于过度用药，也导致鱼体内抗生素残留超标，对水产品品质造成影响，由此导致严重的经济损失，严重阻碍了黄颡鱼养殖在我国的健康发展。
发明内容为了避免盲目用药带来的损失，明针对黄颡鱼红头病提供一种鱼用疫苗，是由鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)灭活制备而成的，优选方案，由保藏编号为CCTCCNO=M209176的菌株灭活制备而成。本发明的鱼用疫苗，含有致免疫有效量的灭活的鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)，及药学上可接受的辅料或载体，所述的致免疫有效量为106-108CFU/ml。本发明的疫苗可以有多种剂型，如辅料为水时可以制备成水剂，辅料可以是生理盐水或蒸馏水；当辅料为吸附剂时，可以制备成粉剂，所述的吸附剂可以是沸石或硅藻土。本发明疫苗还可以由灭活鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)，加入透皮吸收促进剂及且任选一种或多种药学上可接受的辅料或载体，能够促进鱼体从皮肤吸收疫苗，从而达到更好的预防效果。透皮吸收促进剂优选氮酮。更优选的是，由保藏编号为CCTCCNO=M209176的菌株灭活制备而成。本发明的疫苗或者联合疫苗能够针对性的防治黄颡鱼红头病，效果良好，是一种成本低廉，健康环保的防治方法。以下通过具体实施方式更进一步说明本发明技术方案，但是并非对本发明的限制，凡依据本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。图1基于16SrDNA序列构建的CHNYC01与CHNYC02菌株与其他相关菌株的系统发育树图2CHNGY01与CHNGY02菌株16SrDNA序列与参比菌株16SrDNA序列的同源性图中Flavbobacteriumcolumnaris柱状黄杆菌(AB0156515、AF095342)Edwardsiellahoshinae保科爱德华氏菌(AB050825)Edwardsiellaictaluri鮰爱德华氏菌(AB050826、AB453281、DQ985469)Yersiniaruckeri红色耶尔森菌，鳟鱼红嘴病耶杆菌(AF366385、EU401667)PsedomonasfIuorescens荧光假单胞菌(AY472116)Aeromonassobria温和气单胞菌(AY8274M、X60412)Aeromonascaviae豚鼠气单胞菌(AY987759、EU082831)VibrioanguiIlarum鳗弧菌(EF467287)Vibrioordalii病海弧菌(EU107968)Edwardsiellatarda迟钝爱德华氏菌缓慢爱德华氏菌(EU259317、FJ009591)具体实施例方式免疫是动物机体识别和清除抗原异物，保持体内、外环境平衡的一种生理反应。免疫防治是利用动物自身具有的特异性与非特异性免疫功能，通过疫苗，免疫激活剂、免疫增强剂等使养殖动物获得或增加免疫机能，从而增强动物机体的特异性与非特异性的抗病能力。在传统的水产动物疾病防治中，主要是药物防治，其中抗生素与化学药物的广泛应用已导致病原菌的严重耐药性，并对生态环境造成巨大压力，同时由于药物的残留对消费者存在潜在的威胁，因此水产动物疾病的免疫防治将是未来我国水产养殖业健康可持续发展的需要。我们的研究已证实其病原为鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)，尽管该病原菌对对氟苯尼考、丁胺卡那霉素与强力霉素高度敏感，但这些药物的长期使用必然会导致耐药性的产生，与此同时，药物的残留也会对人类健康造成潜在的威胁，因此，免疫防治该病就显得非常的重要。本发明从自然发病鱼体内进行了病原菌的分离鉴定与系统发育分析，旨在明确该病的病原，为养殖生产中防治该病提供科学依据，也为黄颡鱼红头病的免疫治疗提供了性。实施例一病原菌鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)的分离鉴定1材料与方法1.1试验鱼自然发病黄颡鱼采自四川眉山黄颡鱼养殖场；健康黄颡鱼由通威股份有限公司四川公司提供，体重60.5士4.3g。1.2主要试剂培养基TSA、TSB、TIS和BHI按常规方法自制。细菌生化微量鉴定管购自杭州天和生物试剂有限公司。TaqDNA聚合酶购自大连宝生物公司。PCR引物大连宝生物公司合成。药敏纸片购自杭州天和生物试剂有限公司。1.3细菌分离鉴定1.3.1病原菌分离无菌操作从自然感染病鱼脑和肾取样，划线接种于TSA与BHI平板置于28°C培养48h，挑取单个优势菌落在BHI平板上再次划线，获得纯培养的CHNGY01与CHNGY02两菌株，转接到TSA斜面培养基于4°C保存备用。1.3.2人工感染试验将分离菌株CHNGY01与CHNGY02接种TSA，28°C培养48后，用无菌生理盐水洗下，参照麦氏比浊管调整细菌浓度为1.8X108CFU/mL。健康黄颡鱼20尾随机平均分成2组，其中1组每尾鱼腹腔接种0.ImL菌液；另外1组作为对照组每尾鱼注射0.ImL无菌生理盐水。接种后观察鱼的发病死亡情况，并对死亡鱼及时剖检和致病菌的再次分离。1.3.3病原菌培养与形态特性检测参照有关甘肃农业大学.兽医微生物学实验指导方法进行菌株CHNGY01与CHNGY02的生长温度、耐盐性试验，以及在普通琼脂平板、TSA、BHI、兔血TSA平板上28°C培养48小时后观察细菌的生长状况和菌落的大小、形态等，并以革兰氏染色光学显微镜观察细菌形态特征。1.3.4病原菌生理、生化特性检测各项生理生化指标的测定参照2004年版伯杰氏细菌鉴定手册有关文献进行。1.416SrDNA序列测定与系统发育分析1.4.IPCR模板DNA的制备采用大连宝生物公司细菌DNA提取试剂盒进行细菌DNA模板制备。1.4.216SrDNA序列扩增与测序采用1对扩增细菌16SrDNA的通用引物，其上、下游引物的序列分别为5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和5，-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3，。PCR反应条件为94°C变性5min，然后94°Clmin，54°Clmin，72°C2min，30个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经DNA纯化系统纯化后，送大连宝生物公司进行序列测定。1.4.3系统发育树的构建将菌CHNGY01与CHNGY02的16SrDNA序列与GenBank中的已知核酸序列进行Blast分析，调出与该序列相关性较高的核酸序列，再采用DNAstar软件的Megalign软件包进行多序列比对和系统发育树构建。1.5药敏实验采用纸片扩散法，CHNGYO1与CHNGY02菌接种TSB肉汤，28°C震荡培养48h，将菌液均勻涂布TSA平板，帖上药敏纸片，28°C培养48h，测量抑菌圈大小并判定结果。2.结果2.1人工感染试验试验组黄颡鱼在接种感染后，表现为阵发行痉挛和旋转状游动，24h后陆续有鱼开始死亡，48h后实验鱼全部死亡，而对照组未见任何异常。死亡的黄颡鱼症状与病变与自然发病的黄颡鱼相似，表现为头部充血、出血发红，部分鱼表现为头顶局灶性发白，随病程的发展表现为溃疡；下颂明显充血、出血，背鳍基部出血，肛门红肿外突。剖解变化表现为腹腔内可见淡黄色腹水，肝肿大呈土黄色，并见出血点，脾、肾肿大、出血。胃肠道粘膜充血、出血。从感染死亡鱼肾、肝和脑内分离出与CHNGYO1、CHNGY02形态与生理生化一致的细菌，表明CHNGYO1与CHNGY02是黄颡鱼红头的病原菌。2.2形态与培养特性分离菌株CHNGY01与CHNGY02均为一种G-短杆菌。在2530°C的温度范围内具有较弱的运动性，而37°C时则不具运动能力；该菌在培养基上生长缓慢，在2530°C条件下培养BHI琼脂上需2836h，TSA琼脂上需要48h才形成针尖大小的菌落，而在37°C时生长不良；不能忍受超过1.5%的盐浓度。2.3生理生化特性生理、生化特性测定发现CHNGY01与CHNGY02的特性是完全一致的，对大多数糖都不能利用产酸，仅利用葡萄糖、麦芽糖和D-甘露糖产酸，对葡萄糖的氧化发酵在2030°C才产气，37°C时不产气。其过氧化氢酶阳性，细胞色素氧化酶阴性，硝酸盐还原阳性，吲哚与甲基红实验阴性，不能利用丙二酸盐与枸橼酸盐，H2S阴性，DNA酶与脂酶阴性。详细的生理、生化特性见表1。表1菌株CHNGYO1与CHNGY02的理化特征测定项目测定项目CHNGYO1CHNGY02CHNGYO1CHNGY02氧化/发酵EE产酸rr氧化酶--水杨素--过氧化氢酶++D-葡萄糖++DNA酶++乳糖.--脂酶(吐温80)--麦芽糖++蛋白酶++甘露糖++脲酶__蔗糖-_苯丙氨酸转氨酶--鼠李糖“-赖氨酸脱羧酶++阿拉伯糖--精氨酸双水解酶--棉子糖--鸟氨酸脱羧酶--纤维二糖--硝酸盐还原++木糖--枸橼酸盐--果糖--丙二酸盐--海藻糖--MR--甘露醇--V-P--水杨苷--吲哚--肌醇-_H2S--山梨醇--明胶液化--七叶苷__丙二酸盐利用_-_-侧金S花醇_;_-注“+”为阳性，“_”为阴性。2.416SrDNA的PCR扩增结果与系统发育分析针对CHNGYO1与CHNGY02菌株PCR扩增出的16SrDNA片段经琼脂糖电泳检测表明其大小约1500bp，测序结果表明该片段有1506bp与1513bp。将获得的序列与GenBank中已报道的16SrDNA序列进行Blast分析，调出相关性最高的序列和水产常见致病菌如弧菌(Vibrio)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)、鲁氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)等相关菌株的16SrDNA序列用DNAstar软件进序列比对分析和构建系统发育树(图1)，结果表明CHNGY01与CHNGY02菌在系统发育数上与鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)聚为一簇，其同源性在99.4-99.6%之间，结合形态学和理化特征鉴定CHNGY01与CHNGY02菌为鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)(图2)。2.5药敏实验由表2可知，CHNGY01与CHNGY02菌株对氟苯尼考、丁胺卡那霉素与强力霉素高度敏感，对庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、左氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星和丁胺卡那霉素等中度敏感，对氟哌酸、四环素和头孢拉定等低度敏感，对乙酰螺旋霉素、阿莫西林和氨苄青霉素等不敏感。表2菌株CHNGYO1与CHNGY02药敏实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注“-”表示不敏感，“+”表示低度敏感，“++”表示中度敏感，“+++”表示高度敏感。3.结论3.1通过对自然感染“红头病”的黄颡鱼进行了病原菌的分离，并采用形态、生理生化特性与16SrDNA序列进行分析，发现黄颡鱼头病”的病原菌为鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)。3.2药敏实验检测结果发现，黄颡鱼“红头病”的病原菌鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)菌株对氟苯尼考、丁胺卡那霉素与强力霉素高度敏感，对庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、左氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星和丁胺卡那霉素等中度敏感，因此，在养殖生产中，发生该病可选用以上的药物进行治疗。发明人于2009年8月8日将分离到的CHNGY01菌株提交中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCCNO:M209176。爱德华菌属(Edwardsiella)中一共有3个种即迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)，鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)、保科爱德华菌(Edwardsiellahoshinae)经过实验证明，保科爱德华菌(Edwardsiellahoshinae)无致病性。实施例二鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)标准菌株与本发明分离到的CHNGYO1菌株的比较研究1材料与方法1.1菌种来源CHNGY01株由通威药物研究所从四川眉山黄颡鱼养殖场分离鉴定的鮰爱德华氏菌，保藏编号为CCTCCNO:M209176。鮰爱德华氏菌标准株菌株号为ATCC33202。1.2主要试剂细菌生化微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司。培养基脑心浸液(BHI)购至北京路桥技术有限责任公司。1.3菌液准备试验前，用接种环从保存菌种的甘油菌液取菌液，接种在脑心浸液(BHI)肉汤培养基中，28°C培养24h，取出作为原液备用。1.4细菌的理化特性测定用移液器将菌液接种到微量生化鉴定管中，28°C培养24h。2结果对鮰爱德华氏菌CHNGY01与ATCC33202生理、生化特性测定发现，两者的特性基本一致，对大多数糖都不能利用产酸，仅利用葡萄糖、麦芽糖和D-甘露糖产酸。其过氧化氢酶、脲酶与赖氨酸脱羧酶阳性，细胞色素氧化酶、蛋白酶、DNA酶、苯丙氨酸转氨酶与鸟氨酸脱羧酶等阴性，硝酸盐还原阳性，不能利用丙二酸盐，H2S阴性。但两者在枸橼酸盐利用与甲基红实验上却存在差异，CHNGYO1在枸橼酸盐利用与甲基红实验上均为阳性，而ATCC33202却均为阴性。详细的生理、生化特性见表1。表1菌株CHNGY01与ATCC33202的理化特征测定项目测定项目CHNGY01ATCC33202CHNGYO1ATCC33202氧化/发酵FF产酸氧化酶--水杨素__过氧化氢酶++D-葡萄糖++DNA酶--乳糖--脂酶(吐温80)--麦芽糖++蛋白酶--甘露糖++脲酶++蔗糖--苯丙氨酸转氨酶--鼠李糖--赖氨酸脱羧酶++阿拉伯糖--精氨酸双水解酶--棉子糖--鸟氨酸脱羧酶--纤维二糖--硝酸盐还原++木糖--枸橼酸盐+-果糖--丙二酸盐--海藻糖--MR+-甘露醉--V-P--水杨苷--η引--肌醇..H2S--山梨醇--明胶液化--七叶苷--丙二酸盐利用_;_-侧金盖花醇_-_-注“+”为阳性，“-”为阴性。3结论本发明分离到的鮰爱德华氏菌(CHNGY01即CCTCCNO:M209176)与鮰爱德华氏菌标准株(ATCC33202)在生理生、化特性上基本一致，但两者在在枸橼酸盐利用与甲基红实验上却存在差异，CHNGYO1在枸橼酸盐利用与甲基红实验上均为阳性，而ATCC33202却均为阴性。实施例三本发明菌株CHNGY01与鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)制备的灭活全菌苗比较研究黄颡鱼的“红头病”是近年来发生的危害较为严重的一种传染性疾病，前面的研究已证实其病原为鮰爱德华氏菌。本实验进行了分离鮰爱德华氏菌与标准株ATCC33202制备的灭活疫苗对黄颡鱼红头病免疫效果的比较研究，为黄颡鱼红头病更好的开展免疫防治提供可靠的依据。1.材料与方法1.1菌种黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)分离并鉴定的来自然感染发生红头病的黄颡鱼鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)ATCC公司1.2实验鱼购自四川新某养殖场的健康黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，平均体重37.4士2.lg，实验前于水族箱内驯养1周。1.3疫苗的制备将黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)和鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)分别接种TSA平板，再用PBS洗下接种一系列的TSB肉汤经逐级增菌培养，采用平板计数法确定细菌浓度后，用浓度为0.5%(V/V)福尔马林，28°C灭活48h，制成全菌灭活疫苗。1.4疫苗安全性检查将制备的灭活全菌苗接种绵羊鲜血TSA琼脂平板，28°C恒温培养24_48h后观察平板上是否有细菌菌生长以判定菌体疫苗中是否含有未灭活的病原菌；同时采用腹腔注射的方法，将制备的菌体疫苗按正常接种量的5倍与10倍剂量接种健康黄颡鱼进行人工感染实验，接种后观察15d，检查菌体疫苗是否对健康黄颡鱼致病。1.5实验分组将100尾健康黄颡鱼随机平均分成5组，每组20尾。黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)和鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)制备的灭活全菌疫苗分别采用浸泡与注射两种免疫途径对黄颡鱼进行免疫，同时采用生理盐水设置对照组。1.6保护性实验免疫后3周，采用黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)对免疫组与对照组的实验鱼进行人工攻毒感染，每尾实验鱼腹腔注射黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)2.5X108CFU/ml病原菌0.lmL，观察各实验组的发病死亡情况，得出保护率。2.结果2.1疫苗的安全性通过平板计数法得出福尔马林灭活疫苗中的含菌量为4.5X101(lCUF/mL。将该疫苗0.ImL接种于绵羊鲜血TSA琼脂平板，在28°C下培养24-48h，未发现细菌生长。制备灭活全菌疫苗对健康黄颡鱼进行攻毒感染，观察15d未发现接种实验鱼发现异常。实验结果表明浓度为0.5%(V/V)的福尔马林在28°C条件下对病原菌进行48h的灭活，能将病原菌彻底灭活，制备的疫苗是安全的。2.2疫苗的保护性将黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)和鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)制备的全菌灭活苗，采用注射与浸泡两种免疫途径对健康黄颡鱼进行免疫3周后，用黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)对免疫后的实验鱼进行人工感染实验。结果发现黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)制备的全菌灭活疫苗免疫黄颡鱼后对“红头病”的保护率明显高于鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)制备的全菌灭活苗对黄颡鱼“红头病”的保护率。另外，从表1也可看出，在两种免疫途径中注射的免疫方式的免疫效果好于浸泡免疫途径。表1鮰爱德华氏菌(CHNGY01)与标准菌株(ATCC33202)制备的疫苗的保护性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.结论本实验发现，从自然感染发生红头病的黄颡鱼分离到的鮰爱德华氏菌(CHNGY01)制备的全菌灭活苗经浸泡与注射两种方式免疫黄颡鱼后都能产生针对“红头病”的免疫力，其保护率高于鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)制备的疫苗的保护率。该结果表明，鮰爱德华氏菌(CHNGY01)在免疫预防黄颡鱼“红头病”的疫苗制备上较鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)具有更强的针对性和更大的应用价值。实施例四本发明灭活疫苗的制备与免疫效果研究本实验对从自然发病黄颡鱼体内分离的鮰爱德华氏菌进行了灭活全菌苗的制备与免疫效果的研究，旨在为黄颡鱼“红头病”的免疫防治提供理论依据。1.材料与方法1.1材料黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)分离并鉴定的来自然感染发生红头病的黄颡鱼健康黄颡鱼购自四川新津某养殖场，平均体重37.4士2.lg，实验前于水族箱内驯养1周。1.2方法1.2.1疫苗的制备1.2.1.1菌种复苏在无菌条件下，取4°C条件下保存的鮰爱德华氏菌种用接种环从菌种管中挑取少量细菌接种到IOmlTSB肉汤，将接种后的肉汤放入水浴振荡器中，28°C，110r/min，振荡培养24h。1.2.1.2菌液增殖培养①初级培养把复苏培养的菌液IOml接种再次接种500mlTSB肉汤，将接种后的肉汤放入水浴振荡器中，280C，110r/min,振荡培养48h。②菌液次级培养将次级培养的TSB肉汤均勻的涂布在制备好的TSA平板上，将涂布好的TSA平板放入28°C恒温培养箱中，培养48h(注意培养时间以细菌苔长满整个平板为度)；在无菌工作室，用灭菌的生理盐水(0.85%NaCl)冲洗平板上生长的菌苔，将洗下的菌悬液置于灭菌的输液瓶中。③洗脱菌液扩大培养将从平板上洗脱的菌液按每IOml接种200mlTSB肉汤，进行菌液的扩大培养，28°C，llOr/min，振荡培养48h。得到高浓度细菌悬液。1.2.1.3菌液的计数对增殖培养后的菌液采用平板稀释细菌计数方法进行计数①选取大小一致的平板清洗高压灭菌后，制备TSA平板备用；②无菌操作将在菌苗制备过程中取的菌液进行倍比(IOn)稀释备用；③将稀释的菌液取0.ImL涂布TSA平板，28°C，恒温箱中培养36小时，计数菌落个数；④选择平均菌落数在30-300个之间稀释度的平板，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数，则为该菌样的细菌总数。菌落数X稀释度X10=细菌总数1.2.1.4菌液的灭活对扩大培养的菌液，按体积比例添加5-6%。的甲醛，放入水浴振荡器中，28°C，110r/min，振荡48h灭活。1.2.1.5菌苗的分装灭活完全的疫苗，无菌操作进行分装于500ml灭菌高温瓶中，并对橡胶塞有孔隙的应采用石蜡封闭。分装好的灭活疫苗应置于4°C保存，备用。1.2.2疫苗安全性检查将制备的灭活全菌苗接种绵羊鲜血TSA琼脂平板，28°C恒温培养24_48h后观察平板上是否有细菌菌生长以判定菌体疫苗中是否含有未灭活的病原菌；同时采用腹腔注射的方法，将制备的菌体疫苗按正常接种量的5倍与10倍剂量接种健康黄颡鱼进行人工感染实验，接种后观察15d，检查菌体疫苗是否对健康黄颡鱼致病。1.2.3实验分组将240尾健康黄颡鱼随机平均分成12组，每组20尾。将制备的灭活全菌疫苗10倍逐级稀释，分别采用浸泡与注射两种免疫途径对黄颡鱼进行免疫，同时采用生理盐水设置对照组(表1)。1.3保护性实验免疫后3周，采用黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)对免疫组与对照组的实验鱼进行人工攻毒感染，每尾实验鱼腹腔注射黄颡鱼鮰爱德华氏菌(CHNGY01)2.5X108CFU/ml病原菌0.lmL，观察各实验组的发病死亡情况，得出保护率，评定疫苗的免疫效果。2.结果2.1疫苗的安全性经平板计数法得出福尔马林灭活疫苗中的含菌量为4.5X101(lCUF/mL。将该疫苗0.ImL接种于绵羊鲜血TSA琼脂平板，在28°C下培养24-48h，未发现细菌生长。制备灭活全菌疫苗对健康黄颡鱼进行攻毒感染，观察15d未发现接种实验鱼发现异常。实验结果表明浓度为0.5%(V/V)的福尔马林在28°C条件下对病原菌进行48h的灭活，能将病原菌彻底灭活，制备的疫苗是安全的。2.2疫苗的保护性黄颡鱼注射与浸泡免疫3周后，用鮰爱德华氏菌(CHNGY01)对免疫后的实验鱼进行人工感染实验。结果发现制备的鮰爱德华氏菌(CHNGY01)全菌灭活疫苗经浸泡与注射免疫黄颡鱼后能产生抵抗“红头病”的能力，但不同的免疫方式中适宜的抗原浓度上存在差异，在浸泡免疫中灭活疫苗的菌体浓度在107-108CFU/ml较为适宜，而注射时其浓度在106-107CFU/ml则较为适宜。另外，从表1也可看出，在两种免疫途径中注射的免疫方式的免疫效果好于浸泡免疫途径。表1鮰爱德华氏菌(CHNGY01)灭活疫苗免疫后的保护情况疫苗菌体浓鱼数病原菌浓度接种量死亡数死亡率保护率度(CFU/ml)(尾)(CFU/ml)(ml/尾)(尾)(％)(%)4.5XIO5202.5XIO80.11470304.5XIO6202.5XIO80.1136535浸泡4.5X107202.5XIO80.1630704.5XIO8202.5XIO80.1525750202.5XIO80.12010004.5XIO5202.5XIO80.11260504.5XIO6202.5XIO80.184060注射4.5X107202.5XIO80.1315854.5XIO8202.5XIO80.1210900202.5XIO80.12010003.结论从自然感染发生红头病的黄颡鱼分离到的鮰爱德华氏菌(CHNGY01)制备的全菌灭活苗具有较好的免疫原性，经浸泡与注射两种方式免疫黄颡鱼后都能产生针对“红头病”的免疫力，其保护率在70-95%之间，浸泡免疫中灭活疫苗的菌体浓度在107-108CFU/ml较为适宜，而注射时其浓度在106-107CFU/ml则较为适宜。实施例五灭活疫苗水剂的制备1.鮰爱德华氏菌灭活疫苗的制备(1)菌种复苏在无菌条件下，取4°C条件下保存的鮰爱德华氏菌种用接种环从菌种管中挑取少量细菌接种到IOmlTSB肉汤，将接种后的肉汤放入水浴振荡器中，28°C，110r/min，振荡培养24h。(2)菌液增殖培养①初级培养把复苏培养的菌液IOml接种再次接种500mlTSB肉汤，将接种后的肉汤放入水浴振荡器中，280C，110r/min,振荡培养48h。②菌液次级培养将次级培养的TSB肉汤均勻的涂布在制备好的TSA平板上，将涂布好的TSA平板放入28°C恒温培养箱中，培养48h(注意培养时间以细菌苔长满整个平板为度)；在无菌工作室，用灭菌的生理盐水(0.85%NaCl)冲洗平板上生长的菌苔，将洗下的菌悬液置于灭菌的输液瓶中。③洗脱菌液扩大培养将从平板上洗脱的菌液按每IOml接种200mlTSB肉汤，进行菌液的扩大培养，28°C，llOr/min，振荡培养48h。得到高浓度细菌悬液。(3)菌液的计数对增殖培养后的菌液采用平板稀释细菌计数方法进行计数①选取大小一致的平板清洗高压灭菌后，制备TSA平板备用；②无菌操作将在菌苗制备过程中取的菌液进行倍比(IOn)稀释备用；③将稀释的菌液取0.ImL涂布TSA平板，28°C，恒温箱中培养36小时，计数菌落个数；④选择平均菌落数在30-300个之间稀释度的平板，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数，则为该菌样的细菌总数。菌落数X稀释度XlO=细菌总数⑤疫苗中含有的细菌数合适的浓度为108-101(lCFU/ml。(4)菌液的灭活对扩大培养的菌液，按体积比例添加5-6%。的甲醛，放入水浴振荡器中，28°C，110r/min，振荡48h灭活。(5)灭活效果检查灭活后的菌悬液每次需进行灭活效果的检查，在无菌操作下用接种环挑取少量灭活的菌苗在TSA平板上划线，将划线后的血平置于入28°C恒温培养箱中，培养48h，检查有无细菌生长，若有细菌生长需再进行灭活处理，若无细菌生长则进行下面的操作程序。(6)菌苗的分装灭活完全的疫苗，无菌操作进行分装于500ml灭菌高温瓶中，并对橡胶塞有孔隙的应采用石蜡封闭。分装好的灭活疫苗应置于4°C保存，备用。制备成水剂时，使用时可以与10mg/l的氮酮促渗剂联合应用，可同时混合使用，也可分别施用。实施例六灭活疫苗粉剂的制备(1)冷冻干燥法将无菌操作条件下分装好的福尔马林灭活联合全菌疫苗水溶液，放入真空冷冻干燥机进行预冻，待预冻达到一定温度时抽真空干燥。冻干结束后，充入干燥无菌的空气进入干燥箱，然后尽快地进行加塞封口，以防重新吸收空气中水分。(2)低温烘干法将无菌条件下分装好的福尔马林灭活全菌联合疫苗水溶液在低温条件下进行水分蒸发烘干，加入吸附剂沸石或硅藻土低温烘干，烘干后的粉剂存放于无菌的玻璃瓶中。整个操作过程需在无菌条件下进行，烘干温度在40°C-50°C，以免影响抗原性。干燥后加入辅料可溶性淀粉，得到全菌苗粉剂，规格=IO8-IOltlCfu/^权利要求鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)在制备鱼用疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)为保藏编号为CCTCCNO:M209176的菌株。3.一种鱼用疫苗，其特征是含有致免疫有效量的灭活的鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)，及药学上可接受的辅料或载体。4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征是所述鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)为保藏编号为CCTCCNO:M209176的菌株。5.根据权利要求3或4所述的鱼用疫苗，其特征是所述的致免疫有效量为106-108CFU/ml。6.根据权利要求3所述的鱼用疫苗，其特征是所述的辅料或载体为水或吸附剂。7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征是所述的水为生理盐水或蒸馏水；吸附剂是沸石或硅藻土。8.一种联合用疫苗，包含权利要求3所述的鱼用疫苗以及透皮吸收促进剂且任选一种或多种药学上可接受的辅料或载体。9.根据权利要求8所述的联合用药物，其特征是所述透皮吸收剂为氮酮。10.权利要求3或8所述的鱼用疫苗或联合疫苗在制备预防黄颡鱼红头病的药物中的用途。全文摘要本发明提供鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)在制备鱼用疫苗中的应用。本发明还提供一种鱼用疫苗，它含有致免疫有效量的灭活的鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)，及药学上可接受的辅料或载体。本发明的疫苗或者联合疫苗能够针对性的防治黄颡鱼红头病，效果良好，是一种成本低廉，健康环保的防治方法。文档编号A61K39/00GK101829321SQ20091022199公开日2010年9月15日申请日期2009年11月17日优先权日2009年11月17日发明者刘衍鹏,康琦,方芳,罗远会,耿毅,肖丹,邓龙君,黄冠军申请人:通威股份有限公司