专利名称：一种预防鸡疾病的疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种禽疫苗，尤其是涉及ー种鸡疾病的疫苗及其制备方法。
背景技术：
长期以来，鸡群由于群居，容易爆发疾病，特别是传染性疾病，比如鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病。鸡群常见的传染性疾病对养殖的影响非常大，如果不预防，将给养殖户带来巨大的经济损失。所以传染性疾病的预防性疫苗就凸现出了重要性。目前还 没有特别有针对性的预防传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。另外菌种的分离方法多种多样，根据菌的不同来源和其本身的特点分离方法也各不相同，正确的分离培养有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断是至关重要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种预防传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。为实现上述目的，本发明提供ー种鸡病原黄杆菌菌株，属黄杆菌科，学名为鸡黄杆菌 001 Flavobacterium sp. 001，保藏号为 CCTCC NO: M 2012100，于 2012 年 4 月 8 日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。为得到本发明所述的鸡病原黄杆菌菌株，本发明还提供了一种分离方法，其步骤为
菌种的分离
取发生传染性肝炎的病鸡肝部组织ー小块(约50mg)放于装有300ul 1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取IOOul于分别含有氨苄，卡纳和氯霉素的LB平板涂布，37°C培养24h ;结果只有在含有氨苄和卡纳的平板上有菌落生长；
菌种扩大培养
从上述长菌的平板中挑单菌落到抗生素的250ml LB液体培养基中，37°C摇床培养24-30小时，测0D600约为2. 0 ;其抗生素为同时含有氨苄和卡纳；
菌种鉴定
取上述扩大培养的菌液测序，得出所测的菌种是黄杆菌；具体为取上述扩大培养的菌液30ul送上海英俊生物技术有限公司测序，测序引物为16s引物，其序列为27F AGAGTTTGATCCTGGCTCA (SEQ ID NO: 1)；1492R GGTTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID N0:2);将测序所得序列在 NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/BlastAlign. cgi)上比对，或者将所得序列翻译为蛋白序列后在 NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/BlastAlign. cgi)上比对，最后得出所测的菌种是黄杆菌；
菌种的保存
将上述扩大培养所得菌液进行20%甘油保菌法-80度保藏即可。即将灭菌后的甘油20ul中加80ul的菌液，充分混匀后即可。
本发明还提供了ー种鸡病原黄杆菌菌株的疫苗，可以是灭活疫苗。本发明所述疫苗的制备方法是
接种将权利要求I所述鸡病原黄杆菌菌株用灭菌生理盐水稀释后注射接种7日龄易感雏鸡；取病鸡肝部组织ー小块放于装有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎，制成生产用菌种；
灭活病菌液将上述制成的生产用菌种中加入甲醛溶液，边加边充分摇匀，置摇床灭活，作为制苗用抗原液；
乳化制备疫苗油相注射用花生油占10%，水相淀粉占2%和87ml的PBS混合后灭菌，之后将灭菌的吐温-80加到水相之中，占1%，将上述佐剂加上同样体积的制苗用抗原液后进行乳化，充分振摇使吐温完全溶解；在乳化終止前加入防腐剂；防腐剂为I %硫柳汞，加入量占疫苗总体积的1%，最終浓度为万分之一；
分装将乳化得到的疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，密封，4°C保存即可。制备方法还包括检测是否完全灭活的步骤。在确保完全灭活病菌的同时尽量減少甲醛使用量，对病菌抗原液在不同甲醛灭活终浓度(0.1^.0.2^.0.3^^0 0.4%)及灭活时间(3h、6h、12h、24h和48h)进行了多次交叉重复实验。研究结果表明甲醛终浓度为
0.4%，灭活时间为48h，灭活效果最佳。检测是否完全灭活的方法可为取灭活的菌液于同时含有氨苄和卡纳的LB平板涂布，37°C培养72小时，平板上是否长菌；同时取灭活菌液于同时含有氨苄和卡纳的LB液体培养基中，37°C培养72小时，液体培养基是否长菌；以上两点均没有长菌，则说明菌液已经完全灭活。本发明还提供按照上述制备方法制备所得的疫苗。本发明的制备方法具有如下优点方法简单，效果良好，经过多批次的动物实验和田间试验，结果表明疫苗对鸡群无不良反应，鸡群在免疫后I个月测HI抗体水平，几何平均滴度ND为9. 8 10. 51og2。鸡群生长状况良好，开产后产蛋性能良好，产蛋量与蛋壳质量正常，在6个月观察期内，免疫组死淘率较同群未免疫对照组降低0. 6% 2. 5%。上述制备方法制备的灭活疫苗质量确实、可靠，符合要求。本发明制备的疫苗可用于预防鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病，达到预防疾病的效果。临床实验的结果表明本发明的疫苗对鸡群无不良反应，鸡群在免疫后I个月测HI抗体水平，几何平均滴度黄杆菌为9. 8 10. 51og2。鸡群开产后产蛋性能良好，产蛋量与蛋壳质量正常，在6个月观察期内，免疫组死淘率较同群未免疫四联苗对照组降低0. 6% 2. 5%，平均每只鸡多产蛋2 6枚。免疫后鸡群可产生较高的抗体水平，維持期较长，对强菌攻击具有较好的保护效果。本发明通过小试、实验室工作、エ艺探索等具体工作，结合实验室研究多批次试制产品和5个批次的エ业化流水生产线中试生产，经过多批次的动物实验和田间试验，获得了大量的实验数据，实验结果的符合对比均证实，研制的“鸡黄杆菌灭活疫苗”质量确实、可靠，符合要求。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例I :菌种分离方法和标准
I、囷种制备
(1)菌种的分离
取发生传染性肝炎的病鸡(福建厦门翔安内盾养鸡场)肝部组织ー小块(约50mg)放于装有300ul 1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取IOOul于分别含有氨苄，卡纳和氯霉素的LB平板涂布(氨苄0. 05mg/ml;卡纳0. 04mg/ml)，37°C培养24h ;结果只有在含有氨苄和卡纳的平板上有菌落生长；
(2)菌种扩大培养
从上述长菌的平板中挑单菌落到同时含有氨苄和卡纳的250ml LB液体培养基中(氨苄:0. 05mg/ml;卡纳0. 04mg/ml )，37°C摇床培养 24-30 小时，测 OD600 约为 2. 0;
(3)菌种鉴定
取上述扩大培养的菌液30ul送上海英俊生物技术有限公司测序，测序引物为16s引物，其序列为 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCA (SEQ ID NO: I) ；1492R :GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO: I);将测序所得序列在 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi)上比对,或者将所得序列翻译为蛋白序列后在NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih.gov/BlastAlign. cgi)上比对,最后得出所测的菌种是黄杆菌；
(4)菌种的保存和保藏
采用20%甘油保菌法，即将灭菌后的甘油20ul中加80ul的菌液，充分混匀后，-80度保藏(注意甘油要慢慢吸)。保存的菌种送到CCTCC，进行保藏，保藏号为CCTCC NO M2012100，(2012年4月8日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC));
2、菌种标准(鸡黄杆菌应符合下列标准)
2. I对鸡肝内致病指数(ICPI)按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)(以下简称“标准”)附录316页进行，应为0. I 0. 4;
2.2对雏鸡最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)按“标准”附录316页进行，应为103 119小时;
2.3红细胞凝集价按“中华人民共和国兽药典”(2005年版)(以下简称“中国兽药典”)附录28页进行，含菌鸡胚液对红细胞凝集价应> 91og2 (微量法)；
2. 4安全性用2 7日龄雏鸡20只，分成两组，第I组10只，每只注射接种5倍稀释的含菌液0. 05ml，第2组10只，不接种作为对照，两组在同样条件下分别饲养管理，观察10天，应无不正常反应。如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不应超过I只；
2. 5免疫原性对I月龄鸡注射接种，最小免疫量应< 5000EID5Q;
2.6纯净应无细菌、霉菌(按“中国兽药典”附录15页)、支原体(按“中国兽药典”附录19页)及外源病菌(按“中国兽药典”附录20页)污染；
2. 7特异性；
2.8基础种子代数E2 E5代；2.9菌种保存_20°C以下保存，冻干菌种保存期为72个月。实施例2 :制备生产用菌种
将实施例I所得鸡黄杆菌菌种用灭菌生理盐水稀释后注射接种2 7日龄易感雏鸡，取病鸡肝部组织ー小块(约50mg)放于装有300ull% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎，制成生产用菌种。实施例3 :疫苗制造生产エ艺 1、甲醛灭活剂的使用浓度和灭活时间
在确保完全灭活病菌的同时尽量減少甲醛使用量，对病菌抗原液在不同甲醛灭活终浓度(0. 1%、0. 2%、0. 3%和0. 4% )及灭活时间(3h、6h、12h、24h和48h)进行了多次交叉重复实验。研究结果表明甲醛终浓度为0.4%，灭活时间为48h，灭活效果最佳；
2、灭活疫苗的生产エ艺
为完善生产エ艺，经对不同生产过程进行了多次重复比较后，建立了相应的规范；
抗原制备采用黄杆菌菌株，接种2 7日龄易感鸡胚生产病菌抗原液，收获的病菌抗原液病菌含量彡108 0EID50/0. Iml ；
乳化制备疫苗油相注射用花生油占10%，水相淀粉占2%和87ml的PBS混合后灭菌，之后将灭菌的吐温-80加到水相之中，占1%，将上述佐剂加上同样体积的制苗用抗原液后进行乳化，充分振摇使吐温完全溶解；在乳化終止前加入防腐剂；乳化工艺油乳剂灭活疫苗稳定性较好，粘度适中；
在多次重复エ艺性探索基础之上，并结合实验室研制和エ厂化生产，经过一系列的检测验证，证实该エ艺技术稳定，成熟度高，各项指标均符合“生物制品规程”和“进ロ兽药质量标准”中单价疫苗标准。实施例4:成品检验
1、物理性状 外观为乳白色乳剤。剂型呈油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴外，应呈油滴状，不扩散；
稳定性取IOml疫苗于离心管中，经3000r/m离心15min,应不出现分层现象；37°C条件下放置21日，应不破乳；
粘度用Iml吸管(下口内径为I. 2mm，上口内径为2. 7mm)，吸取25°C左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0. 4ml所需的时间，在8秒以内判为合格；
2、无菌检验按“中国兽药典”附录15页进行，应无菌生长；
3、安全检验取3 7周龄雏鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗0.4ml (2羽份)，观察14日，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应；
4、效カ检验
采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻菌法进行效力检验；血清学方法用3 7周龄雏鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗2ml (10羽份)，另5只作对照。接种后21 28日，每只鸡分别采血，分离血清，按“中国兽药典”进行HI抗体效价測定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应> 41og2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应< 21og2 ；免疫攻菌法用3 7周龄雏鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗2ml (10羽份)，另5只作对照。接种后21 28日，每只鸡各肌肉注射鸡黄杆菌1ml，观察14日，对照组全部死亡，免疫组至少保护7只；
5、甲醛含量測定分别按“中国兽药典”附录24、25页进行，应符合规定；
6、作用与用途用于预防鸡传染性肝炎，免疫期为6个月；
7、用法与用量皮下或肌肉注射，用于七日龄雏鸡接种，每只0.2ml;用于开产前 (110 140日龄)蛋鸡及种鸡的免疫接种，每只Iml ；
8、注意事项
8. I非健康鸡切忌注射本品；
8. 2所要预防的禽病菌亚型一定要与本品标示的亚型相一致，否则无效；
8. 3本品严禁冻结，应保存在2 8°C恒温条件下；
8. 4本品如出现破损、异物或破乳分层等异常现象切勿使用；
8. 5注射前应将疫苗恢复至室温；
8、6建议在当地兽医正确指导下正确使用；
9、贮藏2 8°C保存，有效期为18个月；
10、规格IOOml/瓶，250ml/瓶，500ml/瓶。实施例5 :灭活疫苗的对比试验
灭活疫苗采取注射免疫法与混饲免疫法两种方式
1、注射免疫法是将灭活疫苗用注射器直接注入到鸡的颈部皮下。注射接种方法用手轻轻地提起鸡的颈部皮肤，从颈部中段以下身体方向刺入；
保存在4°C的灭活菌液使用前时与等量完全佐剂充分混匀；使用注射方法，10日龄德化黑鸡0. 2mL/羽，德化黑鸡成鸡(3月龄)=ImL/羽。对照组使用生理盐水与等量完全佐齐U。每组20只，注射免疫15天后进行活菌感染实验。将离心沉淀的处于对数生长期的黄杆菌均匀地混入饲料中，按照黄杆菌湿重50克对I公斤饲料的比例均匀混合，混匀的饲料在2小时内喂完。所有用具及时收集消毒灭菌。以正常饲料喂养做对照。从注射日起共观察45天。结果见表I和表2 ;
表I :10日龄鸡存活率_
组另Il_0天15天20天30天45天
正常饲料喂养；未注射100% 95% 95% 95% 95%
正常饲料喂养；注射生理盐水对照100% 100% 95% 95% 95%
正常饲料喂养；注射黄杆菌灭活疫苗100% 100% 100% 100% 100%
活菌饲料喂养；未注射100% 100% 65% 30% 25%
活菌饲料喂养；注射生理盐水对照100% 100% 70% 40% 30%
活菌词料喂养；注射黄杆菌灭活疫苗ll00%l[00%〔95% >5% 195%
表2 :成鸡存活率(3月龄)
组另Il_0天15天20天30天45天
正常饲料喂养；未注射100% 100% 100% 100% 100%
正常饲料喂养；注射生理盐水对照100% 100% 100% 100% 100%
正常饲料喂养；注射黄杆菌灭活疫苗100% 100% 100% 100% 100%
活菌饲料喂养；未注射100% 100% 75% 60% 45%
活菌饲料喂养；注射生理盐水对照100% 100% 85% 70% 50%
活菌词料喂养；注射黄杆菌灭活疫苗00% [100% 100% [100% 100%
2.混饲免疫法是通过消化道的ロ服免疫方法。每组20只鸡，将离心沉淀的灭活黄杆菌均匀地混入饲料中，让德化黑鸡(10日龄鸡和3月龄成鸡)在吃食时同时将灭活疫苗吃进去。按照灭活黄杆菌湿重50克对I公斤饲料的比例均匀混合，混匀的饲料在2小时内喂完；在这之后15天进行活菌感染实验。将离心沉淀的处于对数生长期的黄杆菌均匀地混入饲料中，按照黄杆菌湿重50克对I公斤饲料的比例均匀混合，混匀的饲料在2小时内喂完。所有用具及时收集消毒灭菌。以正常饲料喂养做对照。从饲喂日起共观察45天，结果见表3和表4 ；
表:3 :10日龄鸡存活率_
权利要求
1.ー种鸡病原黄杆菌菌株，保藏号为CCTCC M 2012100。
2.—种制备权利要求I所述的鸡病原黄杆菌菌株的方法，其特征在于， 菌种的分离取发生传染性肝炎的病鸡肝部组织ー小块放于装有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取一定量于分别含有不同抗生素氨苄，卡纳和氯霉素的LB平板涂布，37°C培养24h ;结果只有在含有氨苄和卡纳的平板上有菌落生长； 菌种扩大培养从上述长菌的平板中挑单菌落到含抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床培养24-30小时； 菌种鉴定取上述扩大培养的菌液测序，得出所测的菌种是黄杆菌； 所述菌种扩大培养中所述的抗生素为同时含有氨苄和卡纳，测序所用引物为16s引物，序列分别为AGAGITTGATCCTGGCTCA 和 GGTTACCTTGTTACGACTT。
3.ー种含有权利要求I所述鸡病原黄杆菌菌株的疫苗。
4.权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是灭活疫苗。
5.权利要求3所述的疫苗用于预防鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的用途。
6.ー种利用权利要求I所述的菌株制备权利要求4所述灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤接种将权利要求I所述鸡病原黄杆菌菌株用灭菌生理盐水稀释后注射接种7日龄易感雏鸡；取病鸡肝部组织ー小块放于装有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎，制成生产用菌种； 灭活病菌液将上述制成的生产用菌种中加入甲醛溶液，边加边充分摇匀，置摇床灭活，作为制苗用抗原液； 乳化制备疫苗油相注射用花生油占10%，水相淀粉占2%和87ml的PBS混合后灭菌，之后将灭菌的吐温-80加到水相之中，将上述佐剂加上同样体积的制苗用抗原液后进行乳化，充分振摇使吐温完全溶解；在乳化終止前加入防腐剂； 分装将乳化得到的疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，密封，4°C保存即可。
7.权利要求4的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，还包括检测是否完全灭活的步骤。
8.权利要求4的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，灭活病菌液吋，甲醛的终浓度约为0.4%，37°C摇床灭活48小时。
9.权利要求4的灭活疫苗的制备方法，其特征在干，乳化制备疫苗吋，吐温-80加入量占水相体积的1%，防腐剂为I %硫柳汞，加入量占疫苗总体积的1%，最终浓度为万分之o
10.ー种按照权利要求6 — 9任一方法制备的疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种预防鸡疾病方法的疫苗及其制备方法。保藏号为CCTCCM2012100的鸡病原黄杆菌菌株，和含有该菌的疫苗，该疫苗的制备方法为接种将鸡病原黄杆菌菌株用灭菌生理盐水稀释后注射接种7日龄易感雏鸡；取病鸡肝部组织一小块放于装有1%TritonX-100的EP管中，用研磨棒研碎，制成生产用菌种；灭活后乳化分装即可。本发明的疫苗可用于预防鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病。制备的灭活疫苗质量确实、可靠，符合要求，安全性高，对鸡群的免疫效果好，抗体水平高，维持期较长，对强菌攻击具有较好的保护效果，同时不影响鸡产蛋。
文档编号C12R1/20GK102643768SQ201210124689
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者杨慧, 翁勤, 胡彬, 陈建明, 陈敏 申请人:厦门安特奥生物工程有限公司