专利名称：硫酸糖脂抗原、其制备方法及其抗结核病的用途的制作方法
硫酸糖脂抗原、其制备方法及其抗结核病的用途
本发明涉及新的硫酸糖脂(sulfoglycolipid)抗原，其制备方法及其 在治疗或预防结核病中的用途。
每年，据估计结核病是导致3百万人死亡的原因。导致该疾病的 致病试剂是细菌，结核分枝杆菌，全世界每三个人就有一个人被其感 染。被感染人群通过打喷噢或咳嗽使其穿过空气传播。细菌可能以非 活性状态潜藏在被感染的人群中，而这种人群永远不会患上该疾病。 但是，在某些情况，例如老化或者免疫系统低弱时，细菌可能活化并 导致发作结核病。
分枝杆菌被膜似乎是分枝杆菌属细菌毒力的重要部分。事实上， 分枝杆菌高达40%的干重是由脂类构成的。在那些脂类中，其中的一 些似乎仅限于结核分枝杆菌，例如硫酸糖脂(Vergne I.和Daffe M.
5/仍c,Vwce (1998) 3: 865-876)。糖脂族的代表是在海藻糖 单元的2'位上具有硫酸酯取代基(即a-D-吡喃葡糖基-(l-l，)-a'-D-吡喃 葡糖苷)(A)。
<formula>formula see original document page 15</formula>A
该族成员彼此的区別在于在海藻糖单元上取代的脂肪酸的数量、 位置和类型不同。特别地，脂肪酸取代基包括棕榈酸、硬脂酸、结核 菌酸(phthioceranoic acid)和羟基结核菌酸(hydroxyphthioceranoic acid)。后两种脂肺酸代表了硫酸糖脂的特征。最广泛的硫酸糖脂是SL-I (Goren等，5&c/iew/对^ (1976) 15: 2728-2735) (B)。
Hydroxyphthioceranoyl
O
II
0—C—CH-
CH,(CH2)q-0 Palmitoyl 0
Hydroxyphthioceranoyl OH
14 or 16
Phthioceranoyl
B
已证实SL-I能够抑制巨噬细胞的抗菌活性和阻断若干炎性试剂， 例如LPS、 IFN-y或TNF-ot对巨嗟细胞的作用(Vergne I.和Daffe M. jFVow^rs (1998) 3: 865-876)。
目前，有两种抗击结核病的方式抗生素疗法和接种疫苗。 用于预防结核病的疫苗由牛分枝杆菌属的减活细菌构成。20世纪 初，两名科学家首先设计出了疫苗，之后其被命名为BCG,卡介苗。 除了其作为活疫苗而阻碍其被用在免疫抑制病人中的缺点之外，其对 抗结核病的保护作用也是有争议的。因此，根据不同的研究，BCG在 成人中的保护效果为0%-80%，此外，其不能对抗成人中最普遍的 肺结核病。
而且在超过35个国家中都发现了结核分枝杆菌的耐抗生素菌抹。 因此，本发明的目的是提供一种更有效的治疗和/或预防结核病的 方式。
WO 2004/092192中公开了从结核分枝杆菌中提取的其它致免疫 的糖脂。但是，这些天然产品只能获得有限的量；此外，其得自病原菌林，其制备过程可能有毒并且需要特定的安全设置。
因此，非常希望提供在工业规模和可实行的条件下获得致免疫糖 脂的其它新的合成方法。
值得注意地，本发明提供新的合成的硫酸糖脂抗原，其显示出在
体外能够刺激CDl-限制性T淋巴细胞。 本发明涉及下列式(i)的化合物
其中
r2'、 r3'相同或不同，独立地选自h、 S03H或S037M+，条件是 R2'、 R3'中的至少一个为S03H或S037M+;
优选地，W为S03H或S(V/M+，且R3'为H。 - M+为金属的阳离子，例如Na+、 K+。 R2、 RS相同或不同，独立地选自
a) 脂肪酰基
O
b) -S-X,其中X为任选被一个或多个取代基取代的不饱和直链
或支链烃链；
其中R2、 Rs中的至少一个为b);
及其对映异构体，非对映异构体，其混合物和药学上可接受的盐 或酯。
优选地，X为式(b-l):
-crj=crj-Y (b画l)其中
-Y为任选被一个或多个取代基取代的饱和或不饱和、优选饱和 的直链或支链烃链。
优选地，Y为任选被l-10个，更优选l-4个烷基，优选甲基取 代的饱和直链烷基链。
更优选地，所述曱基位于Y链的C-l、 C-3、 C-7或C-9位上。
更优选地，被取代的碳原子显示(S)构型。
-R、 RJ相同或不同，独立地选自H、烷基；优选地，Ri为曱 基，且RJ为H。
Ri和RM吏所述构型可为(E)或(Z)。
#4居优选的方面，b)链为式(b-2):<formula>formula see original document page 18</formula>
其中
r为选自1、 2或3的整数；优选1; l为选自0-IO的整数；优选l、 2或3; q为0-50的整数；优选5 - 50;更优选10 - 20; 条件是l + q^l;
每个Ti相同或不同，独立地选自烷基；优选地，每个Ti为甲基。 f所连接的碳原子为不对称的。优选地，所述碳原子显示(S)构型。 f为烷基；优选甲基。
根据另一个优选方面，W为如上定义的a)脂肪酰基，且R"为如 上定义的b)-C-O-X。
脂肪酰基衍生自脂肪酸基团，其将2'-或3'-硫酸化海藻糖单元的2 位或3位上的羟基酯化。脂肪酸基团为脂肪族羧酸，其可以为直链或支链的、饱和或不饱 和的、未取代的或被诸如羟基或酮取代。
优选地，它们含有5-50,优选15-50个碳原子，并且更尤其可 以选自
隱chH""CH，
(辛酰基)
2 /l4 3
(棕榈酰基)
2 /l6 3
(硬脂酰基)
2 /l8 3
(二十烷酰基)
-CH2~trCH3
20
(二十二烷酰基)
2 /22 -
(二十四烷酰基)
H K
3
-CH厂CH十CH-
CH3 OH
-CH;
CH3 (羟基结核菌酰基)
(hydroxyphthioceranoyl)
其中m为14或16且n为2-10的整数，
o II
隱C—CH-ch。
-CH2—CH-I
-CH2tCH3
(结核菌酰基) (phthioceranoyl)
其中m为14或16且n为2-10的整数，
特别地，所述脂肪酰基包含直链和饱和的脂肪酰基，例如根据式 .C-0-(CH2VCHs(其中k为14 - 50的整数)的基团。
cIc再更优选地，脂肪酰基选自棕榈酰基和硬脂酰基。
本发明更尤其涉及式I的化合物，其中议2代表脂肪酰基，优选棕
榈酰基或硬脂酰基，且RS代表(b-2)链，即下式(II)的化合物
其中R"、 R3'、 r、 p、 1、 q、 T2、亡如上述定义，或其相应的盐， 及其对映异构体，非对映异构体，其混合物和药学上可接受的盐 或酯。
本发明尤其涉及式II的化合物，其中
一 1=1，q =14且r =l;
一 1二2，q =14iLr =1;
_ 13,q =14JLr =1;
一 1=4,q =14iLr =1;
一 11,q =14JLr =2;
一 12,q =14iLr =2;
一 1=3,q =14JLr =2;
一 14,q =14JLr =2;
一 1=1,q =12且r =1;
一 12，q =12JLr =1;
- 13，q =12JLr =1;
一 1=4，q =12JLr =1;
H3C~(CH2)p
HO— R3'0- 1=1, q =12JLr = 2
一 1=2, q =12且r = 2
一 1=3,q =12iLr = 2
- 1=4,q =12JLr = 2
_ 1-l，q-16iLr = l
一 1=2， q =16_@Lr = l.
- 1=3，q =16iLr = l.
一 1=4， q =16JLr = l，
- 1=l，q =16JLr = 2;
_ 1=2,q =16JLr = 2
一 1=3，q =16JLr = 2;或者
_ 1=4， q =16JLr = 2;
其中p为6 _22，和f和Ti为甲基。<formula>formula see original document page 22</formula><formula>formula see original document page 23</formula>(n.io)
及其相应的盐，及其对映异构体，非对映异构体，其混合物和药学上可接受的盐 或酯。
如本文中所用的，"药学上可接受的盐"指所公开的化合物的衍生 物，其中通过形成其酸或碱盐而改变母体化合物。所述药学上可接受 的盐包括母体化合物与例如非毒性无机或有机酸形成的常规的非毒性 盐或季铵盐。例如，这种常规的非毒性盐包括那些衍生自无机酸，例
如盐酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐；和由有机酸，例如乙 酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲 苯磺酸、草酸等制备的盐。
本发明的药学上可接受的盐可以由含有碱性或酸性结构部分的母 体化合物通过常规的化学方法合成。通常，这种盐可以通过使游离酸 或碱形式的这些化合物与化学计量量的适当的碱或酸在水或有机溶 剂，或者在二者的混合物中反应而制得。通常，优选非水介质，例如 醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。适当的盐系列在/^附^^OM iVtfl簡flcew,/o / 5Wewces, 17th ed.， Mack Publishing Company, Easton, PA， 1985， p. 1418中可以找到，其内容据此结合进来作为参考。
根据另 一个实施方案，本发明涉及一种包含至少两种不同的诸如 上面定义的式I化合物的組合物。
本发明还涉及包含至少一种如上定义的化合物或者如上定义的组 合物，并结合有药学上可接受的载体的组合物。
药学上可接受的载体尤其包括脂质体。
所述组合物还可以包含疫苗助剂。用于人类个体或者动物的疫苗 助剂对所属领域熟练技术人员来说是公知的，这种盐系列可以在例如 "A compendium of vaccine adjuvants and excipients，,，第2版，Vogel 等中找到。特别地，特定的疫苗助剂包括例如铝盐或M59。
本发明尤其涉及一种上面定义的药物组合物，其特征在于提供的 药物组合物为意图用于口服或可注射途径的形式。本发明更尤其涉及一种上面定义的药物组合物，其特征在于其包
含一种或多种可用于治疗或预防结核病的其它产品，例如BCG或分 枝杆菌蛋白。
BCG代表卡介苗，目前用于接种的BCG的不同菌林在Behr M.A. 等，5We"ce (1999) 284: 1520-1523中作了特别描述。
措词"分枝杆菌蛋白"指由分枝杆菌属细菌基因组，和特别地由结 核分枝杆菌基因组编码的蛋白或其片段，有利地这种蛋白可以为重组 体。根据优选的实施方案，所述分枝杆菌蛋白为结核分枝杆菌抗原。
可用于治疗或预防结核病的其它产品特别地包括免疫调节剂，例 如细胞因子、DNA片段编码的结核分枝杆菌抗原、活结核分枝杆菌缺 失突变体，例如缺失了有毒基因的突变体，或者活重组BCG,例如 BCG表达的结核分枝杆菌抗原。
如本文中所用的，结核病指由结核分枝杆菌导致的人体内的疾病， 还指在动物体内的相应疾病。
根据另一个实施方案，本发明涉及产品，所述产品包含 -至少一种上面定义的化合物，和
-至少一种可用于治疗或预防结核病的其它产品，例如BCG或 分枝杆菌蛋白
作为组合制剂同时、分别或依次用于治疗或预防结核病。 本发明还涉及至少一种上面定义的化合物或上述组合物用于制备
意图治疗或预防结核病的药物，特别是疫苗的用途。
任选地，所述疫苗可以包含疫苗助剂，例如上面描述的助剂。 本发明涉及至少一种上面定义的化合物或如上定义的组合物作为
免疫反应活化剂，更尤其作为炎性反应活化剂的用途。
"免疫反应活化剂"意指在体外或体内能够活化免疫反应的组分或
过程，尤其是免疫系统的细胞的化合物，所述免疫系统细胞例如为T
淋巴细胞、B淋巴细胞、诸如树突状细胞或巨噬细胞、单核细胞或粒
细胞的抗原呈递细胞(APC)。"炎性反应活化剂，，意指在体外或体内能够活化炎性反应的组分或 过程，例如血细胞渗出、毛细管渗透、巨噬细胞活化或发热的化合物。
本发明还涉及至少一种如上定义的化合物或者如上定义的组合物
用于诱导T淋巴细胞，特别是CD1-限制性T淋巴细胞的用途。所述 活化作用可以在体内或体外进行。
可以通过若千种方法评价T淋巴细胞的活化，例如测量细胞增殖 或细胞因子的产生，例如IFN-y(干扰素-力、11^2(白介素-2)、 IL4(白 介素-4)或TNF-a (胂瘤坏死因子a)。
CDl-限制性T淋巴细胞是被CD1分子所提供的抗原活化的T淋 巴细胞。
本发明还涉及至少一种如上定义的化合物或者如上定义的组合物 用于i秀导IFN-y、 TNF-a、 IL-4或颗粒溶素的产生的用途。
这种产生诱导可以在体外或体内进行。IFN-y、 TNF-a、 IL-4或颗 粒溶素的产生可以例如通过免疫分析法，例如ELISA (酶联免疫吸附 测定)或EIA (酶免疫分析)来测量。
本发明还涉及至少一种如上定义的化合物或者上述组合物用于制 备用来诊断结核分枝杆菌感染的组合物的用途。
由于目前的试验(结核菌素或所谓的"PPD"试验)不能从那些实际 上感染了潜伏结核病的PPD+病人中区分出接受了 BCG的那些PPD+ 个体，因此可以说明结核病的诊断4艮困难。
因此高度希望提供一种专用于结核分枝杆菌感染的试验。
现在本发明的化合物使其成为可能。
本发明的化合物对结核分枝杆菌属具有高度特异性。其可以用于 将PPD+个体识别为接种了 BCG的个体和实际上被结核病感染的个 体。
根据进一步的方面，本发明因此提供一种诊断结核分枝杆菌感染 的方法，其包括下列步骤—提供来自ppd+个体的生物试样; -使所述试样与式(X)化合物接触
OR3
(X)
其中
r2'、 R3'相同或不同，独立地选自H、 S03H或s037m+，条件是 r2'、 R3'中的至少一个为S03H或s037m+;
优选地，r"为s03h或s037m+， R3'为h。 - m+为金属阳离子，例如Na+、 k+。 r2、 rS相同或不同，独立地选自
a) 脂肪酰基
o
b) -^-X，其中X为任选被一个或多个取代基取代的不饱和直链
或支链烃链；
及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐 或酯，
-评价T淋巴细胞的活化；和
-对比给药所述化合物之前和之后的T淋巴细胞的活化。 T淋巴细胞被激活(ie)，例如给药本发明的化合物后释放的IFN-y 增加的那些个体感染了结核分枝杆菌。
本发明还提供一种诊断结核病的试剂盒，其包括 一式(X)的化合物； -树突状细胞；
-检测T淋巴细胞的活化，例如IFN-y的释放的装置。
27通常，使用任意的人IFN-y ELISA检测试剂盒(例如，购自BD Pharmingen)，测量用树突状细胞和硫酸糖脂刺激48小时后在上清液 中释放出的IFN-y，从而检测T细胞的硫酸糖脂活化作用。
本发明还涉及本发明的化合物用于评价由重组结核分枝杆菌制备 的疫苗的效果的用途。已经使用由结核分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG 获得的重组活菌来研发疫苗，其可以例如过表达蛋白。非常希望评价 这种疫苗是否有效和是否对给药的病人起保护作用。本发明的诊断方 法使评价成为可能。
本发明还涉及用于式(X)化合物的特定配体。
如本文中所意图的，"特定的配体，，涉及能够被制备或者诱导出的、 特异性结合在本发明化合物上的任何化合物。
特定的配体特别地包括抗体和适体(aptamer)。
术语"抗体"涉及全抗体，尤其是单克隆抗体，还涉及保留了特异 性结合到本发明化合物上的能力的抗体片段，例如Fab 、 Fab， 、 F(ab，)2 、 Fv或scFv片段。
抗体制剂是所属领域技术人员公知的。通常，通过各种途径，例 如肌肉内、血管内或腹膜内途径将本发明的化合物的制剂给药于动物， 例如小鼠、大鼠、兔或山羊。为了提高抗体的产生，在第一次给药之 后可以额外给药。之后，抗体得自从动物体取出的血液或者得自血液 衍生物，例如血清或血浆，并且任选使用例如亲合色谱法进行纯化。 特别地可以按照Koller & Milstein (1975) iV"似"256: 495-499的描述 制备单克隆抗体。
"适体"可为肽型或为核酸(例如，脱氧核糖核酸或核糖核酸)型。 特别地可使用公知的SELEX方法或按照Ellington & Szostak (19卯) AWwm 346: 818-22中的描述制备核酸适体。肽适体可按照Cohen等， (1998) /Vm. A^//. 95: 14272-7中的描述获得。式(X)包括作为参考结合入本文的WO 2004/092192中公开的式 (I),以及本发明的式(I)和(II)的化合物。优选地，式(X)化合物是式(I) 和(II)的那些物质及上面公开的其优选实施方案。
根据进一步的方面，本发明还涉及如上定义的式(I)化合物的制备 方法。
本发明的化合物和方法可以以所属领域那些熟练技术人员公知的 许多方式制备。所述化合物可以例如通过应用或者改变下述方法，或 者按照熟练技术人员所能理解的变化形式来合成。适当的变化和取代 是非常明显和公知的或者所属领域那些熟练技术人员从科技文献中可 以很容易地获得。
尤其，这种方法可以在RX. Larock， C^附/^/tcws/vc (7rgaw/c 7Vflws/<w7Wfl,,V7ws， VCH publishers, 1989中找到。
试剂和原料是可以商购获得的，或者所属领域的一个普通技术人 员通过公知技术可以容易地合成。
在下文中描述的反应中，可以保护希望存在于终产物中的反应性 官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫醇基或羧基，以避免其不希望 地参与到反应中。可以按照标准操作方法使用常规的保护基团，例如 参见T.W. Green和P. G'. M. Wuts， /^We"/ve G>0"/w 6^"w/c C7ie附i'sfo;, John Wiley and Sons, 1991; J. F. W. McOmie， /V^"/ve G>ow/ s fVi Org"fi/c C7te附/s^， Plenum Press, 1973。
通常在适当的溶剂中进行反应。可以使用各种溶剂，只要其对反 应或涉及的试剂没有不利作用。适当的溶剂的例子包括烃，其可以 为芳香族、脂肪族或脂环族烃，例如己烷、环己烷、苯、曱苯和二甲 苯；酰胺，尤其是脂肪酰胺，例如二甲基甲酰胺；和醚，例如乙醚和 四氳吹喃。
反应可以在宽泛的温度范围内进行。总的来说，我们发现方便的 是在约0°C -约150。C(更优选约室温-约10(TC)下进行反应。取决于 许多因素，特别地是反应温度和试剂的性质，反应所需的时间也可以
29变化很大。但是，只要反应在上面列出的优选条件下进行，则约3小 时-约20小时的时间通常就足够了 。
可以通过常规方式从反应混合物中回收如此制备的化合物。例如， 可以通过从反应混合物中蒸除溶剂而回收化合物，或者如果必要在从
反应混合物中蒸除溶剂之后，将剩余物倾入水中，之后用水不溶性有 机溶剂萃取并从萃取物中蒸除溶剂。此外，如果希望可以通过各种公
知的技术，例如重结晶、再沉淀或者各种色镨技术，特别是柱色i普或 制备性薄层色语进行进一步纯化。
根据进一步的目的，本发明提供一种制备如上定义的式(I)化合物 的方法，其包括下列步骤 -磺化5和
-用相应的式(IV)和(IV，)化合物
<formula>formula see original document page 30</formula>
(IV) (IV') 其中112和RS如式(I)中所定义的，X和Y独立地代表卤素原子或
OH;
酰化式(III)化合物
其中，P4、 ps、 P4'、 ps'各自相同或不同，代表H或OH-保护基团， 或者P"和pS和/或P"'和ps'—起形成环状OH-保护基团。
可能需要一个或两个磺化或酰化反应。20 磺化和酰化步骤可以按照任意顺序连续或交替进行。 如果适当，在酰化和/或磺化步骤之前和/或之后可能需要一个或 多个保护和/或脱保护步骤。
这种保护基团包括缩醛或缩酮，例如
2 , 。X。
或者二齿保护基团，例如O 。
本发明的方法包括进一步的水解所述保护基团的步骤。该反应通 常在酸性条件下进行。
所述磺化反应通常采用任意适当的磺化试剂进行，例如吡啶-三氧 化硫配合物或者三甲胺-三氧化硫配合物。
所述的两个必需的酰化反应可以在一个或两个步骤中进行。酰化
步骤通常采用偶联试剂，例如DMAP和/或DCC来进行。 本发明的方法还包括分离希望的化合物的最终步骤。
下列方案中说明了本发明的代表性方法
IIo-s
16-^
r
p<formula>formula see original document page 32</formula>
Z : r2' = s03-; R3' = h g : r2' = s03. ; R3' = H
^ : R2' = h ; R3' = s03. 21: R2' = h ; R3' = s03.
E : r2' = R3' = s03. §: : r2' = r3' = s03.
使用过量的磺化试剂可以获得2',3'双磺化化合物(D。 3，-磺化化
合物(2D作为磺化反应的副产物而得到；通常，磺化反应的选择性约为
5/1。化合物2，Z1和I^经色谱分离。 式(I v)化合物通常可以商购获得。
优选地，当R"代表如上定义的b)链时，式(IV')化合物可以通过 应用或者改变下列说明性方案而制得其中
R代表相应的任选取代的不饱和直链或支链烃链，从而使得
对应于X。
更准确地，以可商购获得的A为原料使步骤进行至G，则其包括 一个带有所需的(S)立体化学的额外曱基。之后将G还原为A，，得到 希望的B，，然后使C'依次皂化，得到希望的式(IV，)化合物。 尤其，通过维悌希(Wittig)反应，使用式(VI)化合物以及随后的皂化反 应由相应的式(V，)化合物得到具有下式(IV，-a)的式R3Y (IV，)的化合 物
一zr-1
T2T2 1(IV'-a)
33上述的制备式(IV，)化合物的方法特别有利，因为其生成了具有希
望的立体化学的化合物。
可以通过应用或者改变实施例中的试验条件和/或起始产品来进 4亍所述方法。
附图简述
图1和图2
图1和2代表T细胞克隆Z4B27响应本发明化合物和对比化合物 的刺激(横轴)而产生的IFN-y的量(Pg/mL，纵轴)。
实施例
实施例1:本发明的化合物的合成 A.》克脂的合成Z : R2' = S03-; R3' = H Z:: R2， - H ; R3, = S03-
g : R2' = S03- ; R3' = H §:: R2' - H ; R3' = S03-: R2' = R3' - S03-
1. a,a-海藻糖的亚爷基化
将a，a-海藻糖二水合物(l eq.)在绝对乙醇(0.4 M)中回流30分钟以 脱水。之后将干燥的剩余物L悬浮在干燥的N,N-二曱基甲酰胺(DMF， 0.4 M)中，将a,a-二曱氧基甲苯(DMT, 2 eq.)和IO-樟脑磺酸(CSA, 0.05 eq.)—起加入。在轻微真空下于旋转蒸发器上加热混合物(60。C)1小时 以除去甲醇。之后加入更多的DMT (0.25 eq.)和CSA (0.01 eq.)，并将 混合物再次加至旋转蒸发器中。反应结束时，蒸发DMF。在碳酸氢钠 水溶液(5%)中搅拌混合物过夜，得到结晶的二缩醛2。将产物溶解在 沸腾的乙醇中、加入热水并緩慢冷却以进行重结晶。最后，过滤白色 结晶2，用水和石油醚洗涤并干燥(84%)。
2. 位置2的酰化
使二缩醛2(1 eq.)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP, 1 eq.)和酰氯(1.3 eq) 在干燥的吡咬(0.6M)中沸腾回流25小时。以45%的产率得到单-酰基 化的产物2。
353. 位置2'和3'上的甲硅烷基化
向2 (1 eq.)在吡啶(O.l M)中的水冷溶液中加入1，3-二氯-1,1，3，3-四 异丙基二硅氧烷(1.2eq.)。室温下搅拌2天后，将混合物倾入到水水中 并用乙酸乙酯萃取产物。经快速色镨纯化以58%的产率得到为糖浆状
产物4。
4. 位置3的酰化
在干燥的曱苯(O.l M的酸)中，于微波下用酸性R3011 (从部分B 中获得)(1 eq.)、 DMAP (1 eq.)和DCC (1.5 eq.)处理化合物4 (1,5 eq.) 15分钟。最后，蒸发溶剂并用快速色谱纯化二酰基化的产物f反应 产率高度依赖于所用的酸的结构(25 - 60%)。
5. 脱甲硅烷基化
在40。C的Bu4NF/THF溶液(l M,用三氟乙酸酸化使pH - 6, 40 eq.) 中加热化合物3(1 eq.) 24小时。以90%的产率得到结晶产物f。
6. 硫酸化
向f (1 eq.)的吡啶(0.06 M)溶液中加入吡啶-三氧化硫配合物的 DMF(0.5M,3eq.)溶液，在室温下搅拌混合物。2天后，蒸发混合物， 剩余物经硅胶色镨得到2(62%)、其3'-硫酸化异构体二和2，,3，-二疏酸 化化合物2^。
7. 缩醛的水解
室温下用氯仿/甲醇/1.7。/。H2S04 (60/40/8)溶液处理二亚苄基衍生 物2， Z!或2!！ 2天。用NaHC03溶液使反应混合物呈中性。经该脱保 护作用定量得到相应的二酰基化硫酸糖脂g, §!或^:。
36B.酸的合成<formula>formula see original document page 37</formula>
1. 醇的氣化
室温、氮气下，将醇A(l eq.)加入到快速搅拌的溶于千燥的二氯 甲烷中的氯铬酸吡啶総盐(2 eq.)和乙酸钠(5 eq.)中(0.4 M的4)。搅拌 1.5小时后加入乙醚并过滤混合物。粗产物i未经进一步纯化。
2. 維悌希反应
向B(l eq.)的干燥二氯甲烷(0.6 M)溶液中加入1-乙氧羰基亚乙基 三苯基膦(l誦carboethoxyethylidene tripheiiylphosphorane) (1.2 eq,)。
之后在室温下搅拌混合物过夜，得到酯￡。由i得到的2个步骤的产 率为87%。
3. 氢化
在乙酸乙酯(0.4 M)中使用10%的钯碳作为催化剂对共辄酯￡ (1 eq.)进行氢化。以77%得到饱和酯2，其为1/1的C-2位上的对映异 构体(非对映异构体)混合物。
4. 鬼化
110。C下，在氩氧化钾(12 eq.)的水/乙醇2/3 (0.2 M)溶液中将酯B(1 eq.)加热过夜。该反应定量得到相应的酸g，其为C-2位上的外消 旋(1/1的非对映异构体)混合物。
5.酰胺化
回流下将酸g(l eq.)与草酰氯一起加热(10eq.) 1小时。减压下除 去过量的试剂。将干燥的二氯甲烷(0.4M)和DMAP(1.2eq.)，以及随 后的(R)-2-苯基甘氨醇(1.1 eq.)加入到粗酰氯中，在室温下将反应混合 物搅拌过夜。经快速色谱使非对映异构体得到分离。2S非对映异构体 L是极性较小的化合物，其以36%的产率分离出。
在硫酸(3 N)溶于1/1 二氧己环/水混合物所得的溶液(0.02 M)中将 酰胺￡(1 eq.)回流过夜，定量释放出2S-酸G。
7.还原
将酸￡(1 eq.)溶解在BH3的THF (1 M, 1.7 eq.)溶液中，在室温下 搅拌该混合物过夜。加入乙醇，之后加入80%的含水乙酸，用NaHC03 使混合物呈中性。定量得到纯物质形式的醇。
重复整个反应次序以在脂肪酸链上引入其它甲基支链。 按照上述方式急化不饱和酯￡，得到不饱和酸。
4
2'
C21 EUo〇2 M = 324.5474 g/mo1 (2E)-2-曱基二十碳-2-烯酸白色结晶
RMN & (250 MHz, CDCh)
S = 0.88 ppm (t， H-t, 3/= 6.5 Hz); 5 = 1-1.7 ppm (m， H脂肪族)； 8 = 1.84 ppm (d, H-2，， d, 4/2.3 = 1.5 Hz); 5 = 2.19 ppm (quad, H4， 3/4.3 =3/4-5 = 7 Hz); 3 = 6.9 ppm (tq, H-3,3/3-4 = 7 Hz和V32， = 1.5 Hz)
白色结晶
固NH (250 MHz, CDCh)
6 = 0.87 ppm (t, H誦t, 3/= 6.5 Hz); 3 = 1.0 ppm (d， H-4，， 3/4，_4 = 6.5 Hz); S = 1.1-1.6 ppm (m，H脂肪族)；S = 1.84 ppm (d, H-2，， d， 4/2.3 = 1.5 Hz); & = 2.5 ppm (m， H-4); & = 6.65 ppm (dquad， H國3， = 10 Hz 和4/32， = 1.5 Hz)
白色结晶
RMN力(250 MHz, CDC")
6 = 0.88 ppm (t， H腸t，3/ = 6.5 Hz); 3 = 1.01 ppm (d， H-4,， 3/4，_4 = 6.5 Hz); 6 = 1.1-1.5 ppm (m， H脂肪族)；6 = 1.85 ppm (d, H-2，， d, V2.3=1.5 Hz); 3 = 2.5 ppm (m, H-4); 8 = 6.67 ppm (dquad， H-3， = 10 Hz和4/3 2， = 1.5 Hz);
白色结晶
[aD25 = + 13.8 (氯仿) RMN ^ (250 MHz, CDC1V)
8 = 0.82 ppm (d, H-6，， 3/6、6 = 6.5 Hz); 3 = 0.88 ppm (t, H画t,3/ = 7 Hz); 8 = 0.99 ppm (d， H國4，， 3力，4 = 6.5 Hz); 6 = 1.05-1.4 ppm (m, H脂 肪族)；S = 1.85ppm(d，H-2，，4/2，.3 = 1.5Hz); S = 2.6 ppm (m, H画4); 8 =6.66 ppm (d， H-3， 3 /3-4 = 10 Hz， 4/3-2， = 1.5 Hz)
RMN 13C (250 MHz, CDC")
d = 12.1 ppm， C-6，； 6 = 14.1 ppm， C画t; 8 = 19-32 ppm, C月旨肪族 8 = 37.6 ppm, C-2，； 8 = 44.4 ppm, C-5; & = 125 ppm， C-2; 6 = 151.2 ppm, C-3。
C27 H52 O2 M 二 408.7087 g/mol (2E,4S,6S)-2,4,6-三甲基二十四碳-2-烯酸
(Phtienoic acid)
C28 H54 O2 M = 422.7356 g/mol "S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十四碳-2-烯酸
无色油aD25 = + 15 (氯仿)
RMN力(300 MHz, CDC1。
3 = 0.83 ppm (d， H國8，， 3J8.8 = 6.3 Hz); S = 0.85 ppm (d， H-6,, 3J6、6 =6.3 Hz); 5 = 0.9 ppm (t， H-t， 3J = 6.6 Hz); 6 = 1.01 ppm (d, H-4，， 3J4，_4 =6.6 Hz); 5 = 1.1-1.5 ppm (m，H脂肪族)；5 = 1.88 ppm (s， H-2，); S = 2.67 ppm (m, H-4); 5 = 6.69 ppm (d, H-3， 3J3" = 10.2 Hz)
无色油
[aD25 = + 53.2 (氯仿) RMN & (750 MHz. CDCh)
S = 0.86 ppm (d， H-6，， V6'_6 = 5,5 Hz); S = 0.88 ppm (t, H-8， 3 /8_7 = 7 Hz); S-1.03ppm(d，H-4,，3j4M-6，6Hz); 6 = 1.1-1.5 ppm (m, H誦5， H-6，H-7); 3 = 1.89ppm(s，H-2，)； 3 = 2.67 ppm (m， H-4); 5 = 6.7 ppm (d， H-3， 3/34 = 10 Hz);
RMN 13C (300 MHz, CDCh)
"11.2ppm, C-8; S = 12.1 ppm, C-2，； S = 19.0 ppm， C画6，； S = 20.4 ppm， C國4，
8 二 30.0 ppm, C-7; 8 = 31.1 ppm, C-4; 3 = 32.3 ppm, C-6; S = 44.1 ppm， C-5
3 = 125.5 ppm, C-2; 8 = 151.1 ppm, C國3; 8 = 174.1 ppm, C-l。
采用上述步骤制备了本发明的下列化合物。
Cii H20 O2 M = 184.2786 g/mol "S,6S)-2,4,6-三甲基辛-2-烯酸C49 H89 016 S M = 989.2911 g/mol 2-0-十六烷酰基-3-0-(2-甲基二十碳-2-烯酰基)-2'-0-硫酸根
-a,a'-D-海藻糖 RMN & (250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
3 = 0.89 ppm (t, 3H-t, 3H-t，， 3/= 7 Hz); S = 1-1.6 ppm (m， H脂肪 族)；6 = 1.81 ppm (d， (CH3)a，， V = 1 Hz); 3 = 2.2 ppm (m， 2H-a, 2H-y,); 6 = 3.3-4.7 ppm (m， H陽2，， H誦3'， H-4, H-4，， H-5， H-5，， H-6ax， H國6,ax， H画6一 H國6、)； 8 = 4.95 ppm (dd， H-2,3 /21 = 4 Hz和3/2.3 = 10 Hz); 8 = 5.29 ppm (d， H國l, 3^.2 = 4 Hz); S = 5.45 ppm (t, H-3， 3/34 = 3/3_2 = 10 Hz); 8 = 5.52 ppm (d， H-l，, = 4 Hz); 6 = 6.8 ppm (tquad， H-p，， 2jp,Y， = 7.5 Hz， V = 1 Hz)。
MALDI-Tof (阴离子模式):M/Z = 965.75
化合物b:<formula>formula see original document page 42</formula>C52 H9S 016 S M = 1031.3717 g/mol
3-0-(2,4S-二甲基二十二碳-2-烯酰基)-2-0-十六烷酰基-2'-0-硫酸
RMN m (250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
8 = 0.9 ppm (t, 3H-t， 3H画t，， 3/= 6.5 Hz); S = 0.99 ppm (d, (CH3)Y，, 3 /=6.5Hz); S = 1.1-1.6 ppm (m，H脂肪族)；6 = 1.82 ppm (d， (CH3)a，， V=lHz); 5 = 2.22ppm(t, 2H-a,3/=7Hz); 3 = 2.46 ppm (m， H國y，)； S = 3.4-4.4 ppm (m， H-2，， H-3，， H國4， H-4，， H-5， H-5，， H-6ax, H-6，ax， H、, H-6、)； & = 4.87 ppm (dd， H-2, = 4 Hz和3/2-3 = 10 Hz); S = 5.29 ppm (d， H國l, 3/12 = 4 Hz); S = 5.44 ppm (t， H-3, V3.4 = 3/32 = 10 Hz); "5.51ppm(d，H-l，，3/r—2, = 4Hz); S = 6.57 ppm (dquad， H-p，, 3/p，Y， = 10 Hz,V-lHz)。
MALDI-Tof(7月离子模式):M/Z = 1007.59
化合物c:
C52 H95 016 S Na
M = 1031.3717 g/mol 3-0-(2,4S-二甲基二十二碳-2-烯酰基)-2-0-十六烷酰基-2，-0-硫酸
根-a,a'-D-海藻糖 RMN力(250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
S = 0.89 ppm (t， 3H-t, 3H誦t，， 3/= 6.5 Hz); 3 = 0.99 ppm (d， (CH3)Y，，
根-a,a'-D-海藻糖
I OH3/= 6.5 Hz); 8 = 1-1.6 ppm (m， H脂肪族)；3 = 1.82 ppm (d， (CH3)a，， V =1 Hz); 6 = 2.21 ppm (t， 2H誦a， 3/ = 7.5 Hz); 8 = 2.5 ppm (m, H-y，)； &
=3.3-4.7 ppm (m， H画2，， H-3，， H誦4， H画4，， H-5， H-5'， H-6ax， H-6，ax, H-66q， H-6、); 8 = 4.95 ppm (dd, H画2， 3/21 = 4 Hz和3/2_3 = 10 Hz); 8 = 5.29 ppm (d， H-l， 3/l2 = 4 Hz); 6 = 5.45 ppm (t， H國3， 3/34 = 3/3_2 = 10 Hz); 5 = 5.52 ppm (d, H-l,，= 4 Hz); 8 = 6.57 ppm (dquad， H-(T， 3/p，Y， =10Hz，4/=lHz)。
MALDI-Tof (7月离子模式):M/Z = 1007.49
化合物d:
2-0-十六烷酰基-2，-0-硫酸根-3-0-(E)-(4S,6S)-2,4,6-三甲基二十
RMN (500 MHz. CDCWMeOD 4/1)
8 = 0.86 ppm (d， (CH3)S，， 3/= 6.5 Hz); S = 0.88 ppm (t， 3H-t， 3H画t， 3J = 7Hz); 3 = 0.97ppm(d, (CH3)Y，，V=6.5Hz); S = 1-1.6 ppm (m, H 脂肪族)；S = 1.82 ppm (d, (CH3)a，， V= 1.5 Hz); 8 = 2.22和2.26 ppm (2 个五重峰，211-(*,3/0^ = 8112,2/=161^); 6 = 2.62 ppm (m， H-y，)； s = 3.5-3.8 ppm (m， H-4， H-4，, H-5，, H-6， 2H-6，); 5 = 3.94 ppm (t， H-3，, 3/3，-2， = V3M， = 10 Hz); d = 3.97ppm (dd, H-6,2/= 12 Hz， V6—5 = 3 Hz); S = 4.23 ppm (m， H-2，， H-5); 6 = 4.97 ppm (dd， H-2， = 3.6 Hz和
》QH
CS5 H101 016 S Na M = 1073.4523 g/mol
四碳-2-烯酰基l-a,a，-D-海藻糖
44J/2.3 = 10 Hz); 6 = 5.25 ppm (d， H誦l， 1 = 3.6 Hz); S = 5.43 ppm (t， H画3， 3 /3_4 = 3/3.2 = 10 Hz); 8 = 5.46 ppm (d， H-l ，， 3^.2, = 3.6 Hz); 8 = 6.54 ppm (dquad， H-卩，，3/p，_7， = 10 Hz， 4/= 1.5 Hz) MALDI-Tof (阴离子模式):M/Z = 1049.47
化合物e:
2，-0-硫酸根-2-0-十六烷酰基-3-0-(4S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十
RMN XH (250 MHz, CDCl掘eOD 4/1、
8 = 0.89 ppm (t， 3H隱t， 3H-t,， 3/ = 6,5 Hz); S = 0.82; 0.84和0.97 ppm (3d， (CH3)Y，， (CH3)8，， (CH3)E); 6 = 1-1.6 ppm (m, H脂肪族)；3 = 1.84ppm(d，(CH3)tt，，4/=lHz); & = 2.24 ppm (m， 2H誦a); 8 = 2.6 ppm (m, H-y,); 3 = 3 -4.5 ppm (m， H-2,， H-3，， H-4, H誦4,, H画5， H画5，， 2H画6， 2H-6，)； S = 4.96 ppm (dd， H-2， = 4 Hz和3/2_3 = 10 Hz); 6 = 5.27 ppm (d， H-l， 3^.2 = 4 Hz); & = 5.43 ppm (t， H-3， V3.4 = V3_2 = 10 Hz); & = 5.48 ppm (d, H-l'， = 4 Hz); S = 6.54 ppm (dq， H-|5，， 3/p'.Y，= 10.2 Hz，4/=1 Hz)。
MALDI-Tof (阴离子才莫式):M/Z = 1063.66
'4乂OH
C56 H103 016 S Na M = 1087.4792 g/mol
四碳-2-烯酰基l-a,a'-D-海藻糖化合物f:<formula>formula see original document page 46</formula>
2-0-十六烷酰基-3-0-(4S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十四碳-2-烯酰
RMN "H (250 MHz, CDCWMeOD 4/1、
S = 0.77 ppm (t， 3H-t， 3H-t，， V= 6,5 Hz); 3 = 0.7; 0.72和0.86 ppm (3d， (CH3)Y，， (CH3)S，， (CH3)E，)； S = 1-1.5 ppm (m， H脂肪族)；3 = 1.73 ppm (d, (CH3)tt，， V= 1.5 Hz); S = 2.13 ppm (m, 2H画a); 3 = 2.5 ppm (m, H-y,); S = 3.2-3.9 ppm (m， H-2，， H-3，， H-4, H-4，， H-5, H-5，， 2H-6, 2H-6，)； 8 = 4.84 ppm (dd, H-2， = 4 Hz和3J23 = 10 Hz); & = 5.0 ppm (d， H-l, 3/12 = 4 Hz); 3 = 5.16 ppm (d, H-l，， 3/r.2'= 4 Hz); S = 5.36 ppm (t， H-3,3/3_4 = 3/3_2 = 10 Hz); 3 = 6.43 ppm (dq, H誦p，， 3/p，_Y，= 10.2 Hz,4J = lHz)。
MALDI-Tof f阴离子模式):M/Z = 1007.61
化合物g:<formula>formula see original document page 46</formula>C64 H119 016 S Na M = 1199.6943 g/mol 2'-0-疏酸根-2-0-二十四烷酰基-3-0-(4y,65;85)-2,4,6,8-四甲基二
十四碳-2-烯酰基l-a,a，-D-海藻糖 RMN力(250 MHz. CDCWMeOD 4/1)
S = 0.6-0.9 ppm (m， 3H-t， 3H-t，， (CH3)Y，， (CH3)5，， (CH3)￡，)； 8 = 1-1.5 ppm (m， H脂肪族)；5 = 1.73 ppm (d， (CH3)tt，， V= 1 Hz); 6 = 2.1 ppm (m， 2H-a); 3 = 2.5 ppm (m， H誦y，)； 6 = 3.1-4.5 ppm (m, H-2，， H-3，， H國4， H-4，， H-5， H-5，， 2H画6， 2H-6，)； 3 = 4.8 ppm (dd， H-2， 3J21 = 4 Hz 和V2-3 = 10 Hz); S = 5.16 ppm (d， H-l, = 4 Hz); S = 5.3 ppm (t， H-3: 3/3_4 = 3/3.2 = 10 Hz); 5 = 5.46 ppm (d， H-l，， 3/ir = 4 Hz); & = 6.43 ppm
(dq, H-p，， %，Y， = 10.2 Hz， 4/= 1 Hz)
MALDI-Tof (阴离子模式):M/Z = 1175.57
化合物h:
<formula>formula see original document page 47</formula>
C48 H87 016 S Na M = 975.2642 g/mol 2-0-辛酰基-2，-0-硫酸根-3-0-(4S,6S,8S)-2,4,6,8-四甲基二十四碳
-2-烯酰基1-01,01'~0-海藻糖 RMN力(250 MHz, CDCWMeOD 4/1)
S = 0,65 ppm (d, (CH3)5，， 3/= 7 Hz); 5 = 0.7 ppm (t， 3H國t， 3H-t，，3/ =7 Hz); S = 0.8ppm(d，(CH3)Y，，3/=7Hz); 8 = 1.1-1.5 ppm (m， H脂 肪族)；3 = 1.7 ppm (s， (CH3)a); 5 = 2.1 ppm (t， 2H謹a, 3/tt_p = 7 Hz); 8=2.5 ppm (m， H-y，)； 8 = 3.1-4.5 ppm (m， H-2,， H-3，， H-4， H-4，， H-5， H-5，， 2H画6， 2H画6，)； 8 = 4.8 ppm (dd， H-2,= 4 Hz和3/2國3 = 10 Hz); 6 = 5.15 ppm (d， H-l， 3/12 = 4 Hz); 5 = 5.3 ppm (t, H-3,3/3_4 = 3J3_2 = 10 Hz); 3 = 5.4 ppm (d， H-l ，，3/^2= 4 Hz); 5 = 6.4 ppm (d, H-|3，， 3/p'_Y，= 10.2 Hz)。
MALDI-Tof (阴离子模式):M/Z = 951.43 化合物i:
2-0-辛酰基-2，-0-硫酸根-3-0-〖(4S,6S)-2.4,6-三甲基辛-2-烯酰
RMN (600 MHz,冷冻探4十，MeOD)
S = 0.86 ppm (d， (CH3)&，，3/ = 6.6 Hz); 6 = 0.88 ppm (t， 3H-t，，3/ = 7.2 Hz); 6 = 0.9 ppm (t， 3H-t， V = 7.2 Hz); S - 0.99 ppm (d， (CH3)Y，，3/ =7.2 Hz); S = 1.1-1.6 ppm (m，H脂肪族)；d = 1.85 ppm (d, (CH3)a，， V =1.5 Hz); S = 2.27和2.3 ppm (2td, 2H-a, = 7.2 Hz, V = 14.4 Hz); 3 = 2.66 ppm (m， H-f); 3 = 3.41 ppm (t, H-4，， V4， 3， = 3/4,.s， = 9.3 Hz); S = 3.66 ppm (dd, 1H-6，， 3/6，.5' = 5.7和2/= 11.7 Hz); 6 = 3.68 ppm (t, H-4， 3/4_s = 3/4.3 = 10 Hz); S = 3.75 ppm (m, H-5，， H誦6， H-6，)； 8 = 3.91 ppm (dd, H-6， V = 12 Hz, 3/6.s = 2.4 Hz); 5 = 3.92 ppm (t, H-3,， 3/3，-2，= 3/3，_4, = 9.3 Hz); S = 4.19 ppm (dd， H画2'， V2M, = 3.6 Hz, 3 /2，_3， = 9.3
C31 H53 016 S Na M = 736.8072 g/mol
基l-oua，-D-海藻糖
48Hz); 8 = 4.24 ppm (ddd, H-5, Vs_6 = 2.4 Hz, V5.6 = 4.2 Hz， 3/5_4 = 10 Hz); S = 4.98 ppm (dd， H画2， = 3.6 Hz和3/2.3 二 10 Hz); 5 = 5.27 ppm (d, H-l, = 3.6 Hz); S = 5.50 ppm (d， H画l，， = 3.6 Hz); S = 5.51 ppm (t， H-3, 3/3_4 = 3/3_2 = 10 Hz); 6 = 6.52 ppm (dquad， H-p，， 3/p，_Y, = 10.2 Hz, 4J= 1.5 Hz)
RMN 13C (600 MHz,冷冻探针，MeOD)
5 = 11.6ppm，C-t，； S = 12.8 ppm, (CH3)a，； S = 14.4 ppm， C画t; S = 19.5 ppm, (CH3)8，； 5 = 20.8 ppm， (CH3)Y，； 3 = 23.7 ppm， C画(t誦l); 6 = 26.0 ppm， C-p; 5 = 30; 30.1; 32.8 ppm， C辛酸；S = 31.1 ppm, C-(t-l)，； d = 32.1 ppm， Oy，； 3 = 33.6 ppm, C-d，； d = 35.0 ppm, C-a; 8 = 45.3 ppm, C-s,; 8 = 61.8 ppm, C國6; 3 = 62.5 ppm， C國6，； 3 = 69.9 ppm， C-4; 6 = 71.6ppm，C-4，； & = 72.0 ppm， C誦2; S = 72.8 ppm, C誦3，； 8 = 73.4 ppm, C-5; 3 = 74.1 ppm， C画5，； 3 = 74.4 ppm， C-3; 6 = 78.4 ppm， C國2，； S = 93.5 ppm, C-l; 6 = 94.3 ppm, C國l,; 8 = 127.2 ppm， C-a，； 3 = 150.2 ppm，C國p，； S = 169.3 ppm, (C=0)3; 8 = 174.3 ppm， (C=0)2。
MALDI-ToH阴离子模式):M/Z = 713,15
以及下列化合物 化合物j:
<formula>formula see original document page 49</formula><formula>formula see original document page 50</formula>化合物o:
实施例2:结核分枝杆菌硫酸糖脂的离体(exvivo)试验 为了确定硫酸糖脂-抗原的免疫原性，测量用纯化的硫酸糖脂刺激 之后IFN-y的释放。在GM-CSF (500 u/mL)和IL-4 (5 ng/mL)存在下 培养2 x 10s PBMC每/孔4天。在此期间在10%的人血清中培养自体 效应T-细胞。将硫酸糖脂(10ng/mL)加入到被照射的、CDl-表达的抗 原呈递细胞中。最后，加入效应细胞(2 x 105/孔)，18小时之后借助 ELISA测量IFN-y在上清液中的释^t。在96-孔免疫吸附剂板上进行 IFN-yELISA，该板上涂覆IFN-y捕获抗体(2吗/mL)并经历整夜。用 含有1%牛血清白蛋白的PBS阻断非特异性结合位点。将上清液稀释 至1:1并加至终体积为100 pl。室温下将板培养2小时并通过彻底洗 涤(3-4次)而除去板。最后，经1小时加入生物素化抗-IFN-y抗体(2 pg/mL)。为了检测免疫反应性的IFN-y,经30分钟加入辣根-过氧化 物酶。最后加入显色底物(TMB,Endogen,MA,USA)。经20分钟的培 养之后，加入硫酸(2%)终止反应。在480 nm波长处用光度测量法确 定染色强度。为了估计上清液中的细胞因子浓度，所有试验都包括具 有已知浓度的IFN-y标准。
实施例3:体内研究
征集PPD+供体(结核菌素试验呈阳性)和PPD-供体(结核菌素试验 呈阴性)并给药本发明的化合物。采用ELISA试验(15 pg/mL)在各组的各个病人中评价IFN-y的产生从而测量对硫酸糖脂的响应。对比各 组的响应情况。
实施例4:抗原呈递试验
测量按照WO 2004/092192中公开的方法制备的T细胞克隆Z4B27 响应本发明化合物的刺激所产生的IFN-y的释放。
在加入T细胞(5xl0V孔， 一式三份)之前，在37。C下用以声波处 理过的抗原(l - 10 ng/mL)预培养5 x 104细胞/孔的CD1+APC 2小时。 36小时后4吏用sandwich ELISA ^式剂盒(Instrumentation Laboratory) 测量释放的TNF-a和IFN-y。数据净皮表示为三份试才羊的平均ng/mL或 pg/mL±SD。所有试验至少重复2次。
图1中显示了本发明的化合物e (cpd e)的结果。其证明本发明的 化合物与相应的未硫酸化的化合物(参见化合物f "cpd P)和WO 2004/092192中公开的基于下式的对比化合物的相应的饱和化合物(参 见"comp,")相比显示出更好的活性
图2中示出的进一步结杲显示了化合物b和d (cpdb和cpd d)的活性。
权利要求
1.式(I)的化合物其中R2′、R3′相同或不同，独立地选自H、SO3H或SO3-/M+，条件是R2′、R3′中的至少一个为SO3H或SO3-/M+；M+为金属阳离子，例如Na+、K+；R2、R3相同或不同，独立地选自a)脂肪酰基，b) id="icf0002" file="A2008800060900002C2.tif" wi="14" he="10" top= "149" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>其中X为任选被一个或多个取代基取代的不饱和直链或支链烃链；其中R2、R3中的至少一个为b)；及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐或酯。
2. 式(II)的化合物，其中W为S03H或SCV/M+且W为H。
3. 根据权利要求l、 2或3的化合物，其中X为式(b-l):<formula>formula see original document page 2</formula>其中Y为任选被一个或多个取代基取代的饱和或不饱和、直链或支链 烃链；Ri、 Rj相同或不同，独立地选自H、烷基。
4. 根据权利要求3的化合物，其中Ri为甲基且Ri为H。
5. 根据权利要求3或4的化合物，其中Y为任选被1 - 10个烷基 取代的饱和直链烷基链。
6. 根据前述权利要求中任一项的化合物，其中所述b)链为式 (b-2):其中r为选自1、 2或3的整数； l为选自0-10的整数； q为选自0-50的整数；条件是l + q^l; f为烷基；各个Ti相同或不同，独立地选自烷基。
7.根据权利要求6的化合物，其中 r为1;1为1、 2或3;q为选自10-20的整数；12为甲基;各个Ti为甲基，并且与Ti相连的碳原子显示出(S)构型。(b-2)
8.根据前述权利要求中任一项的化合物，其中所述脂肪酰基选 (辛酰基)(棕榈酰基)(硬脂酰基)(二十烷酰基)(二十二烷酰基)(二十四烷酰基)'(pH十CH2—CH--CH--CHCH。CH3 OH(羟基结核菌酰基)(结核菌酰基)其中m为14或16且n为2-10的整数, <formula>formula see original document page 4</formula> 其中m为14或16且n为2-10的整数。
9. 根据前述权利要求中任一项的化合物，其中如前述权利要求中任一项所定义的R2为a)脂肪酰基且R3为b) -C-O-X。
10. 根据前述权利要求中任一项的化合物，其为式(II):其中R2'、 R3'、 r、 p、 1、 q、 T2、 1^如上面的定义， 或其相应的盐；及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐,
11.根据权利要求10的化合物，其中- 1 = 2， _ 1 = 3， —1 = 4,一 1 = 1，一 1 = 3，一 1 = 4,- 1 = 1，- 1 = 2， -1 = 3， —1 = 4,一 1 = 1，- 1 = 2， 一 1 = 3，q q q q q q q q q q q q q q q4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 4且r 2且r 2且r 2且r 2且r 2且r 2且r 2且r=1=2 =2<formula>formula see original document page 6</formula>并且其中p为6-22且f和Ti为甲基。
12.根据前述权利要求中任一项的化合物，其选自由下列化合物 组成的组(II.2)<formula>formula see original document page 7</formula>(11.10)及其相应的盐，及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐。
13. 药物组合物，其包含至少一种如前述权利要求中任一项所定 义的化合物，并结合有药学上可接受的载体。
14. 根据权利要求13的药物组合物，其为意图经口服或可注射途 径给药的形式。
15. 根据权利要求13或14的药物组合物，特征在于其包含一种 或多种可用于治疗或预防结核病的其它产品，例如BCG或分枝杆菌 蛋白。
16. 产品，包含-至少一种根据权利要求1 - 12中任一项的化合物，和 -至少一种可用于治疗或预防结核病的其它产品，例如BCG或 分枝杆菌蛋白，作为组合制剂同时、分别或依次用于治疗或预防结核病。
17. 至少一种根据权利要求1-12中任一项的化合物用于制备意 图用来治疗或预防结核病的药物，特别是疫苗的用途。
18. 至少一种根据权利要求1-12中任一项的化合物作为免疫反 应活化剂，更尤其是炎性反应活化剂的用途。
19. 至少一种根据权利要求1-12中任一项的化合物用于诱导T 淋巴细胞活化的用途。
20. 至少一种根据权利要求1-12中任一项的化合物用于诱导 IFN-y、 TNF-a、 IL-4或颗粒溶素的产生的用途。
21.用于诊断结核病的体外方法，包括下列步骤: 一从ppd阳性的个体中提供生物学试样； -使所述试样与式(X)化合物接触OR3(X)其中r2'、 r3'相同或不同，独立地选自h、 s03h或s037m+，条件是 r2'、 r3'中的至少一个是s03h或s037m+; m+是金属阳离子，例如Na+、 k+; r2、 rs相同或不同，独立地选自a) 脂肪酰基ob) -g-x，其中X为任选被一个或多个取代基取代的不饱和直链或支链烃链；及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐 或酯，-评价T淋巴细胞的活化；和-对比给药所述化合物之后和之前的T淋巴细胞活化。
22.用于诊断结核病的试剂盒，包含 -式(X)化合物<formula>formula see original document page 11</formula>(X)其中R2'、 R3'相同或不同，独立地选自H、 S03H或SCV/M+,条件是 R2'、 R3'中的至少一个为S03H或S037M+; M+为金属阳离子，例如Na+、 K+; R2、 Rs相同或不同，独立地选自a) 脂肪酰基<formula>formula see original document page 11</formula>b) -^-X，其中X为任选被一个或多个取代基取代的不饱和直链 或支链烃链；及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐 或酯，-树突状细胞；和-用于检测T淋巴细胞活化的装置。
23.式(X)化合物用于评价由重组结核分枝杆菌制备的疫苗的效 果的用途<formula>formula see original document page 11</formula>(X)其中R2'、 R3'相同或不同，独立地选自H、 S03H或SCV/M+，条件是r2'、 R3'中的至少一个为s03h或S037M+; M+为金属阳离子，例如Na+、 K+, r2、 rS相同或不同，独立地选自a) 脂肪酰基ob) -g-X,其中X为任选被一个或多个取代基取代的不饱和直链或支链经链；及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐 或酯。
24.式(X)化合物的配体OR3(X)其中R2'、 R3'相同或不同，独立地选自H、 S03H或S(V/M+，条件是 R2'、 R3'中的至少一个为S03H或SCV/M+; M+为金属阳离子，例如Na+、 K+, R2、 Rs相同或不同，独立地选自a) 脂肪酰基ob) -S-X，其中X为任选被一个或多个取代基取代的不饱和直链或支链烃链；及其对映异构体、非对映异构体、其混合物和药学上可接受的盐 或酯。
25. 根据权利要求21、 22、 23或24的方法、试剂盒、用途或配 体，其中式(X)化合物为根据权利要求1-12中任一项的式(I)的那些化 合物。
26. 制备根据权利要求1-12中任一项的式(I)化合物的方法，包 括下列步骤-磺化，和-用相应的式(IV)和(IV')化合物R2X R3Y (IV) (IV') 其中W和R"如式(I)中的定义，且X和Y独立地代表卣素原子或 OH基团，酰化式(III)化合物其中P4、 P5、 P4'、 P5'各自相同或不同，代表H或OH-保护基团， 或者P"和pS和/或P^和ps'—起形成环状OH-保护基；其中，所述磺化和酰化反应以任何顺序连续或交替进行。
27. 根据权利要求26的方法，其进一步包括保护和/或脱保护步骤。
28. 根据权利要求26或27的方法，其进一步包括分离所得的化 合物的步骤。
29.<formula>formula see original document page 14</formula>
全文摘要
本发明涉及式(I)的化合物，其制备方法及其在治疗或预防结核病中的用途。
文档编号C07H13/06GK101622266SQ200880006090
公开日2010年1月6日 申请日期2008年1月11日 优先权日2007年1月24日
发明者G·德里贝罗, G·皮佐, J·吉亚尔, J·普朗迪, L·莫里, M·吉勒龙, S·鲍利迪 申请人:国家科研中心