专利名称：改进的甲病毒复制子和辅助构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备重组甲病毒颗粒的改进构建体和制备重组甲病毒颗粒的方法。
背景技术：
在真核生物中，细胞中已经进化了两种不同的机制以启动翻译。在其中一个机制中，存在于mRNA的5’端(“帽”)的甲基-7-鸟苷(5′)pppN结构被起始因子eIF4A所识别，它包括eIF4E、eIF4G和eIF4A。这种“起始前复合物”的形成需要，但不限于，对结合起始子tRNA-Meti负责的起始因子eIF2和与40S核糖体亚基相互作用的eIF3的协同作用(Hershey & Merrick.Translational Control of GeneExpression，pp.33-88，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY 2000)。
在另一种机制中，翻译起始发生于转录物内部并由一种内部核糖体进入序列(IRES)元件介导，所述元件在反式作用因子的辅助下将翻译机制募集至mRNA中的一种内部起始密码子(Jackson.Translational Control of Gene Expression，pp.127-184，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY 2000)。已经在多种来自感染脊椎动物、无脊椎动物或植物细胞的病毒的转录物中，以及在来自脊椎和无脊椎基因的转录物中发现了IRES元件。
在许多病毒感染的过程中，以及在其它细胞应激条件中，降低三重复合物eIF2-GTP-tRNA-Meti的水平的eIF2的磷酸化状态的变化导致蛋白质合成的总体抑制。相反地，帽依赖性起始的特异性关闭依赖于eIF4F功能的修饰(Thompson & Sarnow.Current Opinion inMicrobiology 3366-370(2000))。
IRES元件避开帽依赖性翻译抑制；因而由IRES元件所指导的翻译称为“不依赖于帽的”。IRES驱动的翻译起始在许多病毒感染，如，例如细小核糖核酸病毒感染的过程中普遍存在(Macejak & Sarnow.Nature 35390-94(1991))。在这些环境下，帽依赖性起始受到抑制或由于存在小量功能性eIF4G而受到严重损害。这是由eIF4G的切割或溶解性的减少(Gradi等.Proceedings of the Natiomal Academyof Sciences，USA 9511089-11094(1998))；4E-BP去磷酸化(Gingras等.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 935578-5583(1996))或聚(A)-结合蛋白(PABP)的切割(Joachims等.Journal of Virology 73718-727(1999))所导致的。
已经介绍过以不同水平表达目的核酸(NOI)的甲病毒载体。所有这些例子都描述甲病毒非结构基因或26S(亚基因组)启动子的修饰以调控载体复制或从亚基因组启动子开始的转录。例子包括非结构基因的突变，其提高或降低亚基因组RNA转录或改变基因组RNA复制，导致修饰的NOI表达。以往未曾描述在亚基因组mRNA的翻译水平上来自甲病毒载体的蛋白质表达的控制。
本发明提供甲病毒复制子和辅助载体，它们经过工程化以便在IRES元件的指导下通过不依赖于帽的机制在蛋白质翻译的水平上控制一种或多种异源核酸序列表达。
发明概述在一个实施方案中，本发明提供一种重组复制子核酸，包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列，至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列，至少一个甲病毒亚基因组启动子，至少一个IRES元件，至少一个异源核酸，和编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸，以及允许复制子包装入颗粒中的甲病毒包装信号。
在另一个实施方案中，本发明提供一种重组辅助核酸，包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列，甲病毒亚基因组启动子，IRES元件，编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸，以及编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。
本文还提供一种甲病毒颗粒，它包含含有本发明的重组复制子核酸的甲病毒复制子RNA。在另一个实施方案中，本文提供传染性的、有缺陷的甲病毒颗粒群体，其中每个颗粒都包含含有本发明的重组复制子核酸的甲病毒复制子RNA。在某些实施方案中，本发明提供传染性的、有缺陷的甲病毒颗粒群体，其中每个颗粒都包含含有本发明的重组复制子核酸的甲病毒复制子RNA，并且如由细胞培养物传代所测量的，该群体没有可检测到的可复制的病毒。在特定的实施方案中，本发明的颗粒能够包含一种或多个减毒突变。
此外，还包括药物组合物，其在可药用的载体中包含本发明的颗粒和群体。
在其它的实施方案中，本发明提供一种制备传染性的、有缺陷的甲病毒颗粒的方法，包括(a)将(i)本发明的重组复制子核酸；和(ii)一种或多种编码甲病毒结构蛋白的辅助核酸导入细胞群中；其中所有的甲病毒结构蛋白都提供在细胞中；和(b)在细胞群中生产所述甲病毒颗粒。本发明的方法能够进一步包括从细胞中收集所述甲病毒颗粒的步骤。
在某些实施方案中，本发明的辅助核酸也可以是一种本发明的重组复制子核酸。例如，本发明的重组核酸能够包含编码一种甲病毒结构蛋白或多种甲病毒结构蛋白的核酸序列作为一种异源核酸，和/或除了一种异源核酸之外，包含编码一种甲病毒结构蛋白或多种甲病毒结构蛋白的核酸序列。在这些实施方案中，重组复制子核酸被认为是一种重组复制子辅助核酸，它能够存在于具有其它辅助核酸和/或本发明的其它重组核酸的细胞中。
因而，在一个特定的实施方案中，本发明的重组复制子核酸进一步编码一种甲病毒结构蛋白或多种甲病毒结构蛋白。可以将这种重组复制子核酸与一种或多种辅助核酸一起导入细胞群体中，以使重组复制子核酸和辅助核酸产生所有的甲病毒结构蛋白，并将重组复制子核酸包装入所述细胞中的颗粒内。
此外还提供引发受试者中免疫应答的方法，包括向受试者施用免疫原量的核酸、载体、颗粒群体和/或本发明的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种重组核酸，其包含一种指导核酸转录的启动子；一种IRES元件；和一种包含编码序列的核酸，其中IRES元件被可操作地定位，从而使编码序列的翻译是通过由IRES元件指导的不依赖于帽的机制并且不通过帽依赖性机制。
附图简述
图1显示间隔区-IRES复制子亚基因组RNAs的RNA印迹。
发明详述如本文所用的，根据其所用的上下文，″一个″、″一种″和″该″可以意指一个或多个。作为示例，″一个细胞″可以意为一个细胞或多个细胞；而“一个异源核酸”可以意为一个异源核酸或多个异源核酸。
本发明是基于令人惊奇的和意想不到的发现，即，核酸的转录和核酸的翻译可以分开。因而，在一个实施方案中，本发明提供一种重组核酸，其包含一种指导核酸转录的启动子；一种IRES元件；和一种编码序列，其中IRES元件被可操作地定位，从而使编码序列的翻译通过由IRES元件指导的不依赖于帽的机制并且不通过帽依赖性机制。为了本发明的目的，术语“转录”包括由本身可以是一种RNA分子的重组复制子核酸的甲病毒亚基因组启动子生产RNA。即，本发明的重组复制子RNA分子上的亚基因组启动子可以指导编码异源NOI的信使RNA的转录。单独地，可以“复制”重组复制子核酸，即，由5’复制识别序列到3’复制识别序列进行拷贝。
在其它实施方案中，本发明提供一种重组复制子核酸，其包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列，至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列，至少一个甲病毒亚基因组启动子，至少一个IRES元件，至少一个异源核酸，和编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。在某些实施方案中，重组复制子核酸进一步包含一种甲病毒包装信号，从而可以将所述复制子包装入颗粒中。在其它实施方案中，所述重组复制子核酸可以包含一种间隔区核酸序列，其可以定位于IRES元件的上游。
应当理解在各种实施方案中，本发明的重组复制子核酸的元件可以列于本文中的顺序存在和/或以任何顺序存在。因而例如，在一个实施方案中，本发明提供一种以下列顺序包含以下结构的重组复制子核酸编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列，至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列，至少一个甲病毒亚基因组启动子，至少一个IRES元件，至少一个异源核酸，和编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。
如本文所用的，“5’甲病毒复制识别序列”和“3’甲病毒复制识别序列”是5’和3’序列(5’和3’标号指它们在甲病毒核酸中的定位)，它们控制甲病毒基因组的复制。在某些实施方案中，5’和3’甲病毒复制识别序列二者之一或二者都能够在任一末端截短，条件是它们的甲病毒基因组复制功能保持完好。
还如本文所用的，“至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列”包括一种核酸序列，其编码至少一种，可能是多种，甲病毒非结构蛋白。例如，本发明的第二核酸序列可以是一种编码甲病毒非结构蛋白nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的连续核苷酸序列，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp1，nsp2和nsp3的连续核苷酸序列，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp2，nsp3和nsp4的连续核苷酸序列，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp1和nsp2的连续核苷酸序列，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp3和nsp4的连续核苷酸序列，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp2和nsp3的连续核苷酸序列，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp1的核酸，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp2的核酸，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp3的核酸，一种编码甲病毒非结构蛋白nsp4的核酸，和/或其任何组合和/或顺序，从而使重组复制子核酸包含编码全部nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的核苷酸序列。
在特定的实施方案中，本发明的重组复制子核酸可以包含编码一种或多种任意组合或相互任意定位的甲病毒非结构蛋白的核酸，从而使重组复制子核酸包含编码全部nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的核苷酸序列。例如，本发明的重组复制子核酸能够以下列顺序包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列，编码甲病毒非结构蛋白nsp1，nsp2和nsp3的第二核酸序列，至少一个甲病毒亚基因组启动子，至少一个IRES元件，至少一个异源核酸，另一个编码甲病毒非结构蛋白nsp4的第二核酸序列，和编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。
还如本文所用的，″甲病毒亚基因组启动子″，″亚基因组启动子，″或″26S启动子″是存在于甲病毒基因组中的启动子，它在正常的甲病毒复制过程中指导亚基因组信息的转录。根据本领域已知的方法，甲病毒亚基因组启动子能够被截短(例如，产生最小的甲病毒基因组启动子)和/或修饰，从而减弱、保持或提高它的活性。
本发明的重组核酸能够包含一种内部核糖体进入序列(IRES)元件，如本文所述的和如本领域公知的，它通过不依赖于帽的机制指导核酸翻译成蛋白质。特别是在本发明的重组复制子核酸中，通过在甲病毒26S亚基因组启动子下游和待翻译的编码序列上游导入内部核糖体进入位点(IRES)来实现在翻译水平对核酸表达的控制。将IRES元件进行定位，从而使它指导mRNA的翻译，由此最小化、限制或防止mRNA来自存在于亚基因组mRNA(“帽”)5’端的甲基-7-鸟苷(5’)pppN结构的mRNA的翻译的起始。这种“IRES指导的”不依赖于帽的翻译并不需要或导致能够改变复制和转录的甲病毒非结构性蛋白基因的任何显著改进。
甲病毒载体比早期的载体设计具有几个优点，所述甲病毒载体被设计来控制异源核酸表达水平而不调节(例如，干扰、打乱、扰乱、破坏、提高、促进、减弱、最小化)基因组复制或亚基因组转录。第一，调节基因组复制能够通过限制可包装入颗粒中的基因组RNAs数目来负面影响VRP的产生。第二，通过改变(例如，通过截短、缺失、添加和/或取代)26S启动子调节亚基因组转录能够改变基因组RNA复制，再导致限制可包装入颗粒中的基因组RNAs数目。第三，甲病毒复制诱导细胞中的应激反应，其能够导致mRNAs的帽依赖性翻译减少。从甲病毒亚基因组mRNA的帽依赖性翻译转变到由IRES元件提供的不依赖于帽的机制使得这种对于NOI表达的负面效应最小化。
本发明的IRES元件可以包括，但不限于，来自细小核糖核酸病毒，例如，脊髓灰质炎病毒(PV)或人肠道病毒71，例如病毒株7423/MS/87及其BrCr；来自脑心肌炎病毒(EMCV)；来自口蹄疫病毒(FMDV)；来自黄病毒，例如，丙型肝炎病毒(HCV)；来自瘟病毒，例如，经典猪热病毒(CSFV)；来自逆转录病毒，例如，鼠白血病病毒(MLV)；来自慢病毒，例如，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)；来自细胞mRNAIRES元件，如来自翻译起始因子，例如，eIF4G或DAP5的元件；来自转录因子，例如，c-Myc(Yang and Sarnow，Nucleic AcidsResearch 252800-2807(1997))或NF-κB-阻抑因子(NRF)；来自生长因子，例如，血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子(FGF-2)和血小板衍生的生长因子B(PDGF B)；来自同源异型基因，例如，Antennapedia；来自存活蛋白，例如，X-连锁的凋亡抑制剂(XIAP)或Apaf-1；来自伴侣蛋白，例如，免疫球蛋白重链结合蛋白BiP(Martinez-Salas等，Journal of General Virology 82973-984，(2001))，来自植物病毒的IRES元件，以及任何现在已知的或以后鉴定的其它IRES元件。
在某些实施方案中，本发明的IRES元件可以源自，例如，脑心肌炎病毒(EMCV，GenBank登录号#NC001479)，蟋蟀麻痹病毒(GenBank登录号#AF218039)，果蝇属C病毒(GenBank登录号#AF014388)，Plautia stali肠病毒(GenBank登录号#AB006531)，Rhopalosiphumpadi病毒(GenBank登录号#AF022937)，Himetobi P病毒(GenBank登录号#AB017037)，急性蜜蜂麻痹病毒(GenBank登录号#AF150629)，Black queen细胞病毒(GenBank登录号#AF183905)，锥猎蝽属病毒(GenBank登录号#AF178440)，Acyrthosiphon pisum病毒(GenBank登录号#AF024514)，感染性flacherie病毒(GenBank登录号#AB000906)，和/或Sacbrood病毒(GenBank登录号#AF092924)。此外，本发明提供一种合成的IRES元件，它可以根据本领域公知的方法进行设计以模仿天然存在的IRES元件的功能(见Chappell等.Proc Natl Acad Sci USA.(2000)97(4)1536-41。
在特定的实施方案中，所述IRES元件可以是昆虫IRES元件或其它非哺乳类IRES元件，它在选来包装本发明的重组甲病毒颗粒的特定辅助细胞系中具有功能，但在靶宿主细胞中将不具功能，或具最小功能。昆虫病毒IRES元件已经进化为在昆虫细胞内最佳地发挥作用并且类似地哺乳动物病毒IRES元件在哺乳动物细胞中最佳地发挥作用。因而，可以通过将昆虫病毒特异性IRES元件插入复制子RNAs中而将翻译的控制导入复制子载体系统中。以此方式，来自复制子载体的异源NOIs的翻译能够在哺乳动物细胞中进行调控(减弱)并在昆虫细胞中增强。这对于那些对包装细胞有毒的或对甲病毒包装过程有害的那些NOIs是有用的。另一种实现这种效果的途径是使用包装在昆虫细胞培养系统中的复制子载体内的IRES元件，由此还避免了包装过程中异源NOI的可能性的显著翻译。不受特定假说或理论所限，细胞因子和培养环境可能在IRES活性和功能中发挥作用。所以，预期在同一细胞内的额外控制水平/不同IRES种类的调控可以通过某些细胞因子的提供/去除或通过培养环境(例如，温度)的变化来实现，从而与第二种IRES相比，优先地指导一种IRES的翻译。
在某些实施方案中，可以改变辅助或包装细胞系的细胞环境，从而增强或减弱IRES的比活性。一般，IRES元件已经进化为在细胞应激的条件下行使功能，在所述细胞应激条件下提高水平的eIF-α激酶导致减弱的帽依赖性翻译和IRES依赖性翻译/活性的互利提高。通过多种方法，包括但不限于低氧、低温、营养/氨基酸饥饿、ER应激诱导(例如使用Thapsigargin)、干扰素或PKR元件(例如，使用聚IC)诱导、封闭tRNA依赖性合成(例如，使用Edeine)，或本领域公知的其它通用的细胞应激物，包括但不限于，过氧化氢和山梨糖醇，可以在细胞包装系统中进行人工诱导这些条件从而增强来自选择的IRES元件的表达。
在其它的实施方案中，IRES元件指导的NOI翻译能够，例如，通过使用对IRES元件/间隔区特异性的反义siRNAs或NOI来进行调节，所述NOI能够通过多种本领域已知的和本文所述的标准方法转染入，或转导/瞬间表达于包装细胞中。
作为另一种选择，NOI的表达还能够通过使用配体结合对，例如，核酸元件和结合于其上的分子(即配体)进行调节(见，例如，美国专利号6,242,259)。所以，本发明还提供一种重组复制子核酸，其包含编码5’甲病毒复制识别序列的核酸序列，一个或多个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列，至少一个甲病毒亚基因组启动子，至少一个IRES元件，一个非甲病毒核苷酸序列，所述非甲病毒核苷酸序列当被配体结合时改变亚基因组RNA的转录和/或由IRES的翻译，至少一个异源核酸，和编码3’甲病毒复制识别序列的核酸。
作为一个具体的实施方案，所述配体可以是RNA结合蛋白(例如，R17外壳蛋白)，反义序列，染料(例如，Hoechst染料H33258或H3342)，和/或抗生素(例如妥布拉霉素或卡那霉素)。可以通过本领域技术人员已知的方法将这些导入包装细胞或在包装细胞中生产(见美国专利号6,242,259)。
如在本发明的上下文中所用的，亚基因组RNA转录的减少，或由IRES指导的NOI的翻译的减少应当被理解为分别指在选定配体存在时转录或翻译的统计学显著的减少，所述减少是由于结合非甲病毒核苷酸序列的配体的作用，所述核苷酸序列定位于紧邻甲病毒亚基因组启动子或IRES。在某些实施方案中，与不存在结合配体时的水平相比，细胞中亚基因组RNA的转录或IRES指导的NOI翻译的水平减弱至少25％，50％，75％，或90％，或3倍，5倍，或10倍。本领域已知的许多测试法都能够用于评定转录或翻译减弱的水平，包括，例如，报道基因的酶学测试、RNA印迹、代谢RNA标记等。
本发明的重组复制子核酸可以包含一种或多种IRES元件，并且在那些包含两种或多种IRES元件的实施方案中，IRES元件可以是相同的或者它们可以是不同的，以任何顺序排列和/或组合。在特定的实施方案中，所述重组复制子核酸可以包含两个或多个“启动子-IRES-异源NOI盒”，其中每个盒中的启动子、IRES和异源NOI盒既可以是不同的也可以是相同的。或者，所述重组复制子核酸可以编码两个或多个NOI，其中之一受“启动子-IRES盒”控制，而另一个NOI(s)可以受亚基因组启动子单独或受IRES单独控制。
本发明的异源核酸是这样一种核酸，它不存在于野生型甲病毒的基因组中和/或不以与它存在于本发明重组复制子核酸中相同的顺序存在于野生型甲病毒的基因组中。例如，在某些实施方案中，本发明的异源核酸能够编码一种或多种甲病毒结构蛋白(例如，C，PE2/E2，E1，E3，6K)和/或除了异源核酸之外的一种或多种甲病毒结构蛋白。当本发明的重组复制子核酸包含编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸时，所述重组复制子核酸能够作为在如本文所述传染性的、有缺陷的甲病毒颗粒的组装中的重组复制子辅助核酸而起作用。
本发明的异源核酸能够编码一种蛋白质或肽，其可以是，但不限于，抗原、免疫原或免疫原性多肽或肽、融合蛋白、融合肽、癌症抗原等。由本发明的异源核酸编码的蛋白质和/或肽包括，但不限于，适于保护受试者免受疾病的免疫原性多肽和肽，所述疾病包括但不限于微生物性、细菌性、原生动物性、寄生虫性和病毒性疾病。
在某些实施方案中，例如，由异源核酸编码的蛋白质或肽可以是一种正粘病毒免疫原(例如，一种流感病毒蛋白质或肽，如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白质或流感病毒核蛋白，或马流感病毒蛋白质或肽)，或副流感病毒免疫原，或后肺病毒(metapneumovirus)免疫原，或呼吸道合胞病毒免疫原，或鼻病毒免疫原，慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒蛋白质或肽，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)蛋白质或肽，或人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白质或肽，如HIV或SIV包膜GP160蛋白，HIV或SIV基质/壳体蛋白质，和HIV或SIV gag，pol和env基因产物)。所述蛋白质或肽还可以是一种沙粒病毒免疫原(例如，拉萨热病毒蛋白质或肽，如拉萨热病毒核衣壳蛋白和拉萨热病毒包膜糖蛋白)，细小核糖核酸病毒免疫原(例如，口蹄疫病毒蛋白质或肽)，痘病毒免疫原(例如，牛痘蛋白质或肽，如牛痘L1或L8蛋白质)，环状病毒免疫原(例如，非洲马疫病毒蛋白质或肽)，黄病毒免疫原(例如，黄热病毒蛋白质或肽，西尼罗河病毒蛋白质或肽，或日本脑炎病毒蛋白质或肽)，丝状病毒免疫原(例如，埃波拉病毒蛋白质或肽，或马堡病毒蛋白质或肽，如NP和GP蛋白质)，布尼亚病毒免疫原(例如，RVFV，CCHF和SFS蛋白质或肽)，或冠状病毒免疫原(例如，传染性人冠状病毒蛋白质或肽，如人冠状病毒包膜糖蛋白，或猪可传播的胃肠炎病毒蛋白质或肽，或鸟类传染性支气管炎病毒蛋白质或肽)。由本发明的异源核酸编码的蛋白质或肽还可以是一种脊髓灰质炎抗原，疱疹抗原(例如，CMV，EBV，HSV抗原)，腮腺炎抗原，麻疹抗原，风疹抗原，水痘抗原，肉毒毒素，白喉毒素或其它白喉抗原，百日咳抗原，肝炎(例如，甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝)抗原，或任何本领域已知的其它疫苗抗原。
如本文所用的，“引发免疫应答”和“免疫受试者”包括在受试者中产生对本发明的蛋白质和/或多肽(例如，免疫原、免疫原性肽，和/或一种或多种抗原)的激素/细胞免疫应答。如本领域公知的术语“体液”免疫应答指包含抗体的免疫应答，而如本领域公知的术语“细胞”免疫应答指包含T淋巴细胞和其它白细胞的免疫应答，特别是由HLA限制的溶细胞性T细胞，即，″CTLs″进行的免疫原特异性应答。当处理的免疫原，即，肽片段结合主要组织相容性复合物(MHC)HLA蛋白一起展示时，发生细胞免疫应答，所述HLA蛋白为两种一般类型，I类和II类。I类HLA限制的CTLs通常结合9聚体肽并在细胞表面呈递那些肽。在HLAI类分子内容中的这些肽片段被T淋巴细胞上的特异性T细胞受体(TCR)所识别，导致T细胞的激活。所述激活能够导致多种功能性结果，包括但不限于直接通过细胞毒性或凋亡事件导致携带HLA肽复合物的细胞的破坏的特异性T细胞亚组的增殖或非破坏性机制的激活，例如，干扰素/细胞因子的生产。通过I类MHC蛋白呈递免疫原，一般刺激CD8+CTL反应。
细胞免疫应答的另一方面包括II类HLA限制的T细胞应答，其包括辅助T细胞的激活，所述T细胞刺激并集中非特异性效应器细胞的活性，所述效应器细胞针对在其表面结合展示结合MHC分子的肽片段的细胞。识别至少两种类型的辅助细胞分泌细胞因子白介素2(IL-2)和γ干扰素的T辅助1细胞(Th1)，和分泌细胞因子白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)的T辅助2细胞(Th2)。通过II类MHC蛋白呈递免疫原一般引发CD4+CTL应答以及B淋巴细胞的刺激，其导致抗体应答。
如本文所用的，“免疫原性多肽”、“免疫原性肽”或“免疫原”包括任何引发受试者中免疫应答的肽、蛋白质或多肽，并且在某些实施方案中，免疫原性多肽适于对受试者提供某种程度的保护以对抗疾病。这些术语可以与术语“抗原”交互使用。
在某些实施方案中，本发明的免疫原可以包含一种或多种“表位”，基本上由一种或多种“表位”组成，或由一种或多种“表位”组成。“表位”是一组氨基酸残基，其参与由一种特定免疫球蛋白的识别。在T细胞的概念中，表位被定义为对于T细胞受体蛋白和/或MHC受体识别所必需的氨基酸残基组。在体内或体外的免疫系统环境中，表位指分子的集合特征，如一级、二级和/或三级肽结构，和/或电荷，其一起形成一个被免疫球蛋白、T细胞受体和/或HLA分子识别的位点。对于B细胞(抗体)表位来说，它一般是最小3-4个氨基酸，优选至少5个，最大为大约50个氨基酸。优选地，体液应答诱导性表位为5至30个氨基酸，通常为12至25个氨基酸，最常见为15至20个氨基酸。对于T细胞表位来说，表位包括至少大约7-9个氨基酸，而对于辅助T细胞表位来说，至少大约12-20个氨基酸。一般，这种T细胞表位将包括大约7至15个氨基酸，例如，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸。
本发明可以用于在受试者中表达一种编码免疫原性多肽的核酸(例如，进行疫苗接种)或进行免疫治疗(例如，治疗癌症或肿瘤受试者)。因而，对于疫苗而言，本发明由此提供在受试者中引发免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的核酸、颗粒、群体和/或组合物。
还考虑本发明的核酸、颗粒、群体和药物组合物能够用于向细胞递送目的NOI的方法中，所述细胞可以是受试者中的细胞。因而，本发明提供一种向细胞递送异源核酸的方法，包括向细胞中导入有效量的本发明的核酸、颗粒、群体和/或组合物。还提供一种向受试者中的细胞递送异源核酸的方法，包括向受试者递送有效量的本发明的核酸、颗粒、群体和/或组合物。根据公知的基因治疗方案，这些方法可以用于对本发明的细胞和/或受试者给予治疗效应。
本发明的“受试者”包括，但不限于，温血动物，例如，人、非人灵长类、马、牛、猫、狗、猪、大鼠和小鼠。可以通过几种不同途径的任一个实现本发明各种组合物(例如，核酸、颗粒、群体、药物组合物)的给药。在特定的实施方案中，所述组合物能够进行肌内、皮下、腹膜内、皮内、鼻内、颅内、舌下、阴道内、直肠内、口服或局部给药。本文的组合物可以通过划痕法或通过药膏或液体经皮进行给药。所述组合物能够以可生物降解材料的形式进行皮下递送，所述材料随着时间而释放所述组合物。
可以预防性地使用本发明的组合物以预防疾病或治疗性地使用以治疗疾病。可以治疗的疾病包括由病毒、细胞、真菌或寄生虫引起的传染性疾病，和癌症。还可以治疗涉及表达异常或反常蛋白或过表达正常蛋白的慢性疾病，例如，阿尔茨海默病，多发性硬化症，中风等。
本发明的组合物可以进行优化或组合其它疫苗接种方案以提供最广泛的(即，免疫应答的所有方面，包括本文上述的那些特征)可能的细胞和体液应答。在某些实施方案中，这可以包括使用异源激发-加强策略，其中将本发明的组合物用于组合一种包含下列一种或多种的组合物源自病原体或肿瘤的免疫原、重组免疫原、裸核酸、用含脂部分制成的核酸、非甲病毒载体(包括但不限于痘病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、水泡性口炎病毒载体、副黏液病毒载体、细小病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、逆转录病毒载体)和其它甲病毒载体。所述病毒载体可以是病毒样的颗粒或核酸。所述甲病毒载体可以是包含复制子的颗粒、基于DNA的包含复制子的载体(有时称为“ELVIS”系统，见，例如，美国专利号5,814,482)或裸RNA载体。
本发明的组合物还可以用来产生抗慢性或潜伏传染剂的免疫应答，所述潜伏传染剂一般由于不能在受试者中引发强烈免疫应答而存留持久。例证性的潜伏或慢性传染剂包括，但不限于，乙肝、丙肝、EB病毒、疱疹病毒、人免疫缺陷病毒和人乳头瘤病毒。可以根据本文所述的方法将编码来自这些传染剂的肽和/或蛋白质的甲病毒载体向细胞或受试者施用。
或者，所述免疫原性蛋白质或肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。优选地，所述肿瘤或癌抗原在所述癌细胞表面表达。特定乳腺癌的示例性癌症抗原为HER2和BRCA1抗原。其它例证性癌症和肿瘤细胞抗原在S.A.Rosenberg，(1999)Immunity 10281)中进行了描述，并且包括，但不限于，MART-1/MelanA，gpl00，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-连环蛋白，MUM-1，Caspase-8，KIAA0205，HPVE &，SART-1，PRAME，p15和p53抗原，Wilms′肿瘤抗原，酪氨酸酶，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异抗原(PSA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，人天冬氨酰(天冬酰)β-羟化酶(HAAH)，和EphA2(一种上皮细胞酪氨酸激酶，见国际专利公开号WO01/12172)。
本发明的免疫原性多肽或肽还可以是如国际专利公开WO99/51263中所述的“普遍”或“人工”癌症或肿瘤细胞抗原，将WO99/51263全部内容并入本文作为参考以作这类抗原的教导。
在多种实施方案中，本发明的异源核酸可以编码反义核酸序列。“反义”核酸是与特定核酸(例如，基因，cDNA和/或mRNA)的全部或一部分互补(即，能够在体内或在严格体外条件下杂交)的核酸分子(即，DNA或RNA)，所述特定核酸编码或参与核酸的表达，后者编码一种被反义核酸的作用靶向以抑制或减弱生产的多肽。如果需要，可以利用传统方法生产包含所需修饰的反义核酸。例如，可以利用硫代磷酸酯寡核苷酸作为反义核酸以抑制反义寡核苷酸在体内被核酸酶降解。当所述反义核酸与编码被靶向的多肽的核酸的一部分互补时，所述反义核酸会足够紧密地杂交到编码所述多肽的核酸的5’端，以便它抑制功能多肽的翻译。一般，这意味着所述反义核酸应当互补于与其杂交的核酸的5’一半或三分之一内的序列。
本发明的反义核酸还能够编码催化性RNA(即，核酶)，它通过水解编码被靶向的基因产物的mRNA而抑制靶核酸的表达。此外，可以将锤头状RNA用作反义核酸以防止内含子剪接。可以根据本领域反义技术的方案程序生产并检验本发明的反义核酸。
本文所用的术语“甲病毒”具有其在本领域的传统意义，并包括东方马脑炎病毒(EEE)，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)，沼泽病毒，穆茨布病毒，Pixuna病毒，西方脑炎病毒(WEE)，辛德毕斯病毒，南非虫媒病毒No.86(S.A.AR86)，Girdwood S.A.病毒，Ockelbo病毒，塞姆利基森林病毒，Middleburg病毒，基孔贡亚病毒，奥绒绒病毒，罗斯河病毒，Barmah森林病毒，盖塔病毒，鹭山病毒，毕巴汝病毒，马亚罗病毒，乌纳病毒.奥拉病毒，Whataroa病毒，Babanki病毒，Kyzlagach病毒，高地J病毒，摩根堡病毒，恩杜姆病毒，BuggyCreek病毒，以及任何由国际病毒分类学委员会(ICTV)分类为甲病毒的其它病毒。
在本发明的特定实施方案中，所述核酸和/或由本发明所述核酸编码的蛋白质可以包含减毒突变。本文所用的短语“减毒突变”和“减毒氨基酸”包括一种包含突变的核苷酸序列，或由包含突变的核苷酸序列编码的氨基酸，根据本领域的标准技术，它导致在其宿主中引发疾病的可能性降低(即，毒性减少或“减弱”)。见，例如，Davis等，MICROBIOLOGY 132(第三版.1980)。短语“减毒突变”不包括对病毒致死性的突变或突变的组合。不过，另一方面，它包括可以与导致减毒表型的恢复性或援救性突变组合掺入的那些致死性突变。
适当的减毒突变将依赖于所用的甲病毒，并且是本领域技术人员已知的。示例性的减毒突变包括，但不限于，在授与Johnston等的美国专利号5,505,947，授与Johnston等的美国专利号5,185,440，授与Davis等的美国专利号5,643,576，授与Johnston等的美国专利号5,792,462，和授与Johnston等的美国专利号5,639,650中所述的突变，在此将它们的全部内容全都并入本文作为参考。
在本发明的多种实施方案中，本发明的甲病毒颗粒的一种或多种甲病毒结构蛋白可以包含一种或多种减毒突变，例如，在美国专利号5,792,462和6,156,558中所定义的。对VEE E1糖蛋白特异性的减毒突变可以包括在E1氨基酸位置81、272和/或253的任一个上的减毒突变。由VEE-3042突变体制成的甲病毒颗粒于E1-81上包含一个异亮氨酸取代，而由VEE-3040突变体制成的甲病毒颗粒于E1-253上包含一个减毒突变。对VEE E2糖蛋白特异性的减毒突变可以包括在E2氨基酸位置76、120或209的任一个上的减毒突变。由VEE-3014突变体制成的甲病毒颗粒于E1-272和E2-209上都包含一个减毒突变(见美国专利号5,792,492)。对VEE E3糖蛋白特异性的减毒突变包括由E3氨基酸56-59的缺失组成的减毒突变。由VEE-3526突变体制成的病毒颗粒包含这种E3中的缺失(aa56-59)，以及于E1-253上的第二个减毒突变。对S.A.AR86 E2糖蛋白特异性的减毒突变可以包括在E 2氨基酸位置304、314、372或376的任一个上的减毒突变。或者，所述减毒突变可以是E2糖蛋白中氨基酸的取代、缺失和/或插入，例如，在下列氨基酸位置的任何一个或多个的任何组合上158，159，160，161和162(见Polo等，PCT公开号WO 00/61772，在此将其全部内容并入作为参考)。
本发明的另一种减毒突变可以是在VEE基因组RNA的核苷酸3上的减毒突变，即，5’甲基化帽后的第三个核苷酸(见，例如，美国专利号5,643,576，其描述了在nt3上的一个G→C突变)。所述突变可以是G→A，U或C，在某些实施方案中也可以是G→A突变。
当甲病毒结构和/或非结构蛋白来自S.A.AR86时，在结构和非结构蛋白中的减毒突变包括，但不限于，指定减毒氨基酸的在nsp1氨基酸位置538上的密码子，优选异亮氨酸为nsp1氨基酸538；指定减毒氨基酸的在E2氨基酸位置304上的密码子，优选苏氨酸为E2氨基酸304；指定减毒氨基酸的在E2氨基酸位置314上的密码子，优选赖氨酸为E2氨基酸314；指定减毒氨基酸的在E2氨基酸位置372上的密码子，优选亮氨酸于E2氨基酸残基372；指定减毒氨基酸的在E2氨基酸位置376上的密码子，优选丙氨酸为E2氨基酸376；组合如上所述指定减毒氨基酸的在E2氨基酸残基304、314、372和376上的密码子；指定减毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置96上的密码子，优选甘氨酸为nsp2氨基酸96；指定减毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置372上的密码子，优选缬氨酸为nsp2氨基酸372；组合如上所述在nsp2氨基酸残基96和372上的编码nsp2氨基酸残基96和372上减毒氨基酸的密码子；指定减毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置529的上密码子，优选亮氨酸于nsp2氨基酸残基529；指定减毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置571上的密码子，优选天冬酰胺于nsp2氨基酸残基571；指定减毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置682上的密码子，优选精氨酸于nsp2氨基酸残基682；指定减毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置804上的密码子，优选精氨酸于nsp2氨基酸残基804；指定减毒氨基酸的在nsp3氨基酸位置22上的密码子，优选精氨酸于nsp3氨基酸残基22；以及组合如上所述指定减毒氨基酸的于nsp2氨基酸残基529、571、682和804以及于nsp3氨基酸残基22上的密码子。
其它例证性的减毒突变包括在PCR申请号PCT/US01/27644中所述的突变(在此将其全部内容并入作为参考)。例如，所述减毒突变可以是S.A.AR86 nsp3蛋白的氨基酸位置537上的减毒突变，更加优选地是在此位置上的取代突变，还要更加优选地是导致终止密码子取代的无义突变。翻译终止(即，停止)密码子是本领域已知的，包括″opal″(UGA)，″amber″(UAG)和″ochre″(UAA)终止密码子。在本发明的实施方案中，所述减毒突变可以导致在S.A.AR86 nsp3氨基酸位置537上Cys→opal的取代。
另外的例示性减毒突变包括在S.A.AR86 nsp3蛋白之后的减毒插入突变。所述插入可以包含至少2，4，6，8，10，12，14，16或20个氨基酸的插入。在本发明的某些实施方案中，插入的氨基酸序列富含丝氨酸和苏氨酸残基(例如，包含至少2，4，6或8个这种位点)，其作为丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化作用的底物而起作用。
在某些实施方案中，所述减毒突变可以包含nsp3的氨基酸385之后的氨基酸序列Thr-Ser-Met-Asp-Ser-Tip-Ser-Ser-Gly-Pro-Ser-Ser-Leu-Glu-Ile-Val-Asp(SEQ ID NO1)的插入(即，第一个氨基酸被指定为nsp3中的氨基酸386)。在本发明的其它实施方案中，所述插入突变可以包含SEQ ID NO1片段的插入，其导致一种减毒的表型。所述片段可以包含至少4，6，8，10，12，14，15，16或17个来自SEQ ID NO1的相邻氨基酸。
本领域技术人员会理解可以通过常规方法(如上所述)对其它减毒插入序列进行常规鉴定，所述其它减毒插入序列包含如上所示序列的片段，或将保守性氨基酸取代掺入上述的序列中。尽管不希望被本发明的任何理论所束缚，似乎SEQ ID NO1的插入序列在丝氨酸残基上高度磷酸化，其赋予一种减毒的表型。因而，可以通过本领域已知的传统技术鉴定其它的减毒插入序列，其作为丝氨酸(或苏氨酸)磷酸化的底物而起作用。或者，或此外，在S.A.AR86 nsp3蛋白的氨基酸385上有一个Tyr→Ser取代(即，在以上插入序列的紧前面)。这种序列在非毒性辛德毕斯族病毒中是保守的，但从S.A.AR86中缺失。
在其它的实施方案中，本发明的甲病毒可以是任何辛德毕斯病毒株(例如，TR339)，VEE(在甲基化帽之后于基因组RNA的核苷酸3上具有突变)，S.A.AR86病毒，Girdwood S.A.病毒，Ockelbo病毒，和/或其嵌合病毒。多种甲病毒的完整的基因组序列，以及各种结构和非结构蛋白的序列是本领域已知的并包括辛德比斯病毒基因组序列(GenBank登录号J02363，NCBI登录号NC_001547)，S.A.AR86基因组序列(GenBank登录号U38305)，VEE基因组序列(GenBank登录号L04653，NCBI登录号NC_001449)，Girdwood S.A基因组序列(GenBank登录号U38304)，塞姆利基森林病毒基因组序列(GenBank登录号X04129，NCBI登录号NC_003215)，和TR339基因组序列(Klimstra等(1988)J.Virol.727357；McKnight等(1996)J.Virol.701981)。
在本发明的特定实施方案中，本发明的甲病毒结构蛋白可以是辛德比斯病毒结构蛋白，SFV结构蛋白，VEE结构蛋白，罗斯河病毒结构蛋白，S.A.AR86结构蛋白，EEE结构蛋白和/或WEE结构蛋白。这些可以组合任何其它一个存在并可以组合任何甲病毒非结构蛋白和/或其它甲病毒序列存在，如来自任何这些和/或其它甲病毒的5’甲病毒复制识别序列，甲病毒亚基因组启动子和3’甲病毒复制识别序列，以便产生本发明的嵌合重组甲病毒颗粒和/或嵌合重组核酸。
在其它的实施方案中，本发明的IRES元件指导由本发明的重组核酸的异源核酸所编码的基因产物的翻译，从而使至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的由异源核酸编码的基因产物的翻译受IRES元件活性的控制。根据本领域公知的和在本文实施例部分所述的分析法可以测定由IRES所控制的本发明的重组复制子核酸中异源核酸编码的基因产物的翻译的百分比。
另外，在本发明的该实施方案中，其中本发明的I RES元件指导存在于本发明辅助构建体中的甲病毒结构蛋白的翻译，本发明的IRES元件能够指导结构蛋白的翻译，从而使至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的结构蛋白的翻译受IRES元件活性的控制。根据本领域公知的和在本文实施例部分所述的分析法可以测定由本发明的IRES所控制的结构蛋白的翻译的百分比。
本发明的核酸可以是RNA或DNA。
在本发明的另一个实施方案中，提供一系列辅助核酸(“辅助构建体”或“辅助分子”)，即，表达一种或多种甲病毒结构蛋白的重组DNA或RNA分子。在一组RNA实施方案中，所述辅助构建体包含一种编码(i)5′甲病毒复制识别序列，(ii)转录启动子，(iii)编码至少一种，但并非全部甲病毒结构蛋白的核酸序列，和(iv)甲病毒3′复制识别序列的第一核酸序列。在某些实施方案中，E1和E2糖蛋白由一种辅助构建体所编码，而壳体蛋白由另一种独立的辅助构建体所编码。在另一个实施方案中，E1糖蛋白、E2糖蛋白和壳体蛋白每种都由独立的辅助构建体所编码。在其它的实施方案中，壳体蛋白和一种糖蛋白由一种辅助构建体所编码，而另一种糖蛋白由一种独立的第二辅助构建体所编码。仍在其它的实施方案中，所述壳体蛋白和糖蛋白E1由一种辅助构建体所编码，而壳体蛋白和糖蛋白E2由一种独立的辅助构建体所编码。在某些实施方案中，本发明的辅助构建体不包括甲病毒包装信号。
或者，上述的辅助核酸被构建为DNA分子，其能够稳定地整合入辅助细胞的基因组或由游离体所表达(例如，EBV来源的游离体)。所述DNA分子也可以在细胞中瞬时表达。所述DNA分子可以是本领域已知的任何载体，包括但不限于，非整合性DNA载体，如一种质粒或病毒载体。所述DNA分子能够编码本文所述的一种或任意组合的全部甲病毒结构蛋白。
将本发明的辅助构建体导入“辅助细胞”中，所述辅助细胞被用来产生本发明的甲病毒颗粒。如上所注，编码甲病毒结构蛋白的核酸可以短暂存在于辅助细胞中或稳定整合入辅助细胞的基因组中。用于生产本发明的甲病毒颗粒的编码甲病毒结构蛋白的核酸可以在组成性和/或可诱导的启动子的控制下。还如上所注，甲病毒结构蛋白编码序列可以提供于重组复制子核酸和/或包含IRES元件的辅助构建体上并且这些编码序列的翻译可以受IRES元件的活性控制。在这些实施方案中，IRES元件可以在特异性辅助细胞类型中具有活性或不具有活性，或在其它细胞类型中具有最小活性。在特定的实施方案中，当将重组复制子核酸导入细胞时，本发明的辅助细胞包含组合和/或足以产生本发明的甲病毒颗粒的编码甲病毒结构蛋白的核酸序列，所述导入是在产生甲病毒结构蛋白和将重组复制子核酸包装入本发明的甲病毒颗粒的条件下进行的。
在本发明的全部实施方案中，预期至少一种由重组复制子核酸和/或辅助分子，和/或所述重组复制子的非翻译区和/或辅助核酸所编码的甲病毒结构和/或非结构蛋白，如本文所述的和文献中所公知的，可以包含一个或多个任意组合的减毒突变。
在本发明的特定构建体中，使用一种指导由DNA进行RNA转录的启动子，即，一种DNA依赖性的RNA聚合酶。在本发明的辅助RNA和复制子实施方案中，将启动子用于在体外转录反应中合成RNA，适于这种应用的具体启动子包括，但不限于，SP6，T7和T3 RNA聚合酶启动子。在DNA辅助实施方案中，所述启动子在细胞中发挥作用以指导RNA的转录。对于构建体的体内转录的潜在启动子包括，但不限于，真核启动子如RNA聚合酶II启动子，RNA聚合酶III启动子，或病毒启动子如MMTV和MoSV LTR，SV40早期区，RSV或CMV。许多对于本发明全适的其它哺乳动物和病毒启动子是本领域现有的和已知的。或者，可以采用来自细菌或噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶启动子，例如，SP6，T7和T3，与通过分离质粒、RNA载体或病毒载体提供给细胞的匹配RNA聚合酶一起进行体内应用。在一个特定的实施方案中，匹配RNA聚合酶可以在可诱导启动子的控制下稳定地转化到辅助细胞系。在细胞内作用的构建体可以作为转染入细胞的自主质粒起作用和/或它们能够稳定地转化入基因组中。在稳定转化的细胞系中，所述启动子可以是一种可诱导的启动子，从而当细胞暴露于适当的刺激物(诱导物)时细胞仅产生由稳定转化的构建体编码的RNA聚合酶。将辅助构建体在暴露于诱导物的同时，之前和/或之后导入稳定转化的细胞中，由此影响甲病毒结构蛋白的表达。或者，可以将设计来在细胞内作用的构建体通过病毒载体导入细胞中，所述病毒载体如，例如，腺病毒、痘病毒、腺伴随病毒、SV40、逆转录病毒、野田村病毒、细小核糖核酸病毒、水泡性口炎病毒和具有哺乳类pol II启动子的杆状病毒。
在本文提供的本发明的某些实施方案中，本发明的重组复制子核酸和/或辅助核酸可以包含一种间隔区核酸，其能够位于本发明的重组复制子核酸和/或辅助核酸的IRES元件的上游。所述间隔区核酸可以包含任何随机的或特异性的非编码核酸序列，或基本由其组成，或由其组成，所述核酸序列足够长以防止至少一些，在某些实施方案中，防止全部的信使RNA5’帽的翻译，从而随后使翻译部分或全部受IRES指导。或者，所述间隔区核酸可以是这样一种长度和序列结构，即给予核酸充分的二级结构以防止至少一些并且可能是全部的信使RNA5’帽的翻译活性。
作为一个例子，用限制酶AluI消化一种可商购的质粒pCDNA 3.1(-)，所述限制酶在这种质粒中频繁地切割，由此产生许多随机的和不同大小的片段(详见实施例3)。所述pCDNA 3.1(-)质粒长为5427个核苷酸，并且是一种真核表达载体，包含多个启动子(CMV，T7，SV40)用于插入核酸的表达，以及多聚腺苷化信号和抗生素抗性基因。AluI酶在全部这些元件中切割，提供了一系列随机片段。下面提供几种不同的间隔区及其序列的例子，其由此例子产生并且它不编码任何来自质粒的功能性元件357个核苷酸的间隔区CTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAG342个核苷酸的间隔区CTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCAC GCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG257个核苷酸的间隔区
CTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAG383个核苷酸的间隔区CTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCGAAAATGGATATACAAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG579个核苷酸的间隔区CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG749个核苷酸的间隔区CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAACCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAG
除了使用由不相关质粒产生的随机核酸片段(如在上述AluI片段中)之外，还有可能使用来自细胞或病毒基因的片段，例如，来自基因的5’非编码区作为间隔区。一种方法是使用存在的I RES周围的非编码序列(见实施例4B.4)；另一种方法是使用甲病毒基因，例如，壳体基因的5’非编码区(见实施例4A.2)。
因而，预期本发明的间隔区核酸在给定的重组复制子核酸中最小可以为25个核苷酸长，并且可以尽可能地长。例如，在某些实施方案中，本发明的间隔区核酸可以为大约25，30，35，40，45，50，55，60，65，75，80，85，90，95，100，110，115，120，125，130，135，140，145，150，160，170，175，180，190，200，210，220，225，230，235，240，245，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，50，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500或10,000个核苷酸长。“大约”意为所述间隔区核酸可以变化最大为长度的10％，15％，20％和/或25％。
本发明的间隔区核酸还可以是一个3’到5’方向的核苷酸序列，用于起始信使RNA以及5’到功能性IRES元件的转录，其中由所述IRES元件指导的翻译水平至少比获自非功能性IRES元件的水平高5倍。在优选的实施方案中，翻译的水平至少高大约10倍、20倍、50倍、100倍、150倍、180倍、200倍、300倍、400倍、或500倍。在其它的实施方案中，至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的由异源核酸编码的基因产物和/或由包含IRES的辅助构建体编码的结构蛋白的翻译受IRES元件活性的控制。
本发明还提供一种包含本发明的重组复制子核酸的甲病毒颗粒。还提供了传染性和有缺陷的甲病毒颗粒群体，其中每个颗粒都包含一种甲病毒复制子RNA，其含有本发明的重组复制子核酸。在某些实施方案中，如通过细胞培养物的传代和/或其它公知的检测可复制病毒的分析法所测量的，本发明的群体不具有可检测的能够复制的病毒。
本发明进一步提供一种药物组合物，其在一种可药用的载体中包含本发明的核酸、载体、颗粒和/或群体。“可药用”意为一种并非生物或原本不需要的材料，即，所述材料可以与所选的肽、多肽、核酸、载体或细胞一起向个体施用，而不会引起显著的有害生物学效应或以有害的方式与任何组合物中包含的其它组分相互作用。
另外，本发明的任何组合物都能够包含一种可药用的载体和一种适合的佐剂。如本文所用的，“适合的佐剂”描述一种佐剂，其能够组合本发明的肽或多肽以进一步增强免疫应答，而对受试者或受试者的细胞没有有害效应。适合的佐剂可以是，但不限于，MONTANIDEISA51(Seppic，Inc.，Fairfield，NJ)，SYNTEX佐剂制剂1(SAF-1)，其由磷酸缓冲盐溶液中的5％(wt/vol)角鲨烯(DASF，Parsippany，N.J.)，2.5％Pluronic，L121聚合物(AldrichChemical，Milwaukee)，和0.2％聚山梨酯20(Tween 80，Sigma)所组成。其它适合的佐剂是本领域公知的并且包括QS-21，弗氏佐剂(完全的和不完全的)，铝盐(明矾)，磷酸铝，氢氧化铝，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)，N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其包含三种由细胞中提取的组分，溶解于2％角鲨烯/Tween 80乳剂中的单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂既可以与本发明的组合物也可以与其它疫苗组合物组合，所述疫苗组合物能够与本发明的组合物组合使用。佐剂的例子可以包括，但不限于，水包油乳剂制剂，免疫刺激剂，如细菌细胞壁组分或合成的分子，或寡核苷酸(例如CpGs)和核酸聚合物(双链和单链RNA与DNA)，其能够掺入可选的骨架部分，例如，聚乙烯聚合物。
本发明的组合物还可以包括其它药物，药剂，载体，稀释剂，免疫刺激性细胞因子等。对于本领域技术人员来说，制备这些剂型的实际方法是已知的，或是显而易见的。如本发明所预期的，优选的甲病毒复制子颗粒剂量可以为103到1010颗粒/剂。对于人类来说，106、107或108为优选的剂量。如对于通过向受试者施用本发明的组合物而获得预期预防和/或治疗作用所必需的，剂量方案可以是每小时、每天、每周、每月、每年一剂或多剂。根据本领域公知的方法可以测定特定剂量的效力。
本发明进一步提供一种制备传染性的有缺陷的甲病毒颗粒的方法，包括a)向细胞中导入下列成分(i)本发明的重组复制子核酸，和(ii)一种或多种编码甲病毒结构蛋白的辅助核酸，其中所述一种或多种辅助核酸产生全部甲病毒结构蛋白，和b)在细胞中产生所述甲病毒颗粒。在某些实施方案中，所述重组复制子核酸可以包含至少一种编码甲病毒结构蛋白的异源核酸。
在本发明的方法的其它实施方案中，所述辅助核酸可以是一种重组核酸，其包含5′甲病毒复制识别序列、甲病毒亚基因组启动子、编码甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。
在其它实施方案中，所述辅助核酸可以是一种重组核酸(其可以是DNA)，其包含启动子(例如，CMV启动子)和编码一种或多种包括全部甲病毒结构蛋白的核苷酸序列。
本发明的辅助核酸可以包含以任意顺序和/或任意组合编码任一种或多种甲病毒结构蛋白(C，E1，E2)的核酸序列。因而，辅助细胞可以包含所需要的多种辅助核酸从而提供产生甲病毒颗粒所需要的全部甲病毒结构蛋白。辅助细胞还可以包含被稳定整合入辅助(例如，包装)细胞的基因组中的辅助核酸。在这些辅助细胞中，可以在启动子的控制下产生甲病毒结构蛋白，所述启动子可以是一种可诱导的启动子。
在某些实施方案中，本发明的方法中所用的辅助核酸可以是这样一种重组核酸，它包含5’甲病毒复制识别序列、IRES元件、编码甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。
在其它的实施方案中，所述辅助核酸可以是这样一种重组核酸，它包含5’甲病毒复制识别序列、甲病毒亚基因组启动子、IRES元件、编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。
此外，本文提供一种制备传染性有缺陷甲病毒颗粒的方法，包括a)向细胞中导入下列成分(i)甲病毒复制子RNA，其包含5’甲病毒复制识别序列、编码甲病毒非结构蛋白的核酸序列、甲病毒亚基因组启动子、异源核酸序列和3’甲病毒复制识别序列；和(ii)一种或多种编码甲病毒结构蛋白的辅助核酸，它包含5’甲病毒复制识别序列、甲病毒亚基因组启动子、IRES元件、编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列，由此在细胞中产生全部甲病毒结构蛋白；和b)在细胞中产生所述甲病毒颗粒。
本文还提供一种制备传染性有缺陷甲病毒颗粒的方法，包括a)向细胞中导入下列成分(i)甲病毒复制子RNA，其包含5’甲病毒复制识别序列、编码甲病毒非结构蛋白的核酸序列、至少一个甲病毒亚基因组启动子、至少一个IRES启动子、至少一个异源核酸序列和3’甲病毒复制识别序列；和(ii)一种或多种编码甲病毒结构蛋白的辅助核酸，它包含5’甲病毒复制识别序列、甲病毒亚基因组启动子、IRES元件、编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列，由此在细胞中产生全部甲病毒结构蛋白；和b)在细胞中产生所述甲病毒颗粒。
本发明的制备传染性有缺陷甲病毒颗粒的方法可以进一步包括从细胞中收集所述甲病毒颗粒的步骤。
本发明还提供一种重组核酸，它包含5’甲病毒复制识别序列、甲病毒亚基因组启动子、IRES元件、以任意组合和/或顺序编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。在某些实施方案中，这种重组辅助核酸可以包含一种间隔区核苷酸序列，它可以在IRES元件的上游。还提供一种包含这种重组核酸的载体和/或细胞。
此外本文提供一种重组核酸，其包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列；至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列；第一甲病毒亚基因组启动子；第一IRES元件；第一异源核酸；第二甲病毒亚基因组启动子；第二IRES元件；编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。在某些实施方案中，所述第一和第二甲病毒亚基因组启动子可以是相同的或不同的，所述第一和第二IRES元件可以是相同的或不同的，和/或所述第一和第二异源核酸可以是相同的或不同的。这种重组核酸可以包含甲病毒包装信号和/或间隔区核苷酸序列，它可以在IRES元件的上游。这种重组核酸还可以包含一个或多个以任意顺序和/或组合编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列，从而全部四种甲病毒非结构蛋白编码序列都存在于所述重组核酸上。这种重组核酸可以存在于本发明的甲病毒颗粒中并且这些颗粒能够作为本发明的群体和/或于本发明的药物组合物中存在。
还提供一种如上所述的重组复制子核酸，进一步包含第三或其它额外的甲病毒亚基因组启动子，第三或其它额外的IRES元件和/或第三或其它额外的异源核酸。这种重组核酸可以存在于本发明的甲病毒颗粒中并且这些颗粒能够作为本发明的群体和/或于本发明的药物组合物中存在。包含重组核酸的这一实施方案的甲病毒颗粒可以根据本发明的任何方法进行生产并用于引发免疫应答和/或向细胞递送NOI的任何方法中。
作为另一种实施方案，本发明提供一种重组核酸，包含指导核酸转录的启动子；IRES元件；和包含编码序列的核酸，其中所述IRES元件被可操作地定位，从而使编码序列的翻译通过由IRES元件指导的不依赖于帽的机制来进行。在这一实施方案中，核酸的转录与核酸的翻译分开。
可以理解以上详细描述仅仅是通过示例的方式给出的，并且其中可以进行改进和变化，而不会背离本发明的精神和范围。
实施例实施例1.转移克隆载体的构建A.包含EMCV IRES的载体制备一种转移载体(pCDNA3.3)，可以将脑心肌炎(EMCV)IRES序列和任何NOI导入其中。用限制酶Bathe消化质粒pCDNA 3.1(+)(Nitrogen)并用T4DNA聚合酶处理以消除独特的Bathe限制位点，导致pCDNA3.2的产生。用限制酶Bay进一步消化pCDNA3.2DNA并且也用T4DNA聚合酶处理以去除独特的Bay限制位点，导致pCDNA3.3的产生。
通过将约250bp的ApaI/NotI MCS片段连接到ApaI/NotI线性化的pBluescript KS+(Stratagene)DNA中，产生pKS-rep2来制备包含来自VEE复制子载体的多克隆位点(MCS)的中间克隆载体。用限制酶EcoRI和BamHI从D1+2+3(Kaminski等，1995)中消化EMCVIRES并连接入EcoRI和BamHI线性化的pKS-rep2DNA中，产生pKS-rep2/EMCV。利用引物EMCVF(AscI).2和EMCVR(AscI).1(表1)对来自pKS-rep2/EMCV载体的EMCV IRES和MCS序列进行PCR扩增。用AscI限制酶消化EMCV PCR产物并连接入AscI线性化的VEE复制子(pERK)载体DNA中，产生pERK/EMCV。为了完成转移克隆载体，用EcoRV和NotI限制酶消化pERK/EMCV DNA并将862bp的EcoRV/NotI片段连接和EcoRV和NotI线性化的pCDNA3.3DNA中，产生pCDNA3.3/EMCV。在用它制备其它构建体之前在pCDNA3.3/EMCV载体中对EMCV IRES的序列和相关联的多克隆位点进行确认。
表1
B.包含XIAP IRES的载体利用cDNA提供的衔接子引物和XIAP反向引物(XIAP-R)从胎肝marathon ready cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)由包含推定IRES元件(见Holcik等，(1999)Nature Cell Biol 1190-192；Holcik和Komeluk(2000)Mol Cell Biol 204648-57与Holcik等，(2003)Mol Cell Biol 23280-288，元件的序列和大小)的凋亡的X连锁抑制剂(XIAP)基因5’非编码区(NCR)进行PCR扩增，随后利用XIAPIRES特异引物进行巢式PCR。引物列于表2中。利用可商购的试剂盒(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)对大约1007和241bp的得到的PCR产物进行TA克隆。除了推定的XIAP IRES之外，这些构建体分别具有XIAP基因非编码区的844个核苷酸或78个核苷酸。通过自动DNA测序确认每个构建体的序列。为了生成用于克隆入VEE复制子的穿梭载体，将作为EcoRI片段的XIAP序列转移入pKS-rep2的等同位点，产生pKS-rep2/XIAP 1007和pKS-rep2/XIAP241 DNAs。
表2
1007bp XIAP 5’NCRACACGTGGGGCAACCCTGATTTATGCCTGTTGTCCCAGTGTGATTATTACTAGTGTAATTTTTCACTTTGAGAAGTGTCCAGGTTTGGAGGATAAATTATCTTTCTAATAATTGATACCCTTCTCATAACCTAACGGGTTCCTTTTAGTATTTTATCTGGGTTAAAATTACCAGCTGTAATTTGGCAGCTCTAATAAGACTGCAGCAATACTTATCTTCCATTTGAACAGATTGTTACTTGACCAAGGGAAGTTAATAGCAAAAGTAACTGCAGGGCACATGTATGTCATGGGCAAAAAAAAAAAAGTAACAGCAATTAAGGTTTGCAGGTACTTAGAATTTTTCCTGAGCCACCCTCTAGAGGGCAGTGTTACATATATATCTGTAATTATCCAGTTACAACAAAAAAAGGGCTCTCATTCATGCATGAAAATCAGAAATATTTCATACTCTTAAAGAACACATTGGAACCAATATTATGATTAAAACATATTTTGCTAAGCAAAGAGATATTAAAAATTAATTCATTAACATTCTGAACATTTTTTAACTTGTAAAAACAACTTTGATGCCTTGAATATATAATGATTCATTATAACAATTATGCATAGATTTTAATAATCTGCATATTTTATGCTTTCATGTTTTTCCTAATTAATGATTTGACATGGTTAATAATTATAATATATTCTGCATCACAGTTTACATATTTATGTAAAATAAGCATTTAAAAATTATTAGTTTTATTCTGCCTGCTTAAATATTACTTTCCTCAAAAAGAGAAAACAAAAATGCTAGATTTTACTTTATGACTTGAATGATGTGGTAATGTCGAACTCTAGTATTTAGAATTAGAATGTTTCTTAGCGGTCGTGTAGTTATTTTTATGTCATAAGTGGATAATTTGTTAGCTCCTATAACAAAAGTCTGTTGCTTGTGTTTCACATTTTGGATTTCCTAATATAATGTTCTCTTTTTAGAAAAGGTGGACAAGTCCTATTTTCAAGAGAAGAT
实施例2.改进的复制子载体的构建A.包含EMCV IRES的构建体为了证明置于功能性甲病毒26S启动子下游的IRES序列的功能性，将报告基因亚克隆入pCDNA 3.3/EMCV转移载体中并随后将EMCV/报告基因盒移入pERK复制子载体中。利用表达氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的复制子载体进行起始实验。利用引物F′-CAT(BamHI)和R′-CAT(XbaI)(表1)扩增CAT基因。用BamHI和XbaI限制酶消化PCR产物并连接入BamHI/XbaI线性化的pCDNA3.3/EMCVDNA中，产生pCDNA 3.3/EMCV/CAT。在确认CAT基因的序列后，用AscI限制酶消化pCDNA3.3/EMCV/CAT DNA以释放1303bp的EMCV/CAT片段。随后将AscI消化的EMCV/CAT片段连接入AscI线性化的pERK载体DNA中，产生pERK/EMCV/CAT。
已经显示EMCV IRES具有指导性的活性并且当它相对于NOI处于错误的方向时，没有记录到不依赖于帽的翻译(Roberts and Belsham(1997)Virology 22753-62)。此外，EMCV IRES的5’末端序列的缺失终止了eicistronic表达载体的不依赖于帽的翻译(Van derVelden等.(1995)Virology 21482-90；Jang & Wimmer(1990)Genes & Development 41560-72)。为了证明发生了CAT基因的不依赖于帽的翻译，制备与ERK/EMCV/CAT相同的pERK载体，仅仅在反义方向上具有EMCV IRES(pERK/反-EMCV/CAT)或具有EMCV IRES末端序列的5′缺失(pERK/ΔAvr/CAT)。
利用引物反-En(EcoRI)和反-En(BamHI)(表1)从pKSrep2/EMCV DNA中PCR扩增EMCV IRES的反义形式。用EcoRI和BamHI限制酶消化扩增的EMCV IRES片段并连接入EcoRI/BamHI线性化的pKS-rep2 DNA中，产生pKS-rep2/反-EMCV。将上述BamHI/XbaI消化的CAT基因连接入BamHI/XbaI线性化的pKS-rep2/反-EMCV DNA中，产生pKS-rep2/反-EMCV/CAT。利用引物EMCVR(AscI).1和反-En(AscI)(表1)从KS-rep2/反-EMCV/CAT DNA中PCR扩增1295bp的反-EMCV/CAT基因盒。最后，用AscI限制酶消化反-EMCV/CAT片段并连接入AscI线性化的pERK载体DNA中，产生pERK/反-EMCV/CAT。在实施进一步的实验之前对反EMCV/CAT基因区的序列进行确认。
为了生成ΔAvr/CAT pERK载体，首先在pKS-rep2/EMCV中间载体内发现的EMCV IRES中制成ΔAvr缺失。通过用EcoRI和AvrII限制酶消化pKS-rep2/EMCV DNA来实现缺失，从EMCV IRES的5’区缺失145bp。用T4DNA聚合酶处理线性化的DNA以生成钝末端并进行再连接以产生pKS-rep2/ΔAvr DNA。通过将上述BamHI/XbaI CAT基因连接入BamHI和Xbal限制酶线性化的pKS-rep2/ΔAvr中而将CAT基因克隆入中间载体，生成pKS-rep2/ΔAvr/CAT DNA。利用引物EMCVR(AscI).1和dAvr En(AscI)R(表1)由pKS-rep2/ΔAvr/CAT对1177bp的ΔAvr/CAT DNA基因盒进行PCR扩增。最后，用AscI限制酶消化ΔAvr/CAT片段并连接入AscI线性化的pERK载体DNA中，生成pERK/ΔAvr/CAT。在进行其它实验之前对ΔAvr/CAT基因区的序列进行确认。
B.包含EV71 IRES的构建体在有义和反义两个方向上将人肠道病毒71(EV71)IRES元件(Thompson和Samow(2003)Virology 315259-266)克隆入间隔区复制子载体并分析CAT报告基因的表达。利用引物由pdc/MSDNA(Thompson和Sarnow，2003)中PCR扩增The EV71 IRES元件(7423/MS/87株)以产生有义片段(dc/MS(EcoRI)F和dc/MS(BamHI)R)以及反义片段(dc/反-MS(EcoRI)R和dc/反-MS(BamHI)F)(表3)。用EcoRI和BamHI限制酶消化有义和反义的EV71-MS IRESPCR产生并连接入用EcoRI和BamHI线性化的pCDNA3.3(见实施例1)中，生成pCDNA3.3/MS和pCDNA3.3/反-MS。对每个pCDNA3.3载体中的EV71-MS IRES区进行测序以确证在起始进一步的实验之前于克隆过程中没有导入核苷酸变化。
将如上述A.中的CAT报告基因克隆入BamHI和XbaI线性化的pCDNA3.3/MS和pCDNA3.3/反-MS载体中，分别生成pCDNA3.3/MS/CAT和pCDNA3.3/反-MS/CAT。通过用AscI限制酶消化pCDNA3.3/MS/CAT和pCDNA3.3/反MS/CAT DNAs并将MS-CAT或反-MSCAT AscI片段连接入间隔区复制子载体中来产生间隔区复制子构建体。对每个载体的间隔区-IRES-CAT区进行测序以确证在起始进一步的实验之前于克隆过程中没有导入核苷酸变化。
表3
C.包含XIAP IRES的构建体在利用CATF(5′-GGAGAAAAAAATCACTGGATATAC-3′)和CATR(Bam)(5′-GGGGATCCTTACGCCCCGCCCTGCCAC-3′)引物对基因进行PCR扩增后将CAT基因克隆入pKS-rep2/XIAP1007的EcoRV和BamHI位点中(见下面实施例4中)，生成pKSrep2/XIAP/CAT 1007。这一策略重构了野生型XIAP基因位点。随后将中间体作为ApaI/SphI片段克隆入pERK中以生成pERK/XIAP/CAT 1007。在体外转录和电穿孔入Vero细胞中后，测定感染细胞中的VRP产量和CAT蛋白表达并与pERK/EMCV/CAT342相比。两种构建体的VRP产量相等。在这种特定的构建体中，有可能利用XIAP IRES(3.97 e5 ng/μg)与EMCV IRES(1.08 e6 ng/μg)相比改进CAT蛋白表达的水平，由此在所要求的发明中说明不同IRESs的用途。
D.表达HIVgp160的构建体构建表达HIVgp 160 C类基因的复制子，其中HIVgp 160的翻译由EMCV IRES指导。在此构建体中，将来自pH1500A/EMCV/V帽辅助构建体(见实施例4.B.1.)的167bp间隔区克隆入如下的EMCV IRES复制子构建体中。用ApaI限制酶消化pH1500A/EMCV/Vcap DNA以释放194bp的包含167bp间隔区和一部分EMCV IRES的片段。还用ApaI限制酶消化pERK/EMCV 749载体并将释放的749bp的间隔区ApaI片段用167bp的间隔区ApaI片段替换，生成pERK/EMCV 167载体。为了证明异源基因也能够由pERK/EMCV 167复制子载体进行有效表达和包装，将HIV C类gp 160基因(Williamson C等(2003)AIDSRes Hum Retroviruses 19133-44)如下克隆入这种载体中。扩增HIVgp160基因(使用引物env-5′-XbaI和DU151gp160 3′-XbaI)表4)并克隆入pCR-XL-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，生成pCR-XL-TOPO/gp160。对gp160基因进行测序以确保在起始进一步的研究之前于PCR扩增过程中没有引入错误。用XbaI限制酶消化pCR-XL-TOPO/gp160 DNA并随后将gp160片段连接入XbaI线性化的pCDNA3.3/EMCV中，生成pCDNA3.3/EMCV/gp160。用AscI限制酶消化pCDNA3.3/EMCV/gp160DNA以释放EMCV/gp160片段。随后将EMCV/gp160片段连接入AscI线性化的pERK/EMCV 167载体DNA中，生成pERK/EMCV/gp160 167载体。
表4
E.表达多个NOIs的双亚基因组IRES复制子的构建构建连续编码两个26S-间隔区-IRES-NOI盒的IRES复制子载体。用于生成双亚基因组IRES复制子(pERK MCS2)的基础pERK载体包含342bp的26S启动子下游的间隔区并在其MCS中编码接下来的限制性位点(5′AscI，SnaBI，SphI 3′)。
将肉毒杆菌神经毒素A和B(BoNT A和BoNT B)重链(Hc)的C末端部分克隆入pCDNA3.3/EMCV中作为BamHI/XbaI片段，分别生成pCDNA3.3/EMCV/BoNT A和pCDNA3.3/EMCV/BoNT B。用AscI限制酶将BoNT基因消化出pCDNA3.3/EMCV载体并将AscI EMCV/BoNT盒连接入AscI线性化的pERK MCS2DNA中，生成pERK/BoNT A MCS2和pERK/BoNT B MCS2单价载体。通过限制性分析测定插入的方向并分离于有义方向具有插入片段的克隆。对EMCV IRES和BoNT基因进行测序以证实在起始进一步的实验之前于克隆的过程中没有导入错误。
为了生成双亚基因组BoNT A/B IRES复制子构建体(pERK-BoNTA/B MCS2)，利用单价pERK BoNT MCS 2载体。用PspOM I限制酶对pERK/BoNT B MCS2载体进行部分消化并利用T4DNA聚合酶将末端制成钝末端。用SphI限制酶进一步消化pERK/BoNT B MCS2 DNA以释放26S-342bp间隔区-EMCV-BoNT B片段。随后将26S-342 bp间隔区-EMCV-BoNT B片段连接入SnaBI/SphI消化的pERK/BoNT A MCS2DNA中，生成pERK-BoNT A/B MCS2载体。构建体的最后结构为5′NCR-nsP 1，2，3，4-26S-342bp间隔区-EMCV-BoNT A-26S-342bp间隔区-EMCV-BoNT B-NCR 3′。在表达前确证所述双亚基因组复制子的序列并进行VRP包装研究。
F.构建包含IRES的S.A.AR86复制子将源自S.A.AR86的复制子载体(pRep89；在Heise等.J Virol.200377(2)1149-56中得到描述)改进为包含26S启动子下游的342bp间隔区-EMCV-HIV gag盒。利用引物填充片段342(cal)和3-42.pr4(表5)由pERK/EMCV/gag 342DNA对342bp间隔区-EMCV-HIV gag片段进行PCR扩增。用3-42.pr4引物进行扩增允许并入3′ClaI位点，其存在于pERK/EMCV/gag 342DNA中HIV gag基因的紧邻下游。随后用ClaI限制酶消化PCR产物并连接入ClaI线性化的pRep89中，生成pRep89/EMCV/gag 342载体。对完整的插入区进行测序以确保在PCR扩增过程中未曾导入过错误。
表5.
实施例3.由IRES-指导的复制子进行NOI表达分析A.EMCV IRES复制子表达1.CAT表达利用pERK/EMCV/CAT，pERK/反-EMCV/CAT，和pERK/AAvr/CAT复制子构建体检查CAT蛋白表达。利用T7RiboMax试剂盒(PromegaCorporation；Madison，WI；Cat No.P1300)对加帽复制子RNAs进行体外转录。根据生产商的说明书利用RNeasy纯化柱(QiagenCorporation，Germantown，MD)对RNAs进行纯化。将Vero细胞(6×106细胞悬浮于0.4mlInVitrusTtM化学限定的细胞培养基中，(CellCulture Technologies GmbH，Zurich，CH；Catalog No.IVT)并以15μg的pERK/EMCV/CAT或pERK/反-EMCV/CAT RNA利用Bio RadGene Pulser(BioRad Laboratories，Hercules，CA)进行电穿孔。用设定于290伏和25微法拉的电穿孔仪将细胞脉冲四次。通过利用甲醇固定细胞上的兔抗CAT抗体的IFA和通过利用电穿孔细胞裂解物和可商购CAT ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)对CAT表达进行检测。
在位于pERK载体中的特有EcoRV位点上将随机DNA片段克隆于EMCV IRES序列和VEE亚基因组启动子之间。在26S启动子和EMCV IRES之间克隆的小DNA片段来自AluI限制酶消化的pCDNA3.1 pCDNA3.1(-)DNA。AluI限制酶在pCDNA3.1(-)DNA内频繁地切割，产生大小706bp到6bp的钝末端片段。将Alul消化的pCDNA3.1(-)片段连接入EcoRV线性化的pERK/EMCV/CAT、pERK/反EMCV/CAT和pERK/ΔAvr/CAT DNAs中。对单个克隆进行测序以测定什么间隔区片段已经克隆入每个新的载体中。对单个克隆进行测序以测定什么间隔区片段已经克隆入每个新的载体中。由于多个片段连接入这些复制子的间隔区，一些在载体中发现的间隔区片段的大小比pCDNA3.1(-)Alul片段还大。对每个间隔区-IRES复制子进行转录并如上所述将RNA电穿孔入Vero细胞中。通过CAT ELISA监测CAT蛋白表达并将结果总结于表6中。
表6.由包含EMCV-IRES的复制子分析CAT表达
与没有间隔区片段的类似载体相比，结果表明由包含间隔区片段的pERK/IRES/CAT复制子进行的CAT表达强烈并由IRES所指导(大约4-7ngCAT/μg总蛋白)。当在26S启动子和EMCV IRES序列之间导入大于大约200核苷酸的间隔区片段时，发生最高水平的基因表达。
2.由单个复制子进行的多个NOI表达在Vero细胞中进行pERK-BoNT A/B MCS2复制子的表达和包装。如上所述对加帽的pERK-BoNTA/B复制子RNA进行转录和纯化。用30μg复制子RNA、30μg壳体辅助RNA和30μg糖蛋白辅助RNA对Vero细胞(1×108细胞)进行电穿孔。在收获VRP以前利用马抗BoNT A和BoNT B抗体(Perimmune，Rockville，MD)通过IFA电穿孔单元分析电穿孔细胞。IFA的结果和产生VRP的滴定的结果显示于表7中。
表7
3.HIV gp160表达对pERK/EMCV/gp160 167复制子(实施例2D)分析gp160基因的表达和VRP的产生。如上所述对于复制子、GP辅助剂和壳体辅助剂制备纯化的RNA。电穿孔20-24小时后收集用RNAs和VRP电穿孔的vero细胞。IFA和VRP滴定的结果总结于表8中。为了进行比较，还对直接由26S启动子表达gp160的pERK复制子进行评估。
表8.
4.由S.A.AR86复制子进行的HIV GAG表达利用SP6 RiboMax试剂盒(Promega Corporation；Madison，WI；Cat No.P1280)体外转录pRep89/EMCV/gag 342DNA，以生成加帽的复制子DNA。根据生产商的说明书利用RNeasy纯化柱(QiagenCorporation，Germantown，MD)对RNA进行纯化。用30μgRep89/EMCV/gag 342RNA对Vero细胞(1×108细胞)进行电穿孔并随后在电穿孔后约18小时分析Ga g蛋白表达。对Gag蛋白表达来说，Rep89/EMCV/gag 342电穿孔细胞的抗Gag IFA分析是阳性的。
B.EV71-MS IRES复制子表达在Vero细胞中进行来自每个包含EV71-MS的复制子的CAT蛋白的表达。对加帽复制子RNA进行转录并如上所述进行纯化。用30μg复制子RNA对Vero细胞(2-3×107细胞)进行电转化。通过利用抗CAT(Cortex Biochem，San Leandro，CA)和抗VEE nsp2抗体(AlphaVax)的IFA在电穿孔后大约18小时对电穿孔细胞进行分析。此外，如上所述通过ELISA监测CAT表达。将IFA和比较由pERK/EMCV/CAT 342和pERK/MS/CAT 342复制子检测的活性的CATELISA的结果显示于表9中。
表9.
实施例4.用不同的间隔区进行的IRES-指导的翻译A.复制子构建体1.包含EMCV IRES的构建体制备编码EMCV或反义EMCV IRES序列的复制子构建体配对，其包含严格相同的间隔区。这些比较表明只有有义方向上的EMCV IRES序列(即在5′-3′方向，其中在病毒中发现所述序列)指导不依赖于帽的翻译；即在IRES为反义方向时发生极少的翻译，提示适当定位的IRES元件是在这些构建体中获得显著CAT表达所必需的。如上所述制备这些复制子构建体。体外转录每种间隔区-IRES复制子并如上所述将30μg的各种纯化RNA电穿孔入约1×107Vero细胞中。通过CAT ELISA监测CAT蛋白表达并将结果总结于表10中。
表10.利用间隔区-EMCV或间隔区-反-EMCV IRES复制子进行的CAT表达的比较
*相对于有义方向IRES指导的构建体，反义方向IRES构建体中翻译的减少％。
#相对于具有反义方向IRES元件的构建体的翻译，有义方向IRES元件的翻译增加的倍数。
数据显示当复制子包含CAT基因上游的间隔区和反义EMCV IRES时，CAT蛋白表达大大减少了(大多数情况下＞95％)。另外，数据表明IRES指导的蛋白表达系统优化NOI表达水平的能力。优化是NOI特异性的，但是利用本文的教导，间隔区-IRES组合的鉴定对于本领域普通技术人员来说是常规性的，所述间隔区-IRES组合对于任何给定的NOI都提供所需水平的表达。
2.源自5’非编码区的间隔区的用途通过利用Cap5′F和3-1.1prl引物(表11)由pH500A/Vcap PCR扩增壳体序列而将一种pERK复制子进行工程改造以包含全长VEE壳体蛋白基因。将得到的PCR产物插入pERK的EcoRV和SphI限制性位点。利用定点突变AscIF和AscIR引物(表11)使用可商购的试剂盒(Stratagene)将″pERK/壳体″进一步改进以在壳体基因的3’端包含一种特有的AscI限制酶。随后通过利用在nsP4基因内退火的正向引物(13-82.2.16)和已经改造为包含AscI限制酶位点的反向引物(表11)PCR扩增来自pERK/壳体的序列生成VEE壳体序列的相邻截短片段。用ApaI和AscI或SwaI和AscI消化PCR产物并克隆回pERK/壳体中以生成pERK/Cap200，pERK/Cap400和pERK/Cap600。这些复制子保留来自壳体基因5’末端的增量的序列以作为介于26S启动子和待插入的下游构建体之间的“间隔区”而起作用。为了将EMCV/CAT盒导入上述各种pERK/Cap载体中，用AscI限制酶消化pCDNA3.3/EMCV/CAT DNA以释放1303 bp的EMCV/CAT片段。随后将AscI消化的EMCV/CAT片段连接入AscI线性化的pERK/Cap载体DNAs中，生成pERK/EMCV/CAT Cap 200，pERK/EMCV/CAT Cap 400和pERK/EMCV/CAT Cap600。
表11生成壳体间隔区复制子的引物
将这些包含VEE壳体基因5’区部分的复制子线性化，体外转录，电穿孔入Vero细胞中并通过IFA和ELISA分析CAT蛋白表达。通过利用CAT特异性抗体的IFA验证CAT蛋白表达；不过，免疫荧光强度根据所用壳体基因间隔区的长度而变化。这些结果反映于CAT ELISA中(表12)。
表12由包含壳体基因间隔区的复制子进行的Cat蛋白表达
B.辅助构建体1.包含EMCV IRES的构建体构建辅助构建体，其能够单个表达VEE糖蛋白基因(″GP″)或VEE壳体基因。开始，制成两种空辅助构建体骨架载体以促进包含壳体和GP辅助构建体的间隔区-IRES的构建。通过用ApaI和RsrII限制酶消化pERK载体以除去6989bp的非结构蛋白编码区来制成一种空辅助构建体。在连接缺失了非结构基因的pERK载体以产生pH500G之前用T4DNA聚合酶处理DNA以生成钝末端。pH500G空辅助构建体包含5’非编码区(NCR)的大约500个核苷酸。通过用SwaI和RsrII限制酶消化pERK载体以除去6989bp的非结构蛋白编码区来制成第二种空辅助构建体。在连接DNA以产生pH1500G之前用T4DNA聚合酶处理DNA以生成钝末端。pH1500G空辅助构建体包含5’NCR的大约1500个核苷酸，包括紧接26S启动子上游的nsp4的另外540bp，其不存在于pH500G辅助构建体中。制备空辅助构建体，其在核苷酸3上编码一个A而非一个G残基(pH500A和pH1500A)。通过从壳体辅助构建体(pH500A/Vcap)中亚克隆5′NCR区来制备这些载体，其在核苷酸3上包含一个A，代替pH500A和pH1500A中的同一区域。这通过用XbaI和SacI限制酶消化pH500A/Vcap，收集430bp的片段，并将它连接入XbaI和SacI消化的pH500A和pH1500A DNAs中，分别生成pH500Aand pH1500A而得以实现。
如上所述将壳体和GP基因作为BamHI和XbaI片段克隆入pCDNA3.3/EMCV和pKS-rep2/反-EMCV中。如上所述将EMCV/壳体，反-EMCV/capsid，EMCV/GP和反-EMCV/GP盒作为AscI片段克隆入pH500G，pH500A，pH1500G和pH1500A空辅助构建体中。在起始进一步的实验之前对每种辅助构建体的序列进行确认。
如前所述将随机间隔区片段在一个特有的EcoRV位点克隆于每种辅助构建体中的26S启动子和EMCV或反-EMCV IRES之间。对每种新的辅助构建体测定插入间隔区片段的序列和长度，间隔区插入片段的长度包括于构建体设计的末端。未对间隔区#15，16，和22作进一步特征鉴定。构建体pH500A/EMCV/GP和pH500A/anti-EMCV/GP不包含间隔区。
2.利用包含EMCV IRES的GP和/或壳体辅助构建体组合进行包装和滴定利用多种GP和壳体辅助构建体的组合包装表达HIV-GAG蛋白的VEE复制子，pERK-342/EMCV/gag(见实施例7，介绍这种复制子的构建)。对于表13中所给出的结果，在0.8ml电穿孔皿中，利用580V和25μF上的4次脉冲，将30μg的各种RNA辅助构建体和30μg的复制子RNA共电穿孔入Vero细胞中，并让细胞在室温恢复10分钟。将电穿孔的细胞接种入含有50ml具有抗生素的EMEM(10％FBS)T-175烧瓶中并于37℃孵育。20-24小时后，通过利用免疫荧光测试(IFA)测量GAG蛋白表达收集VEE复制子颗粒(″VRPs″)并滴定于96孔板中的Vero细胞上。为了比较的目的，基于″IU/ml″表示来自每次电转化的VRP产量(表)。
表13.
在其它实验中，GP辅助构建体RNA的量于电穿孔环境变化；所有其它的VRP生产条件都如上所述。结果示于表14中。
表14.
3.没有间隔区的26S-IRES GP辅助构建体进行这一实验来看间隔区是否为GP辅助构建体中必需的以将转录与翻译分开。用下列每种混合物单独对Vero细胞进行电穿孔a.Gag复制子载体(见实施例6)+pH500A/反-EMCV/GP+pH500A/反-EMCV/Vcap 291b.Gag复制子载体+pH500A/EMCV/GP+pH500A/EMCV/Vcap 291如前所述孵育细胞以进行VRP生产，收集VRPs并通过IFA滴定于VERO细胞上。对于具有有义方向的IRES的辅助构建体来说(″b.″混合物)，VRP产量为3.3 e6；而对于以反义方向放置IRES的辅助构建体来说，VRP产量为5.3 e2。
4.包含XIAP IRES的VEE辅助构建体的生产和应用利用PFU pol(Stratagene；LaJolla，CA)和Cap5′F或13-87prl正向引物和3-1.lprl反向引物(表2，见实施例1B)分别由pH500A/Vcap和pH500A/GP PCR扩增VEE壳体(″VCap″)和糖蛋白(″VGP″)基因。将得到的PCR产物克隆入pKS-rep2的EcoRV和Sphl位点。这一策略XIAP基因野生型起点处的VEE结构蛋白起始密码子。通过自动DNA测序证实每个质粒中的VEE结构蛋白序列，并将得到的质粒用于体外转录。利用Qiagen RNeasy柱纯化RNA并电穿孔入Vero细胞用于分析蛋白表达和包装。如由IFA所测定的所有的辅助构建体都表达VEE壳体或糖蛋白，对于表达HIV GAG蛋白的VEE复制子所回收的滴度为总共1×105到1×107。
还将上述XIAP1007-VEE结构蛋白构建体克隆入第二辅助质粒pH1500A中，作为ApaI/SphI DNA片段，生成pH1500A/XIAP/Vcap1007和pH1500A/XIAP/GP 1007。这些质粒被用于制备RNA并如上电穿孔入Vero细胞以分析蛋白表达和VRP包装。再一次，如由IFA所测定的，得到的辅助构建体既表达VEE壳体也表达糖蛋白，滴度为1×108到超过1×109总VRP，表明由来自26S启动子的亚基因组mRNA的转录的所得。
实施例5.
对于由Vero细胞收集的全部细胞RNA进行RNA印迹分析，将复制子RNAs电穿孔入所述Vero细胞中。如上所述，体外转录间隔区-IRES复制子构建体并将30μg的Rneasy柱纯化的RNA电穿孔入大约1×107Vero细胞中。将电穿孔细胞重悬于10ml的DMEM培养基中，随后将7ml(大约7×106细胞)接种入一只25cm2的烧瓶中。根据生产商的说明书利用RNAwiz提取试剂盒(Ambion)在电穿孔16小时后从细胞中收集总细胞RNA。对RNAs进行量化并在通过被动转移而转移到Brightstar-Plus膜(Ambion)之前将每种10μg在1％乙二醛琼脂糖凝胶上跑电泳。将RNAs紫外线交联到膜上，于45℃用UltraHyb(Ambion)溶液封闭1小时，并于45℃用包含特异于VEE亚基因组RNA 3′UTR(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)的生物标记的反义引物(3′UTR4X生物素，表1)进行探针杂交。在过夜杂交后根据生产商的说明书利用Brightstar Biodetect试剂盒(Ambion)通过化学发光RNA检测处理印迹，并用EpiChemi IIDarkroom(UVP，Inc.，Upland，CA)进行显影。将来自Vero细胞的RNA的RNA印迹分析结果显示于表1中，所述Vero细胞用pERK/EMCV/CAT 257，pERK/反-EMCV/CAT 257，pERK/EMCV/CAT 579或pERK/反-EMCV/CAT579进行电穿孔。EMCV和反EMCV复制子构建体都产生接近相同强度的亚基因组转录，提示来自间隔区-反-EMCV/CAT复制子构建体的CAT蛋白表达的缺失并非归因于亚基因组RNAs的任何实质性减少。
实施例6.HIVgag基因IRES-指导的复制子载体的构建如上所述，将HIV亚型C gag基因克隆入包含342 bp间隔区(pERK-342)的pERKIEMCV载体中。利用引物GAG-F和GAG-R(表1)由pERK/HIVgagDNA PCR扩增gag基因。将引物改造为包含BamHI限制性位点，从而使PCR产物于5’和3’编码此位点。用BamHI限制酶消化PCR产物并连接入BamHI线性化的pCDNA3.3/EMCV DNA中。通过限制性分析测定gag基因的定向并选择具有正确定向的基因的构建体，生成pCDNA3.3/EMCV/gag。用AscI限制酶由pCDNA3.3/EMCV/gagDNA消化EMCV/gag基因盒并连接入AscI线性化的pERK-342 DNA中。通过限制性分析测定EMCV/gag基因盒的定向并选择具有正确定向的基因的构建体，生成pERK-342/EMCV/gag。在起始进一步的实验之前确证EMCV/gag区的序列。
通过IFA和蛋白质印迹的gag蛋白表达分析提示，在pERK-342/EMCV/gag复制子中的IRES指导下表达的蛋白质与由pERK/HIVgag复制子表达的蛋白质没有区别，在所述pERK/HIVgag复制子中翻译和转录都由26S VEE亚基因组启动子指导。此外，与26S启动子指导的系统相比，如通过滴定VRP测量的表达水平对于IRES指导的系统来说得到了提高(表15)。
表15.用不同复制子载体生成的VRP滴度的比较
实施例7.用IRES指导的HIVgag复制子颗粒孵育的小鼠中的体液和细胞免疫应答当向动物体内进行疫苗接种时，pERK/EMCV/gag 342复制子引发强烈的体液和细胞应答。从Charles River获得四到五周大的雌性BALB/c小鼠并在任何操作之前适应一周。对于激发和加强，在异氟烷麻醉下用5×105IFU靶剂量的VRP在两只后爪垫中对小鼠组进行接种，所述VRP是在包含具有1％v/v人血清白蛋白和5％w/v蔗糖的PBS的稀释液中。通过用30.5G针头和0.100mL Hamilton注射器注射20μL于每只后爪垫中进行爪垫注射。在第0天(即放血)，第21天(开始接种20天后)和第29天(加强7天后)的每一次接种之前于异氟烷麻醉下通过后眼窝取血获得血清样品。将疫苗接种程序总结于表16中。在加强后14天收集脾进行IFN-γELISPOT分析。
表16.IRES指导的复制子VRP接种程序
1GMP生产的Gag VRP，用未修饰的pERK复制子载体制备。
2342指IRES/Gag盒上游的间隔区中的核苷酸数目。
3对照VRP，由表达HIV Pol/Nef基因的复制子组成。
4sc-fp指皮下爪垫。
疫苗接种后进行的免疫测试Gag ELISA将来自HIV-1亚型C分离株DU-422的纯化重组组氨酸标记(his)-p 55用作抗原包被。通过标准的间接ELISA对血清评估Gag特异性抗体的存在。
Gag ELISPOT测试将从脾中收集的存活淋巴细胞接种入Multiscreen Immobilon-P ELISPOT板(ELISPOT certified 96-well filtration plate，Millipore，Bedford，MA)中的单个ELISPOTassay孔内，并温育16-20小时，所述MultiscreenImmobilon-P ELISPOT板已经用抗IFN-γ单克隆抗体AN18(大鼠IgG1，MabTech，Mariemont，OH)进行预涂布。通过用缓冲液多次洗涤移除细胞并用生物素标记的抗IFN-γ单克隆抗体R4-6A2(大鼠IgGI，MabTech)对孔进行温育，随后进行洗涤并用抗生物素蛋白-过氧化物酶-复合物(Vectastain ABC Peroxidase Kit，Vector Laboratories，Burlingame，CA)进行温育。为了形成复合物，至少在结束温育期30分钟前用二抗制备抗生物素蛋白-过氧化物酶-复合物并保存于室温。温育后，洗涤细胞并于室温和底物(AEC片剂，Sigma)一起温育4分钟以促进斑点形成，其代表培养过程中单个IFN-γ分泌细胞的位置。通过蒸馏水漂洗停止斑点显影。
为了清点来自用HIVgagVRP免疫的小鼠的淋巴细胞中Gag-特异性IFN-γ分泌细胞，用免疫显性CD8+CTLH-2Kd-限制性HIV-Gag肽AMQMLKETI或不相关的结合I类MHC的HA(流感红血球凝集素)CD8+CTLH-2Kdd-限制性肽IYSTVASSL刺激淋巴细胞，持续16-20小时(5％CO2于37℃)。细胞minus肽作为背景对照而起作用。作为阳性对照，用4μg/mL的Conconavalin A刺激细胞持续相似的时期。合成具有游离末端的肽并通过New England Peptide纯化至＞90％。
HIVgagVRP效价滴定将HIVgagVRP感染的Vero细胞的Gag-特异性IFA用于测量效价或疫苗的感染性滴度。将效价测量为感染单位/mL，IFU/mL。在每次注射的当天将残余的疫苗进行回复滴定以测量每只动物所接受的实际剂量(表17)。
表17.Gag ELISA和ELISPOT结果的总结
1SFC/1e6淋巴细胞指形成斑点的细胞/1×106淋巴细胞2GMT，几何平均滴度如通过抗Gag抗体ELISA和Gag特异性ELISPOT测试所测量的，疫苗接种研究的结果显示342/EMCV/gag VRP接种的动物呈现强烈的对HIV-Gag的体液和细胞免疫应答。
实施例8.
将几种昆虫病毒IRES序列的活性与多种昆虫细胞系中的哺乳类病毒IRES(EMCV)活性相比较。对复制子载体进行设计从而使26S亚基因组转录为双顺反。26S亚基因组RNA被加帽，意即双顺反RNA(氯霉素乙酰基转移酶(CAT))上的第一个基因是帽依赖性的，而第二个基因(荧光素酶(LUC))依赖于IRES序列(不依赖于帽的)。将基于辛德比斯病毒的复制子载体改造为包含下列元件5′NCR，nsp1，2，3，4，26S启动子，CAT基因，IRES，LUC基因，NCR3′。将两种昆虫病毒IRES序列，一种源自豌豆蚜虫(Acyrthosiphon pisum)病毒，另一种源自小米蚜(Rhopalosiphum padi)病毒(RXPV)，改造于CAT和LUC基因之间。为了进行比较，将在CAT和LUC基因之间将哺乳动物病毒IRES(EMCV)改造入相同的辛德比斯复制子载体。利用SP6RNA聚合酶体外转录每个复制子构建体的RNA和编码所有辛德比斯结构蛋白基因(壳体-E3-E2-6K-E1)的RNA辅助构建体。通过将辅助RNA和每种双顺反复制子RNAs电穿孔入8×106BHK-21细胞来制备辛德比斯复制子颗粒。收集培养基，澄清，并通过离心过20％蔗糖垫层(于4℃24,000RPM 3小时)纯化复制子颗粒。利用兔抗CAT抗体(CortexBiochem，San Leandro，CA)滴定复制子颗粒。
为了测定与EMCV IRES相比昆虫病毒IRES序列的活性，利用纯化的辛德比斯复制子双顺反颗粒感染多个生长于培养基中的不同昆虫细胞。用于这些实验中的昆虫细胞为Toxorhynchites amboinensis，白足按蚊(Anopheles albimanus)，冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)，和白纹伊蚊(Aedes albopictus)。用复制子双顺反颗粒于0.1MOI中感染昆虫细胞。感染大约16小时后制备细胞裂解物并根据生产商的说明书利用CAT ELISA试剂盒(Roche，Indianapolis IN)测定存在于裂解物中的CAT蛋白量。同时，利用荧光素酶测试试剂盒(Roche)测定存在于裂解物中的LUC蛋白量。对于每种测试中所用的蛋白质的量将每种裂解物中检测的CAT和LUC量标准化以便两种值的比较(表17)。无论所用的复制子是什么，在每种细胞类型中检测的CAT蛋白是相似的。这一数据提示三种包含IRES的复制子颗粒每种都在一个细胞类型内取得相似的感染效力，并且因而在每种细胞类型中检测到的LUC活性都直接反映在该细胞类型中IRES序列的活性。在每种所分析的昆虫细胞类型中，昆虫-病毒IRES比EMCV IRES具有更多活性(85-95％多)(表17)。
表17.昆虫病毒IRES(APV或RhPV)活性与哺乳动物病毒IRES(EMCV)活性在不同昆虫细胞类型中的比较
实施例9.在灵长类中对于IRES复制子的体液和细胞免疫应答在Southern Research Institute in Frederick，MD.，也在猕猴中对于包含VRPs(实施例6)的pERK/EMCV/gag 342的免疫原性进行了研究。通过皮下和肌内注射(三只动物/途径)将每种疫苗都向六只动物给药。动物在0和1月接受两次1×108疫苗颗粒的接种。在第二次接种4周后对体液免疫应答进行分析(如实施例7中所述)，并在表18中给出。为了进行比较，还对直接由26S启动子(pERK/gag)表达gag蛋白的VEE复制子进行评估。
表18.
尽管已经参考某些实施方案中的具体细节介绍了本方法，但并不意味着这些细节应被视为对本发明范围的限制，本发明的范围包括在所附权利要求中。
在整个本申请中，参考多个专利、专利公开物，期刊公开物和其它公开物。将这些公开物的全部内容并入本申请作为参考以便更加充分地描述本发明所属领域的状态，并对本申请的这些参考文献所出现句子的主题提供书面描述。
权利要求
1.一种重组复制子核酸，其包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列；至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列；至少一个甲病毒亚基因组启动子；至少一个IRES元件；至少一个异源核酸；和编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。
2.权利要求1的核酸，其中所述第二核酸是一种编码甲病毒非结构蛋白nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的连续核苷酸序列。
3.权利要求1的核酸，包含一种起始第二核酸序列，它是编码甲病毒非结构蛋白nsp1，nsp2，和nsp3的连续核苷酸序列，并且进一步包含另一个编码甲病毒非结构蛋白nsp4的第二核酸，它与起始第二核酸序列不连续。
4.权利要求1的核酸，其中所述IRES元件选自细胞IRESs，植物IRESs，哺乳动物病毒IRESs，合成IRESs和昆虫病毒IRESs。
5.权利要求1的核酸，其中所述甲病毒亚基因组启动子是一种最小的或修饰的甲病毒亚基因组启动子。
6.权利要求1的核酸，其中所述异源核酸编码一种蛋白质。
7.权利要求1的核酸，其中所述异源核酸为反义序列。
8.权利要求1的核酸，其中所述异源核酸编码一种核酶。
9.权利要求1的核酸，其中所述异源核酸编码一种甲病毒结构蛋白。
10.权利要求9的核酸，其中所述甲病毒结构蛋白来自选自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，罗斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
11.权利要求1的核酸，其中所述编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列来自选自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，罗斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
12.权利要求1的核酸，其中所述编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列来自选自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，罗斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
13.权利要求1的核酸，其中所述甲病毒亚基因组启动子来自选自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，罗斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
14.权利要求1的核酸，其中所述编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸来自选自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，罗斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
15.权利要求1的核酸，其中所述IRES元件指导由异源核酸编码的基因产物的翻译，从而至少80％的由异源核酸编码的基因产物的翻译由IRES元件的活性控制。
16.权利要求1的核酸，其中所述IRES元件指导由异源核酸编码的基因产物的翻译，从而至少10％的由异源核酸编码的基因产物的翻译由IRES元件的活性控制。
17.权利要求1的核酸，其中所述核酸为RNA。
18.权利要求1的核酸，其中所述核酸为DNA。
19.权利要求1的核酸，进一步包含位于IRES元件上游的间隔区核酸序列。
20.权利要求19的核酸，其中所述间隔区核酸序列长度为至少30个核苷酸。
21.权利要求19的核酸，其中所述间隔区核酸序列长度为25至7500个核苷酸。
22.权利要求19的核酸，其中所述间隔区核酸序列长度为150至1000个核苷酸。
23.传染性的有缺陷的甲病毒颗粒群体，其中每个颗粒都包含权利要求1的核酸，并且如通过细胞培养物传代所测量的，所述群体没有可检测到的可复制病毒。
24.传染性的有缺陷的甲病毒颗粒群体，其中每个颗粒都包含权利要求19的核酸，并且如通过细胞培养物传代所测量的，所述群体没有可检测到的可复制病毒。
25.一种药物组合物，其在一种可药用的载体中包含权利要求23的群体。
26.一种药物组合物，其在一种可药用的载体中包含权利要求24的群体。
27.一种甲病毒颗粒，其包含权利要求1的重组核酸。
28.一种甲病毒颗粒，其包含权利要求19的重组核酸。
29.权利要求27的甲病毒颗粒，包含一种减毒突变。
30.权利要求29的甲病毒颗粒，包含一种减毒突变。
31.权利要求1的核酸，包含一种减毒突变。
32.权利要求19的核酸，包含一种减毒突变。
33.传染性的有缺陷的甲病毒颗粒群体，其中每个颗粒都包含权利要求1的核酸。
34.传染性的有缺陷的甲病毒颗粒群体，其中每个颗粒都包含权利要求19的核酸。
35.一种组合物，其在一种可药用的载体中包含权利要求32的群体。
36.一种组合物，其在一种可药用的载体中包含权利要求33的群体。
37.一种制备传染性的有缺陷的甲病毒颗粒的方法，包括(a)将下列成分导入细胞中(i)权利要求1的重组核酸；和(ii)编码甲病毒结构蛋白的一种或多种辅助核酸；其中一种或多种辅助核酸产生所有的甲病毒结构蛋白；和(b)在细胞中生产所述甲病毒颗粒。
37.权利要求36的方法，其中所述重组核酸包含至少一种编码甲病毒结构蛋白的异源核酸。
38.权利要求36的方法，其中所述辅助核酸是一种重组核酸，其包含5’甲病毒复制识别序列，甲病毒亚基因组启动子，编码甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。
39.权利要求36的方法，其中所述辅助核酸是一种重组核酸，其包含一个启动子和编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核苷酸序列。
40.权利要求38的方法，其中所述辅助核酸为DNA。
41.权利要求40的方法，其中所述启动子为CMV启动子。
42.权利要求40的方法，其中所述辅助核酸包含编码全部甲病毒结构蛋白的核苷酸序列。
43.权利要求36的方法，其中所述辅助核酸是一种重组核酸，其包含5’甲病毒复制识别序列，IRES元件，编码甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。
44.权利要求36的方法，其中所述辅助核酸是一种重组核酸，其包含5’甲病毒复制识别序列，甲病毒亚基因组启动子，IRES元件，编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。
45.一种制备传染性的有缺陷的甲病毒颗粒的方法，包括(a)将下列成分导入细胞中(i)一种甲病毒复制子RNA，其包含5’甲病毒复制识别序列，编码甲病毒非结构蛋白的核酸序列，甲病毒亚基因组启动子，异源核酸序列和3’甲病毒复制识别序列；和(ii)编码甲病毒结构蛋白的一种或多种辅助核酸，所述辅助核酸包含5’甲病毒复制识别序列，甲病毒亚基因组启动子，IRES元件，编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列，由此在细胞中生产所有的甲病毒结构蛋白；和(b)在细胞中生产所述甲病毒颗粒。
46.一种制备传染性的有缺陷的甲病毒颗粒的方法，包括(a)将下列成分导入细胞中(i)一种甲病毒复制子RNA，其包含5’甲病毒复制识别序列，编码甲病毒非结构蛋白的核酸序列，至少一个甲病毒亚基因组启动子，至少一个IRES元件，至少一个异源核酸序列和3’甲病毒复制识别序列；和(ii)编码甲病毒结构蛋白的一种或多种辅助核酸，所述辅助核酸包含5’甲病毒复制识别序列，甲病毒亚基因组启动子，IRES元件，编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列，由此在细胞中生产所有的甲病毒结构蛋白；和(b)在细胞中生产所述甲病毒颗粒。
47.一种重组核酸，其包含5’甲病毒复制识别序列，甲病毒亚基因组启动子，IRES元件，编码一种或多种甲病毒结构蛋白的核酸和3’甲病毒复制识别序列。
48.包含权利要求47的核酸的细胞。
49.权利要求1的核酸，进一步包含甲病毒包装信号。
50.权利要求1的核酸，进一步包含IRES元件上游的间隔区核酸序列。
51.权利要求47的核酸，进一步包含IRES元件上游的间隔区核酸序列。
52.一种在受试者中引发免疫应答的方法，包括向受试者施用免疫原量的权利要求23的群体。
53.一种在受试者中引发免疫应答的方法，包括向受试者施用免疫原量的权利要求24的群体。
54.一种在受试者中引发免疫应答的方法，包括向受试者施用免疫原量的权利要求33的群体。
55.一种在受试者中引发免疫应答的方法，包括向受试者施用免疫原量的权利要求34的群体。
56.一种重组核酸，其包含指导核酸转录的启动子；I RES元件；和编码序列，其中将所述I RES元件可操作性地进行定位，从而编码序列的翻译是通过由IRES元件指导的不依赖于帽的机制。
57.一种重组核酸，其包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列；至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列；第一个甲病毒亚基因组启动子；第一个IRES元件；第一个异源核酸；第二个甲病毒亚基因组启动子；第二个IRES元件；编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。
58.权利要求57的核酸，进一步包含甲病毒包装信号。
59.权利要求57的核酸，进一步包含IRES元件上游的间隔区核酸序列。
全文摘要
本发明提供一种重组核酸，其包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸序列；至少一个编码甲病毒非结构蛋白的第二核酸序列；至少一个甲病毒亚基因组启动子；至少一个IRES元件；至少一个异源核酸；和编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。另外提供制备包含本发明重组核酸的甲病毒颗粒的方法以及利用本发明的组合物的方法。还提供一种重组辅助核酸，其包含编码5’甲病毒复制识别序列的第一核酸；甲病毒亚基因组启动子；IRES元件；编码甲病毒结构蛋白的第二核酸，以及编码3’甲病毒复制识别序列的第三核酸。
文档编号C07K14/18GK1791678SQ200480013928
公开日2006年6月21日 申请日期2004年3月19日 优先权日2003年3月20日
发明者J·F·史密斯, K·坎鲁德, J·O·雷纳 申请人:阿尔法瓦克斯公司