胰岛素受体拮抗剂及相关组合物、用途和方法

专利名称：胰岛素受体拮抗剂及相关组合物、用途和方法
技术领域：
本发明涉及具有胰岛素受体拮抗剂活性的分子、相关药物组合物、 与其相关的另外组合物、此类组合物和分子的用途、以及各种其他相关 方法。
背景技术：
由于其在葡萄糖稳态维持中的重要性，胰岛素是研究最多的肽激素
之一。就其晶形和溶液中的结构而言，这种51-aa激素得到了非常充分 表征。
针对胰岛素的细胞应答经由胰岛素受体介导，所述胰岛素受体是由 2个相同的结合胰岛素的细胞外a亚基和2个相同的具有细胞内酪氨酸 激酶活性的跨膜卩亚基组成的四聚蛋白质。Goldfine, Endocr. Rev., 8: 235 (1987)。当胰岛素与a亚基结合时，|3亚基酪氨酸激酶被活化，并且 胰岛素作用随之发生(导致细胞内信号传导事件级联)。
高胰岛素血症是由血液中异常高水平的胰岛素限定的状况。高胰岛 素血症的原因包括胰岛素瘤和胰岛素抵抗，其可以由先天性高胰岛素血 症或其他状况引起，所述其他状况例如活性的缺乏、肥胖或多嚢性卵巢 综合征。胰岛素瘤是产生过量胰岛素的胰肿瘤。高胰岛素水平引起低血 糖症、或低血糖(糖)。高胰岛素血症是生命的最初几小时后的新生儿 低血糖症的最常见原因。此类状况的治疗通常是必需的，以预防癲痫发 作开始和神经病学后遗症。
一般而言，低血糖症可以是轻度的，并且导致症状，例如焦虑和饥 饿，但患者也处于严重低血糖症的危险中，所述严重低血糖症可以引起 癫痫发作、昏迷和甚至死亡。患者陈诉的与低血糖症相关的一般症状包 括疲劳、虚弱、震颤和饥饿。许多患者必须经常进食以预防由于低血糖 的症状。由于低血糖，某些患者可能发展出精神病症状。
通常，患有胰岛素瘤或其他严重形式的高胰岛素血症的患者通过外 科手术例如部分胰切除术或通过施用药物例如在某些情况下减少胰岛 素生产的二氮唤或促生长素抑制素进行治疗。在某些情况下必须连续输注葡萄糖。不存在减少循环胰岛素作用的现有治疗。
除了某些胰岛素受体抗体(参见，例如，Roth等人，J Biol Chem. 1983 Oct 25; 258( 20 ): 12094-7; Morgan等人，Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jan; 83 ( 2 ) : 328-32; Taylor等人，Biochem J. 1987 Feb 15; 242 ( 1 ): 123-9; Nagy等人，Endocrinology. 1990 Jan; 126 ( 1 ): 45-52;和Fujita 等人，ActaDiabetol. 2002 Dec; 39 (4) : 22卜7)以外，只有少数胰岛 素受体(IR)拮抗剂先前已得到描述。参见，例如，美国专利公开号 20030236190、 20030195147和20040023887以及Pillutla等人，肠/. C/zem. 277 ( 25 ) : 22590-22594, 2002和Schaffer等人，尸簡.脂/. S". 100 ( 8) : 4435-4439,2003。
发明概述
本文描述的本发明存在几个方面。在一个示例性方面，本发明提供 了具有胰岛素受体拮抗剂活性的新肽、蛋白质和蛋白质衍生物。在另一 个方面，本发明提供了包含此类新肽分子的药物组合物。在另外一个方 面，本发明提供了各种另外的有用组合物(例如，包含编码此种肽的序 列的核酸，包含此种核酸的载体和细胞，针对此种肽和蛋白质的抗体 等)。在另外一个方面，本发明涉及此种组合物和分子的新用途(例如， 在病症或状况的筛选/测试中、在各种病症和状况的治疗中、在用于治疗 和诊断应用的抗体的生产中、用于制备蛋白质才莫拟物(mimetics)等)， 和各种其他相关方法。这些和另外的示例性本发明的方面和本发明的特 征在本文中得到进一 步详细地描述。
附图简述


图1。在SGBS细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取和通过添加S661抑 制次最大的胰岛素刺激的葡萄糖摄取。
图2。静脉内(i.v.)施用不同剂量的肽胰岛素受体拮抗剂S661,随 后腹膜内(i.p.)施用人胰岛素后，Zucker Obese (ZO)雄性大鼠中的葡 萄糖概况。
图3。 i.v.施用胰岛素受体拮抗剂S661,随后不同次通过i.p.施用人 胰岛素后，ZO大鼠中的葡萄糖概况。本发明尤其涉及如下发现具有某些物理特征包括包含特定氨基酸 序列的某些新非抗体肽、蛋白质和相关蛋白质衍生物("肽分子，，)可以 用作肽胰岛素受体(IR)拮抗剂(此种肽分子在本文中通常被称为"肽 胰岛素受体拮抗剂"或"PIRAs")。
本发明进一步涉及包含治疗有效量的本发明的一种或多种PIRAs 的新药学上可接受的组合物(作为单独的活性药理学试剂或与一种或多 种"次级"试剂或"次级活性剂"组合)。
本发明还涉及此种PIRAs的新用途，例如使用此种PIRAs生产药物， 以及治疗其中IR活性减少将^L为有利的或有用的状况和病症的方法。
然而，这些仅是本发明的一些有利方面。给定本文提供的本发明的 描述，这些和其他方面对于技术人员将是显而易见的。
一般而言，PIRAs的特征可以是包含至少一个"核心基序"的肽分子， 所述"核心基序"包含(a)式1或式1样("式1型"或"F1T")氨基酸序 列("FITS")和(b )式6或式6样("式6型"或"F6T")氨基酸序列(F6TS ), 其中FITS和F6TS在包含于(或构成)PIRA的肽链中彼此接近定位， 从而使得PIRA与IR结合并且充当IR拮抗剂。F1T和F6T序列在本文 中进一步详细讨论。PIRA可以包括这种F1TS/F6TS"核心基序"的许多重 复或包括超过一个FITS或F6TS,但一般地PIRA包含单个"核心基序" 中包含的单个FITS和单个F6TS。 一般而言，本文提供的FIT和F6T 序列的讨论集中于"核心基序"中包含的FIT和F6T序歹'J 。
PIRAs可以显示对于一种或多种IRs的^f壬何合适水平的亲和力(优 选地，PIRA将显示对于人IR的亲和力)。在一个方面，本发明提供了 对于人IR具有的亲和力比得上由胰岛素对于人IR显示的亲和力的 PIRAs (例如，PIRA对于人IR具有的亲和力是胰岛素那种的至少约35 %、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70 o/0、至少约80%、至少约90%、约100%的亲和力等)。
PIRAs的特征可以是或不是不含其他功能结构域。因此，在一个方 面，PIRA的特征可以是包含至少一个次级肽结构域的融合蛋白，所述 次级肽结构域诱导或促进生理学应答(例如，结合和调节除IR外的受 体)。在另一个方面，本发明提供了不含此种另外结构域的PIRAs。在 一个方面，本发明提供了基本上由单个式1序列(或F1TS)和单个式6序列或F6TS (任选地由合适的接头分开和/或与合适的TDM结合)组成 的PIRAs。
在本发明上下文中的"拮抗作用"指当在胰岛素和IR的存在下时， 化合物(例如，PIRA)可检测地减少胰岛素作用的能力。拮抗剂可以阻 断胰岛素与IR的结合，在胰岛素结合后减少一种或多种胰岛素介导的 IR活性(其中的几个例子已得到充分表征)，或两者。 一般而言，PIRAs 可以显示任何可检测水平的IR拮抗作用。在一个方面，本发明提供了 这样的PIRAs，其使胰岛素介导的IR活性减少至少约10% 、至少约20 %、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%或更多。
在具体方面，本发明提供了这样的PIRAs，其具有增加血糖和/或使 哺乳动物宿主中的胰岛素作用减少至少约4小时、至少约5小时、至少 约6小时、至少约7小时、至少约8小时、或甚至至少约9小时的时间 段的能力。
一般地，PIRA核心基序的F6TS位于相关FITS的C末端(即，核 心基序F6TS在核心基序中相对于FITS定位，从而使得F6TS的N末端 部分最接近F1TS的C末端部分定位)，从而使得PIRAs—般可以被说 成具有式l,式6-方向(或Fl/F6方向)。
PIRA—般可以具有任何合适的大小、构象等。PIRAs的特征可以是 (且一般地，且通常有利地，是)长度约50个氨基酸或更少的单链肽， 例如长度约30 -45个氨基酸(例如，长度35 - 44个氨基酸)。然而， 包含此种大小和组成的PIRA部分或序列的含IRA的较大蛋白质、多聚 体蛋白、多肽链蛋白质衍生物、或复合蛋白质等，也可以使用标准技术 产生，并且^见为本发明的另一个特征。PIRAs的特征可以在于缺乏IR抗 体的特征。因此，例如，PIRAs —般不包含IR抗体中发现的构架区和 CDR序列。此外，PIRAs—般缺乏已知的抗IR抗体的结构(例如，缺 乏IgG分子的经典四聚结构)。
式1序列被定义为包含序列GSLDESFYDWFERQLG ( Gly Ser Leu Asp Glu Ser Phe Tyr Asp Trp Phe Glu Arg Gln Leu Gly) (SEQIDNO: 1) 的氨基酸序列("式1")。式1样序列可以被定义为与SEQ ID NO: 1 非常相似的序列(即，与SEQ ID NO: 1具有至少约60%、至少约65 %、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90 %、或至少约95%的同一性，但小于100%的同一性的序列(此类相似序列可以被称为式1样序列))，其可以与F6TS—起组合在核心基序 中以产生PIRA。在一个方面，本发明提供了其中式l的约1-6个N末 端残基被缺失和/或置换(例如，残基l-5被缺失、残基2-6被缺失、 残基1 - 4被缺失以及残基5和6被其他合适的残基置换等)的PIRAs。 因此，例如，在一个方面，本发明提供了包含F1TS的PIRAs,所述F1TS 基本上由序列FYDWFERQLG (SEQIDNO: 2)组成。在另一个方面， 本发明提供了仅仅以包含这样的序列为特征的PIRAs,所述序列包含基 序FYDWF (SEQIDNO: 3)。在另一个方面，本发明提供了同样可以 或可替代地以具有这样的序列为特征的FlTSs,所述序列标记为式1 Asp9残基(或与其对应的残基)被Gly残基(或类似的等价残基)置换， 从而使得PIRA包含基序FYGWF ( SEQ ID NO: 4 ),例如在基本上由 FYGWFERQL(K SEQ ID NO: 5 )或GSLDESFYGWFERQLG( SEQ ID NO: 6)组成的FITS的背景中。在另外一个方面，本发明提供了包含FITS 的PIRAs，所述FITS同样(除了一个或多个前述特征外)或可替代地 以式1残基Gly16 (或与其对应的残基)的缺乏或置换为特征。 GSLDESFYDWFERQL ( SEQ ID NO: 7 ) 、 GSLDESFYGWFERQL ( SEQ ID NO: 8 ) 、 FYDWFERQL ( SEQ ID NO: 9 )和FYGWFERQL ( SEQ ID NO: 10)是此种FITSs的例子。在另外一个方面，本发明提供了包含 FlTS的PIRAs,所述F1TS同样(即，除了 一个或多个前述特征外)或 可替代地以式1的Arg13 (或相应的残基)的缺失或置换为特征。如已 指出的，这些各种具体修饰可以进行组合，从而使得本发明提供了例如 PIRAs,其特征在于包含才艮据式Xaa22 Xaa23 Xaa24Xaa25 Xaa26Xaa27 Phe Tyr Xaa3o Trp Phe Glu Xaa34 Gin Leu Xaa37 ( SEQ ID NO: 11)的FITS, 其中Xaa22是任选存在的Gly残基；Xaa23是任选存在的Ser残基；Xaa24 是任选存在的Leu残基；Xaa25是任选存在的Asp残基；Xaa26是任选存 在的Glu残基；Xaa27是任选存在的Ser残基；Xaa3o是Asp或Gly残基； Xaa34是任何合适的氨基酸残基(在一个方面Xaaw选自Gln、 His、 Lys、 Glu、 Asn、 Asp牙口 Ser; 在另 一个方面Xaa34选自Ala、 Cys、 Phe、 His、 Ile、 Leu、 Met、 Thr、 Val、 Trp和Tyr;和在另外一个方面Xaa34选自 Glu、 Gln、 Thr、 Lys、 Ser、 Gly、 Pro、 Asp和Glu) , 4旦一4殳地是Arg (虽然在一个方面特征是不是Arg);且Xaa37是任选存在的Gly (式 1A)。在本发明的氨基酸序列背景中的同 一 性可以通过Needleman-Wunsch比对分析(参见Needleman和Wunsch, J. tWo/. S,'o/. O970 ) 48: 443-453 )进行测定，例如通过使用BLOSUM50评分矩阵用ALIGN 2.0 分析，其中起始缺口罚分为-12和延伸罚分为-2 (关于引入ALIGN程序 中的全局比对技术的讨论参见Myers和Miller, CABIOS( 1989 )4: 11-17 )。 ALIGN 2.0程序的拷贝可通过San Diego Supercomputer ( SDSC ) Biology Workbench获得。因为Needleman-Wunsch比对提供了 2个序列之间的 全面或全局同 一 性测量，所以应认识到可以是较大肽序列的部分或子序 列的耙序列可以以类似于完整序列的方式使用，或可替代地，局部比对 值可以用于评估子序列之间的关联，如通过例如Smith-Waterman比对 U嵐肠/. ) 147: 195-197)测定的，所述Smith-Waterman比对可以通过可用的程序获得(可能适合于分析同 一性的其他局部比对 法包括应用启发式局部比对算法的程序，例如FastA和BLAST程序)。 用于评估同 一性的进一步相关的方法在例如国际专利申请WO 03/048185中得到描述。除了具有FITS夕卜，PIRAs进一步特征在于包含至少一个(且一般 地仅有1个)根据式XaaLeu Xaa Xaa Glu Trp Ala Xaa Xaa Gin Cys Glu Val Xaa Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa ( SEQ ID NO: 12 )的氨基酸序列， 其中Xaa表示任何合适的氨基酸残基(式6)。在本发明的具体方面，PIRA的F1T序列和F6T序列直接互相接触。在本发明的具体且通常有利的方面，本发明提供了包含F1T序列和 F6T序列(所述F6T序列位于F1T序列的C末端)的PIRAs,其中所述 F1T序列和F6T序列由接头分开。在一个方面，接头是非氨基酸部分。 此种部分的例子包括脂族或芳族碳链和基于一个或多个聚乙二醇(PEG)如美国专利申请20030195147、 20030236190、 20040023887,以及国际 专利申请PCT/EP2005/054095和WO 2005082404中找到)。在具体通 常有利的方面，本发明提供了包含FIT序列和F6T序列(以式1,式6-方向)的PIRAs，其中所述F1T序列和F6T序列由一个或多个氨基酸残 基分开。在具体方面，F1T序列(F1TS)和F6T序列(F6TS )由1 - 10 个氨基酸残基分开，例如1-8个氨基酸残基，例如l-7个、2-7个、 2-6个、l-6个、2-5个、l-5个、3-6个、3 - 7个或3 - 5个氨基酸残基，或通过包含在此类范围内的任何数目的残基(例如1个、2个、 3个、4个、5个、6个或7个残基)。除非另有说明，任何合适的氨基 酸序列接头都可以用于连接F1TS和F6TS。合适的接头序列的性质是本 领域众所周知的，并且因此无需在本文中详细讨论。 一般而言，氨基酸 序列接头一般主要由"柔性"氨基酸残基组成(至少50%、至少70%、 至少85%、至少90%组成等)。被视为柔性且通常单独或组合用作接 头序列的天然存在的氨基酸残基包括丝氨酸残基、甘氨酸残基等(例如， 在一个方面本发明提供了包含接头的PIRAs,所述接头包含根据式Xaau XaaL2XaaL3 XaaL4 XaaL5 XaaL6的序列，其中XaaLi XaaL2 XaaL3 XaaL4 XaaL5 XaaL6中的每一个独立地是Gly或Ser (此类接头的例子在包含序列Gly Gly Ser Gly Gly Ser ( SEQ ID NO: 13 )的接头中具体体现)。然而，Gln、 Thr、 Lys、 Pro、 Asp、 Phe和Arg残基也可以被一见为足够"柔性的"，尽 管一般地如果存在的话许多此种残基的包括是较不优选的。也可以使用 具有类似"柔性"的合成和经修饰的氨基酸残基。接头中某一百分比的残 基也可以取自"非柔性"残基，例如当接头被赋予其他生物学功能时。在 这个和其他背景中可以适当地掺入PIRAs内的各种非常见氨基酸残基是 本领域已知的并且在本文引入的参考文献中得到描述，并且选择具有所 需性质的残基在普通技术人员仅使用常规实验的技术范围内。例如，当 需要a螺旋接头时，可以使用非天然氨基酸例如Aib (氨基异丁酸)， 并且如果需要卩转角，那么接头可以包含Gly-Pro序列或非天然序列。 一般而言，氨基酸序列接头限于氨基酸，并且不包含任何非氨基酸接头 部分。在可替代方面，可以使用由一个或多个氨基酸残基和非氨基酸连 接部分组成的4妾头。在一个方面，本发明提供了包含F1T序列和F6T序列(以式1，式6 方向)的PIRAs,其中PIRA以包含末端衍生部分("TDM")为特征。 一般而言，末端书f生部分可以是促进PIRA在体内(即，在哺乳动物宿 主中)的稳定性和/或为PIRA提供具有其他所需性质例如改善的溶解度 或改善的药学稳定性的任何衍生部分。此类性质的测量可以通过常规使 用的方法来完成。一般的TDMs包括酰基(例如，乙酰基)和酰胺基(换言之， 一般 的TDM相关的PIRAs包含至少一个(且一般地仅有1个或2个)酰基 衍生或酰胺衍生的氨基酸基)。含TDM的PIRA还可以任选地以包含使F1TS和F6TS分开的接头为特征，例如氨基酸序列接头。 一般地， 包含TDM的任何类型的PIRA将包含位于(直接地或经由接头(氨基 酸序列接头或非氨基酸序列接头)，但一般直接地)F6TS的C末端的 TDM (且通常PIRA将包含仅1个如此定位的TDM),通常其中F6TS 的末端构成PIRA的末端。在具体方面，本发明提供了包含式l,式6方向的FITS和F6TS的 PIRAs，其中所述FITS和F6TS通过氨基酸序列接头进行连接或分开， 其中F6TS的特征是不选自WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS ( SEQ ID NO: 14)。在另一个方面，本发明提供了具有此种特征的PIRAs,其中 所述F6TS的特征是不选自 WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS或 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS ( SEQIDNO: 15)。在另外一个方面， 本发明提供了具有FT6序列的PIRAs,所述FT6序列的特征是与SEQ ID NO: 14、 SEQIDNO: 15或SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15两者具 有约95%或更少、约90%或更少、约85%或更少、约80%或更少、或 甚至约75%或更少的同一性。在更具体的方面，本发明提供了包含这样 的F6TS的PIRAs,所述F6TS与SEQIDNO: 14或SEQ ID NO: 15具 有70 - 95 % 、 75 - 95 % 、 80 - 95 % 、 85 - 95 % 、 90- 95 % 、 70- 90 % 、 75 - 90%、 75 - 85%、 75 - 80%、 80 - 90%、 80 - 85 % 、约80%、或约 85 %的同 一性。此类PIRAs可以任选地进一步以包含一个或多个TDMs 为特征。在另一个方面，本发明提供了包含这样的F6TS的PIRAs,所述F6TS 的特征是与SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY ( SEQ ID NO: 16 )具有约 70 - 95%的同一性，例如约75 - 95%、 80 - 95%、 85 - 95%、 90-95 %、 90%、 95%、 85%、 80%、 75%、 75 - 90 %或80 — 90 %的同 一性。 此种PIRAs可以任选地与FITS和F6TS之间的接头结合，所述接头一 般是氨基酸序列接头。此种PIRAs还可以与一个或多个TDMs结合或可 替代地与一个或多个TDMs结合。例如，此种PIRA可以包含位于F6TS 的C末端Tyr残基处(所述C末端残基通常充当PIRA的C末端)或替 代Tyr残基或另 一个近末端残基的残基(例如在其中F6TS缺乏Tyr21的 此种F6TS的情况下将视为与Ser2Q "对应"的残基)处的单个TDM。在一个方面，本发明提供了包含F6TS的PIRAs,其中式6中包含 的1个或2个Cys残基(或F6TS中的相应Cys残基)被缺失或置换。此种F6TS还可以显示本文描述的就F6TSs而言的任何特征或特征组合 (例如，在其他方面包含根据式6a (下文讨论的)的序列-即，本发明 提供了包含根据式6a的序列的PIRAs，但其中它的1个或2个Cys残基 独立地(如果2个Cys残基都受影响)被缺失或被另 一个合适的残基或 部分置换)。在另 一 个方面，本发明提供了以保留定位类似地式6的Cys残基的 2个Cys残基为特征的PIRAs。此种F6TS可以显示本文描述的就F6TSs 而言的任何特征或特征组合。在另一个示例性和具体方面，本发明提供了 IPRAs,其包含根据式 Xaai Leu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaa8 Xaa9 Gin Cys Glu Val XaaM Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa" ( SEQ ID NO: 17 )的F6TS,其中Xaa!是任何合 适的氨基酸残基；Xaas是Asp、 Glu或另 一种合适的酸性残基；Xaa4是 任何合适的氨基酸残基(一般地选自C、 D、 E、 H、 K、 N、 Q、 R、 S 和T的残基；更一般地选自N、 E、 Q、 H、 R和K的残基；且甚至更一 般地选自N、 E、 Q和K的残基)；Xaag是任何合适的氨基酸残基；Xaa9 是任何合适的氨基酸残基(但一般地选自I、 L、 V、 M、 F、 G和A;更 一般地选自I、 L、 V和M;且甚至更一般地选自I、 L或V) ; Xaa,4是 环烯基结合的氨基酸残基(例如，W、 F、 Y或H; —般地W、 F或Y); 且Xaau不存在或是不带电的亲水性或极性氨基酸残基(例如，S、 T、 N、 Q、 Y、 C或G)(式6a)。包含式6a序列的PIRAs可以以包含如 上文讨-〖仑的TDM,和/或包括FlTS和式6a序列(如上文描述的)之间 的接头(例如，氨基酸序列接头)为特征。式6a PIRAs还可以或可替代 地以下述限制为特征式6a序列不是WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 14 ) 、 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 15)或SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (即，SEQ ID NO: 16), 并且在更具体方面，此种PIRAs可以以下述事实为特征其中包含的式 6a序列与SEQ ID NOs: 14 - 16中的一个或多个约70 _ 95 % 、例如约 75 - 90%、例如约75 - 85%、例如约75 - 80%、例如约80 - 90%、例 如约75%、 80%、 85%或90%相同。在另外一个示例性和具体方面，本发明提供了 PIRAs，其包含根据 式Xaai Leu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaag Xaa9 Gin Cys Glu Val Xaa" Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa21 ( SEQ ID NO: 18 )的F6TS,其中Xaa!是Trp13或Ser, Xaa3是Glu或Asp; Xaa4是Glu或Gin; Xaa8是Gin或Trp; Xaa9 是lie或Val; Xaa^是Trp或Tyr;且Xaa21不存在或是Tyr (式6b)。包含式6b序列的PIRAs可以以包含如上文讨论的TDM，和/或包括 FlTS和式6b序列(如上文描述的)之间的接头(例如，氨基酸序列接 头)为特征。式6b PIRAs还可以或可替代地以下述限制为特征式6b 序列不是WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 14)、 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 15)或 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (即，SEQ ID NO: 16),并且在更具 体方面，此种PIRAs可以以下述事实为特征其中包含的式6b序列与 SEQIDNOs: 14 - 16中的一个或多个约70 - 95 % 、例如约75 - 90%、 例如约75 - 85 % 、例如约75 - 80 % 、例如约80 - 90 % 、例如约75 % 、 80 % 、 85 %或90 %相同。在另外一个方面，本发明提供了包含选自 WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 14)、 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 15)、和 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPS (即，SEQ ID NO: 16 )的F6TS的PIRAs。 如同本文描述的其他PIRAs,此种PIRAs可以包含FITS和F6TS之间的 接头(例如，氨基酸序列接头)和/或TDM ( —般地位于F6TS的C末 端处或位于接近F6TS末端定位的残基处)。在另一个方面，本发明提供了以包含一个或多个先前描述的特性为 特征的PIRAs,其中PIRA的式6型序列不包含序列 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPS ( SEQ ID NO: 19)。在更具体的示例性方面，本发明提供了包含根据式 GSLDESFYDWFERQL-ZrSLEEEWAQIQCEVWGRGCPS-Z2 ( SEQ ID NO: 20)的氨基酸序列(核心基序序列)的PIRAs，其中表示氨基 酸接头，且Z2表示任选存在的末端衍生部分、氨基酸或氨基酸序列(例 如，稳定序列，例如清蛋白或清蛋白衍生的序列)、衍生的氨基酸残基、 或包含C末端衍生的氨基酸残基的氨基酸序列。由本发明提供的具体的示例性PIRA是("S661")。在另外一个方面，本发明提供了包含核心基序的PIRAs,所述核心基(SEQ ID NO: 19 )具有约65 - 95 %的同 一性，例如约70 - 95 % 、 75 - 95 %、 80 -95%、 85 - 95%、 90 - 95 % 、 65 -90%、 70-90%、 75 -90%、 85 -90%、 65 - 85%、 70- 85%、 75 - 85%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85 %或90 %的同 一性。此种"S661样PIRAs"可以以包含TDM为特征，所 述TDM —般与C末端Tyr残基(或将视为与其"对应"的残基-如通过例 如序列比对分析测定的)结合。PIRAs可以通过任何合适的方法进行制备。例如，PIRAs,特别是 非衍生PIRAs可以作为融合蛋白在任何合适的表达系统中生产。与重组 融合蛋白生产相关的方法和原理是本领域众所周知的并且无需在本文 中详细讨论。标准肽合成(例如，固相肽合成)也可以用于产生PIRAs。 可以对此种重组生产或合成的肽进一步实施衍生、缀合、多聚化等，以 形成在本发明范围内的更复杂的分子。PIRAs同样可以通过任何合适的 技术进行纯化。例如，包含例如特定的纯化"标记"(纯化促进序列或部 分)的"PIRA融合蛋白"可以通过已知方法产生并且用作用于获得纯化的 PIRA分子的手段。对于非融合蛋白PIRAs的直接纯化，方法例如差示 电泳、层析、离心也可以如同针对非融合蛋白PIRA的特征的亲和力(例 如基于抗体的)方法那样使用。PIRAs还包括蛋白质"衍生物"(或"PIRA衍生物")，所述蛋白质"衍 生物"包括但不限于，如上所述的TDM结合的PIRAs。术语"衍生物"一 般指其中包含的一个或多个氨基酸残基已进行化学修饰(例如通过烷基 化、酰化、酯形成、酰胺形成或其他相似类型的修饰)或与一个或多个 其他异源取代基(例如，亲脂取代基、PEG部分、由合适的有机部分接 头连接的肽侧链等)共价结合的蛋白质或肽。一般而言，本文描述的PIRAs可以通过包括任何合适数目的此种经 修饰的氨基酸和/或与此种缀合的取代基结合进行修饰。在这个背景中的 适合性一般由衍生物相对于相应的"棵露"(即，非衍生)配对物PIRA 充当IR拮抗剂的能力来确定。 一个或多个经修饰的氨基酸的包括在下 述方面可以是有利的，例如(a)增加多肽血清半衰期，(b)减少多肽 抗原性，或(c)增加多肽保存稳定性。 一个或多个氨基酸例如在重组 生产期间共翻译或翻译后地进行修饰(例如，在哺乳动物细胞中的表达 期间在N-X-S/T基序处的N联糖基化)或通过合成方法进行修饰。经修饰的氨基酸的非限制性例子包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊二烯化(prenlyated)(例如，法尼基化、雜牛儿基栊牛儿基化)氨基酸、 乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、聚乙二醇化(PEGylated)氨基酸、生物素 化氨基酸、羧基化氨基酸、磷酸化氨基酸等。在氨基酸修饰中足以指导 技术人员的参考在文献中自始至终充满。示例性规程在例如Walker (1998 ) PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM Humana Press, Towata, NJ 中找到。 一般地，经修饰的氨基酸选自糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基 酸、法尼基化氨基酸、酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合 的氨基酸、和与有机衍生剂缀合的氨基酸。PIRAs可以通过与聚合物共价缀合进行化学修饰以例如增加其循环 半衰期。示例性聚合物以及使此类聚合物与肽附着的方法在例如美国专 利号4,766,106; 4,179,337; 4,495,285;和4,609,546中举例说明。另外 的举例说明性聚合物包括聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG )部分(例 如，PIRA可以与PEG缀合，所述PEG的分子量为约1,000 -约40,000, 例如约2000 -约20,000,例如约3,000- 12,000，并且甚至更特别地约 5,000)。因此，可以对本发明的肽实施本领域已知的一种或多种修饰，所述 修饰可以用于处理保存稳定性、药物代谢动力学和/或肽的生物活性的任 何方面，例如效力、选择性和药物相互作用。可以对肽实施的化学修饰 包括但不限于，肽与下述中一种或多种的缀合聚乙二醇(PEG)、单 甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均 聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(例如， 甘油)和聚乙烯醇、多聚乙酰神经氨酸或其他基于碳水化合物的聚合物、 氨基酸聚合物和生物素衍生物。蛋白质在Cys残基处的PEG缀合公开于 例如Goodson, R. J.和Katre, N. V.( 1990 )Bio/Technology 8, 343和Kogan, T, P. ( 1992 ) Synthetic Comm. 22, 2417中。其他有用的修饰包括但不限于酰化，所述酰化可以使用标准和已知 方法来进行，例如，使用例如美国专利系列号6,251，856和WO 00/55119 中描述的方法和组合物。在一个方面，本发明提供了制备长效(高度稳 定)的PIRA衍生物的方法，和此种衍生PIRAs。在一个方面，长效PIRA 通过制备包含"PIRA部分"和一种或多种"融合配偶体部分"的融合蛋白 来获得，所述"融合配偶体部分"包含与增加的体内稳定性相关的结构域、序列等。此种融合配偶体序列的例子包括衍生自清蛋白、运铁蛋白 和抗体序列的序列。清蛋白融合蛋白的例子、生产此种融合蛋白的方法、和合适的清蛋白融合配偶体序列在例如美国专利5,876,969和5,766,883 中得到描述。在另一个方面，长效PIRA通过经由化学修饰例如酰化(通 过合适的接头)使PIRA衍生来获得，所述酰化可以例如导致具有与清 蛋白结合的同时充当PIRA的可能性的强清蛋白结合。后者也可以通过 修饰肽序列或用序列使其延伸来达到，所述序列能够与较大的蛋白质 (例如，成骨生长肽(OGP),其与a2-巨球蛋白结合)结合。PIRAs 二i以至少基本上纯-^式使用且提-。"基本上纯的，，分子 是在其中发现它的组合物中相对于它所属的分子种类是占优势种类的 分子(例如，基本上纯的蛋白质是在其中发现它的组合物中占优势的蛋 白质种类)。基本上纯的种类构成组合物中至少约50%的分子类型，且 一般将构成组合物中至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约 90%、至少约95%或更大重量百分比的分子种类。通常，包含PIRA的 组合物在组合物中所有存在的肽种类的背景中对于PIRA或在预期用途 的背景中至少相对于基本上活性的肽种类将显示出至少约98 % 、 98 %或 99%的同质性。例如，肽稳定剂/緩沖剂例如清蛋白可以有意地包括在最 终的药物制剂中，而不妨碍PIRAs的活性，并且因此可以从此种纯度计 算中排除。在基本上纯的组合物的背景中不干扰基本活性的杂质的存在 也是可接受的。纯度可以通过适合于给定化合物的方法(例如，层析法； 琼脂糖和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳；HPLC分析；等)进行测量。在一个方面，本发明涉及包含"分离的"PIRA的组合物。"分离的分 子"指不与显著水平(例如，超过约1%、超过约2%、超过约3%、或 超过约5% )的任何外来和不希望有的生物分子结合的分子，所述生物 分子例如在其中生产PIRA的细胞、细胞培养物、化学介质或动物内包 含的非PIRA生物分子。分离的分子还指由于人为干预(无论是自动化、 手工还是两者)已通过此种纯度阶段显著时间量(例如，至少约10分 钟、至少约20分钟、至少约1小时或更长)的任何分子。在由本发明 提供的各种组合物中的许多中，例如在包含一种或多种药学上可接受的 载体的组合物中，就组合物中的总分子种类数目而言PIRA可以以相对 少量存在(例如，在包含大量药学上可接受的载体、稳定剂和/或防腐剂的组合物情况下)。在一些情况下，另外的肽，例如牛血清清蛋白(BSA) 可以与先前纯化的PIRA—起包括在此种组合物中。然而，^假如组合物 的此种另外的组成成分对于PIRA的预期应用是可接受的，那么此种组 合物仍可以被描述为包含分离的PIRA。换言之，术语"分离的"不意欲排 除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，例如可以形成药学上可接受的制剂的部分。在一个方面，本发明提供了包含基本上不含其他IR结合分子的一 种或多种PIRAs的组合物。在另一个方面，本发明提供了包含具有不同特征的许多PIRAs的组 合物(例如，本发明在一个方面提供了具有不同特征的PIRAs的"混合 物(cocktail)")。用于药学用途的PIRA组合物一般包含至少生理学有效量并且通常 希望地包含治疗有效量的PIRA、 PIRAs的组合、或一种或多种PIRA( s) 和另外的活性/治疗剂。术语例如"治疗有效量，，指当以合适的剂量和合适的时间段递送给 一般对化合物或组合物响应的宿主时，足以在宿主中达到所需治疗结果 和/或一般能够在基本上相似的宿主(例如，具有与待治疗患者相似特征 的患者)中达到此种治疗结果的生物学上活性化合物或组合物的量。 PIRA的治疗有效量可以根据因素如疾病状态，个体的年龄、性别和重 量，以及PIRA在个体中引发所需应答的能力而变。治疗有效量还是其 中治疗有利作用超过试剂的任何毒性或有害作用的量。示例性疗效包括 例如，(a)特定受试者或基本上相似的受试者群体中的疾病、病症或 相关状况严重度中的减少；(b)与疾病、病症或状况相关的一种或多 种症状或生理状况中的减少；和/或(c)预防效果。疾病严重度的减少 可以包括例如，(a)病症传播中可测量的减少；(b)受试者中积极结 果变化中的增加(例如，至少约5%、 10%、 15%、 2(T/q、 25%或更多 的增加)；(c)存活或寿命增加的机会；和/或(d)与疾病状态存在相 关的 一种或多种生物标记中可测量的减少(例如症状量和/或严重度中的 减少；等)。治疗有效量可以在个别受试者的背景中，或更通常地在基 本上相似的受试者群体的背景中(例如，参加涉及PIRA组合物的临床 试验的具有相似病症的许多人类患者，或在临床前实验的背景中用于测 试PIRA的具有相似特征组的许多非人类哺乳动物)进行测量。用于人治疗应用/方案的PIRA的合适剂量预期为约1-200 nmol/kg，例如约1 - 100 nmol/kg。PIRAs还可以以预防有效量递送给宿主作为疾病/病症预防计划的 部分或用于以其他方式增加 一般健康。"预防有效量"指在所需剂量和时 间|殳时在 一般对此种化合物或组合物响应的宿主中有效以在宿主中达 到所需预防结果，或一般能够在基本上相似的宿主中达到此种结果的活 性化合物或组合物的量。示例性预防效果包括与未接受预防方案的相似 患者中的相比较，发展病症的可能性中的减少、病症强度或传播中的减 少、在危急病症期间存活可能性中的增加、疾病状况开始中的延迟、危 急状况传播中的减少等。 一般地，因为预防剂量在疾病前或在疾病早期 时在受试者中使用，所以对于特定PIRA预防有效量将小于治疗有效量。 预防效果还可以包括例如与未接受PIRA组合物的基本上相似患者相比 较，开始的预防、开始时间中的延迟、疾病后续严重度中的减少等。在另一个方面，PIRAs可以以"生理学有效"量递送给宿主或细胞。 生理学有效量是施用于通常对此种试剂响应的宿主后，导致与IR拮抗 作用相关的至少 一种生理效应的诱导、促进和/或增强的活性剂的量。在包含一种或多种PIRAs的药学上可接受的组合物制备背景中， PIRA可以与适合于一种或多种预期施用途径的一种或多种载体(稀释 剂、赋形剂等)组合，以提供药学上可接受的组合物。PIRAs可以例如与乳糖、蔗糖、粉末(例如，淀粉粉末)、链烷酸 的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠和4丐 盐、阿拉伯树胶、明胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷和/或聚乙烯醇混合，且 任选地进一步制成片剂或胶嚢用于常规施用。可替代地，PIRA可以溶 解于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉 米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶、和/或各种緩冲剂。其他载体、 佐剂和施用模式是药学领域众所周知的。载体或稀释剂可以包括时间延 迟材料，例如单独或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或 其他功能上相似的材料。药学上可接受的载体一般还包括与PIRA生理学相容的任何和所有 合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟 剂等。药学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸緩冲盐水(PBS)、 葡萄糖、甘油、乙醇等，及其任何组合。在许多情况下，可能需要在此种组合物中包括等渗剂例如糖，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯 化钠。药学上可接受的物质例如湿润剂或少量的辅助物质例如湿润剂或
乳化剂、防腐剂或緩冲剂，其理想地可以增强PIRA、相关组合物或组
合的保存期限或有效性。关于药物组合物的载体和其他组分的适合性可
以基于对PIRA、相关组合物或组合的所需生物学性质的显著负面影响 的缺乏来确定(例如，111拮抗作用中小于约20%、 15%、 10%、 5%或 1%的减少)。
根据本发明的PIRA组合物、相关组合物和组合可以以多种合适的 形式呈递、制备和/或施用。此种形式包括例如液体、半固体和固体剂型， 例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、乳剂、 微乳、片剂、丸剂、粉末、脂质体、树状聚体和其他纳米颗粒(nanoparticle ) (参见，例如，Baek等人，Methods Enzymol. 2003; 362: 240-9; Nigavekar 等人，Pharm Res. 2004 Mar; 21 ( 3 ) : 476-83 )、微粒和栓剂。关于任 何PIRA相关组合物的最佳形式取决于预期施用方式、组合物或组合的 性质、和治疗应用或其他预期用途。制剂还可以包括例如粉末、糊剂、 软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的载体、DNA 缀合物、无水吸收糊剂、水包油乳剂和油包水乳剂、乳剂、聚乙二醇(各 种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含聚乙二醇的半固体混合物。 前述混合物中的任何一种在依照本发明的处理和治疗中可以是合适的， 前提是经由PIRA的IR拮抗作用未受制剂的显著抑制，且制剂是生理学 相容的且与施用途径容许的。关于与药物化学家众所周知的赋形剂和载 体有关的另夕卜4言息,还参见,例々口, Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 ( 1998 ) 和其中的引用。
在具体方面，PIRAs可以在脂质体中进行配制和施用。在另一个方 面，PIRAs在脂质体中与一种或多种次级试剂一起施用。
PIRA组合物还包括包含PIRA肽和相关盐的任何合适组合的组合 物。任何合适的盐，例如任何合适形式的碱土金属盐(例如，緩冲盐) 都可以在PIRAs的稳定化中使用(优选地盐的量是这样的，从而使得 PIRA的氧化和/或沉淀被避免)。合适的盐一般包括氯化钠、琥珀酸钠、 硫酸钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁和氯化钙。还提供了包含碱和一种或 多种PIRAs的组合物。用于递送PIRA组合物的一般模式是经由肠胃外施用(例如，静脉 内、皮下、腹膜内和/或肌内施用)。在一个方面，PIRA通过静脉内输 注或注射施用于人患者。在另一个方面，PIRA经由肌内或皮下注射施 用。在某些治疗方案中(例如，在胰岛素瘤治疗的情况下)瘤内施用也 可以是有用的。
PIRAs可以以例如固体制剂(包括，例如，颗粒、粉末、发射物颗 粒或栓剂)、半固体形式(凝胶、乳膏等)，或以液体形式(例如，溶 液、悬浮液或乳剂)进行配制。PIRAs可以应用于多种溶液中。用于依 照本发明使用的合适溶液一般是无菌的，溶解足够量的PIRA和组合物 的其他组分，在用于制备和贮藏的条件下稳定，并且对于提议的应用对 受试者是无害的。可以对PIRA实施常规药物操作，例如灭菌，和/或其 可以包含常规佐剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、緩沖剂等。 组合物还可以被配制成溶液、微乳、分散体、粉末、巨乳剂 (macroemulsion )、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。溶液 的所需流动性性质可以通过下述被维持，例如，使用包衣例如卯磷脂， 在分散体的情况下维持所需颗粒大小，和使用表面活性剂。可注射组合 物的延长吸收可以通过在组合物包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐 和明胶来达到。本发明的药学上可接受的组合物的这些和其他组分可以 赋予有利的性质，例如改善的转移、递送、耐受等。
用于药学用途的包含一种或多种PIRAs的组合物可以包括各种稀 释剂、填充物、盐、緩冲剂、去污剂(例如，非离子去污剂例如Tween-80 )、 稳定剂(例如，糖或无蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶 剂和/或适合于包括在用于药学用途的组合物中的其他材料。合适组分的 例子也在例如Berge等人，J. Pharm. Sci., 6661 ) , 1-19 ( 1977) ; Wang 和Hanson, J. Parenteral. Sci. Tech: 42, S4國S6( 1988 );美国专利6,165,779 和6,225,289;以及本文引用的其他文件中得到描述。此种药物组合物还 可以包括防腐剂、抗氧化剂、或本领域技术人员已知的其他添加剂。另 外的药学上可接受的载体是本领域已知的并且在下述参考文献中得到 描述，例如，Urquhart等人，Lancet, 16, 367 ( 1980 ) , Lieberman等人， Pharmaceutical Dosage Forms-Disperse Systems (第2版,第3巻，1998 ); Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms & Drug Delivery Systems (第7 版2000 ) ; Martindale, The Extra Pharmacopeia (第31版)，Remington'sPharmaceutical Sciences (第16 - 20版)；The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Goodman和Gilman,编辑(第9版國1996) ; Wilson和 Gisvolds' Textbook Of Organic Medicinal And Pharmaceutical Chemistry, Delgado和Remers,编辑(第10版-1998)，以及美国专利5,708,025和 5,994，106。药学上可接受的组合物的配制原理也在下述参考文献中得到 描述，例如，Piatt, CHn. Lab Med., 7: 289-99 ( 1987 ) , Aulton, Pharmaceutics: The Science Of Dosage Form Design, Churchill Livingstone (New York ) ( 1988 ) , Extemporaneous Oral Liquid Dosage Preparations, CSHP ( 1998 ),和"Drug Dosage," J. Kans. Med. Soc., 70 (I) , 30-32 (1969)。特别适合于施用PIRA组合物和相关组合物(例如，包含PIRA 编码核酸的组合物或包含PIRA编码核酸的载体)的另外药学上可接受 的载体在例如国际专利申请WO 98/32859中得到描述。
PIRA组合物可以与载体一起进行制备，所述载体将保护化合物免 于快速释放，例如控释制剂，包括植入体、经皮贴剂和微胶嚢化递送系 统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、 聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸及其任何的组合，以便提供 此种组合物。用于制备此种组合物的方法是已知的。参见，例如， Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, 编辑，Marcel Dekker, Inc., New York， 1978 。
在另 一个方面，本发明的组合物与用于经口施用的赋形剂 一起配 制，例如，与惰性稀释剂或可同化的食用载体(具体的经口施用制剂和 方法也分别在本文其他地方得到描述)。PIRA化合物(和若需要的其 他成分)也可以封装在硬或软壳明胶胶嚢中，压缩成片剂，或直接掺入 受试者的々大食内。对于经口治疗施用，化合物可以4参入赋形剂并且以可 摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶嚢、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer) 等形式使用。为了经由除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必须 用材料包被化合物，或使化合物与材料一起共施用，以防止其灭活。
在另一个方面，将PIRA组合物制备为注射剂，如液体溶液或悬浮 液，然而，也可以制备适合于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式。 制剂还可以进行乳化。活性治疗成分通常与药学(即，生理学)上可接 受的且与活性成分相容的赋形剂一起混合。合适的赋形剂是例如水、盐 水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，若需要，组合物可以包含增强活性成分有效性的少量的辅助物质，例如湿润或乳化剂、pH緩冲 剂。
可替代地PIRA可以被配制成作为中和的生理学上可接受的盐形式 的药物组合物。合适的盐包括酸加成盐(即，由肽分子的游离氨基形成) 以及由无才几酸例如盐酸或磷酸，或此种有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、 扁桃酸等形成的盐。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢 氧化钠、钾、铵、钙、或铁，和此种有机碱如异丙胺、三曱胺、2-乙氨 基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。在组合组合物(在下文中进一步讨论) 的情况下，PIRAs可以与 一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用。 此种组合疗法可能需要较低剂量的PIRA和/或共施用的试剂，以便避免 与各种单一疗法有关的可能毒性或并发症。
在另一个方面，本发明提供了 PIRA编码核酸(即，包含一种或多 种序列的核酸，所述序列共同或分别编码PIRA在一种或多种合适的宿 主细胞中的表达)。PIRA编码核酸可以具有任何合适的特征且包含任 何合适的特性。因此，例如，PIRA编码核酸可以是DNA、 RNA或其杂 交物的形式，并且可以包括非天然存在的碱基或核苷酸类似物、糖部分 的置换、另外分子(例如，摄取促进分子)的缀合；经修饰的主链(例 如，促进核酸稳定性的硫代磷酸酯(phosphothioate)主链)的包括、二 级结构促进序列、或此类特征的组合。核酸一般有利地包含促进在一种 或多种靶宿主细胞中的所需表达、复制和/或选择的部件。此种部件的例 子包括复制起点组分、选择基因组分、启动子组分、增强子元件组分、 多腺苷酸化序列组分、终止组分等，其众多合适的例子是已知的。
在进一步的方面，本发明提供了包含一种或多种PIRA编码核酸的 载体。"载体"指促进PIRA编码核酸的表达、PIRA肽的生产、靶细胞的 转染/转化、PIRA编码核酸的复制，促进核酸的稳定性，促进核酸和/ 或转化/转染的细胞的^r测，或以其他方式对PIRA编码核酸赋予有利的 生物学和/或生理化学功能的递送载体。本发明背景中的载体可以是任何 合适的载体，包括染色体的、非染色体的、和合成核酸载体(包含合适 的表达控制元件组的核酸序列)。此种载体的例子包括SV40衍生物、 细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体 DNA组合的载体、以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个示例性 方面，PIRA编码核酸包含在棵DNA或RNA载体中，包括例如线性表
23达元件(如在例如Sykes和Johnston ( 1997) Nat Biotech 17: 355-59中 描述的)，致密核酸载体(如在例如美国专利6,077,835和/或国际专利 申请WO 00/70087中描述的)，质粒载体例如pBR322、 pUC 19/18或 pUC 118/119,"蠓(midge)"具有最低限度大小的核酸载体(如在例如 Schakowski等人(2001 ) Mol Ther 3: 793-800中描述的),或作为沉淀 的核酸载体构建体，例如CaP(V沉淀的构建体(如在例如国际专利申请 WO 00/46147， Benvenisty和Reshef ( 1986 ) Proc Natl Acad Sci USA 83: 9551-55, Wigler等人(1978 ), Cell 14: 725，以及Coraro和Pearson( 1981 ) Somatic Cell Genetics 7: 603中描述的)。此种核酸载体及其使用是本 领域众所周知的(参见,例如，美国专利5,589,466和5,973,972)。在 一个方面，本发明提供了包含PIRA编码核酸的载体，其中所述载体适 合于在细菌细胞中表达PIRA。此种载体的例子包括例如，指导容易纯 化的融合蛋白高水平表达的载体(例如，多功能的大肠杆菌(E. coli) 克隆和表达载体例如BLUESCRIPT ( Stratagene ) , pIN载体(Van Heeke 和Schuster, J Biol Chem 264: 5503-5509 ( 1989 ) ; pET载体(Novagen, Madison WI);等)。合适的PIRA表达载体也可以是或可替代地可以 是例如，适合于在酵母系统中表达的载体。适合于在酵母系统中表达的 任何载体都可以使用。用于在例如啤酒糖酵母(Sacc/^ramycw cewWw'ae )中使用的合适载体包括例如，包含组成型或诱导型启动子例 如a因子、醇氧化酶和PGH的载体(在例如Ausubel，同上和Grant等 人，Methods in Enzymol 153: 516-544 ( 1987)中综述)。
核酸和/或载体还可以包含编码分泌/定位序列的核酸序列，其可以 使多肽例如新生多肽链靶向所需细胞区室、膜或细胞器，或其指导多肽 分泌至周质间隙或细胞培养基内。此种序列是本领域已知的，并且包括 分泌前导或信号肽、细胞器靶向序列(例如，核定位序列、ER保留信 号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚定序列(例如，终 止转移序列、GPI锚定序列)等。
PIRA表达载体可以包含任何合适的启动子、增强子和其他表达促 进元件，或与任何合适的启动子、增强子和其他表达促进元件结合。此 种元件的例子包括强表达启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子、RSV 启动子、SV40启动子、SL3-3启动子、MMTV启动子或HIVLTR启动 子)、有效的聚腺普酸终止序列、关于在大肠杆菌中的质粒产物的复制起点、抗生素抗性基因如选择标记、和/或方便的克隆位点(例如，多接
i;(技术人员口将认识到:匕种术语i际上是在某些条件下相对程度的基因 表达的描述符)。在一个方面，本发明提供了包含编码PIRA的序列的 核酸，所述序列与组织特异性启动子可操作地连接。
在另一个方面，PIRA编码核酸经由病毒载体放置于宿主细胞或宿 主动物中，和/或递送给宿主细胞或宿主动物。任何合适的病毒载体都可 以在这方面使用，并且几种是本领域已知的。病毒载体可以包含单独或 与一种或多种病毒蛋白质组合的任何数目的病毒多核苷酸，其促进本发 明的核酸在所需宿主细胞中的递送、复制和/或表达。病毒载体可以是包 含所有或部分病毒基因组的多核苷酸、病毒蛋白质/核酸缀合物、病毒样 颗粒(VLP)、类似于美国专利5,849,586和国际专利申请WO 97/04748 中描述的那些的载体，或包含病毒核酸和本发明的核酸的完整病毒颗 粒。病毒颗粒病毒载体可以包含野生型病毒颗粒或经修饰的病毒颗粒。 病毒载体可以是需要另一种载体或野生型病毒的存在以用于复制和/或 表达的载体(即，病毒载体可以是依赖于辅助病毒的病毒)，例如腺病 毒载体扩增子。 一般地，此种病毒载体基本上由野生型病毒颗粒，或在
其蛋白质和/或核酸含量方面进行修饰以增加转基因容量或帮助核酸转 染和/或表达的病毒颗粒组成(此种载体的例子包括疱渗病毒/AAV扩增 子)。 一般地，病毒载体类似于和/或衍生自通常感染人的病毒。在这方 面合适的病毒载体颗粒包括例如，腺病毒载体颗粒(包括腺病毒科的任 何病毒，或衍生自腺病毒科病毒的任何病毒)、腺伴随病毒载体颗粒
(AAV载体颗粒)或其他细小病毒和细小病毒载体颗粒、乳头瘤病毒载 体颗粒、黄病毒载体、a病毒载体、疱渗病毒载体、痘病毒载体、逆转 录病毒载体，包括慢病毒载体。此种病毒和病毒载体的例子在下述参考 文献中得到描述，例如Fields等人,编辑，Virology Raven Press, Ltd., New York(第3版，1996和第4版，2001 ); Encyclopedia Of Virology, R. G. Webster等人，编辑，Academic Press(笫2版，1999 ); Fundamental Virology, Fields等人，编辑，Lippincott國Raven(第3版，1995 ), Levine,
"Viruses," Scientific American Library No. 37 ( 1992 ) , medical Virology, D. O. White等人，编辑，Acad. Press (第2版，1994),和 Introduction To Modern Virology, Dimock, N. J.等人，编辑，Blackwell Scientific Publications, Ltd. ( 1994)。可以与本发明的多核苷 酸和其他核酸以及本文描述的方法一起使用的病毒载体因此包括例如， 腺病毒病毒载体；腺伴随病毒(AAV)载体；乳头瘤病毒载体；疱疹病 毒载体；逆转录病毒载体，包括慢病毒载体，痘病毒载体(例如，痘苗 病毒载体)；等。
本发明还提供了包含PIRA编码核酸、载体或其任一或两者的组合 的重组细胞，例如酵母、细菌和哺乳动物细胞(例如，无限增殖化的哺 乳动物细胞)。例如，在一个示例性方面，本发明提供了包含稳定整合 到细胞基因组内的核酸的细胞，所述核酸包含编码本发明的PIRA表达 的序列。在另一个方面，本发明提供了包含非整合的核酸例如质粒、粘 粒、噬菌粒、或线性表达元件的细胞，所述非整合的核酸包含编码PIRA 表达的序列。
核酸、载体和细胞在本文描述的大多数本发明方法中可以用作本发 明的PIRA蛋白质的替代物，例如以便将一种或多种PIRAs"递送"给培 养中的细胞或宿主(与通过上述的其他方法"施用"PIRA相对照(例如， 肽化合物组合物注射、吸入等))。因此，例如，本发明提供了在哺乳 动物细胞中拮抗IR的方法，所述方法包括在适合于核酸表达和PIRA生 产的条件下，将包含PIRA编码核酸的载体引入合适的细胞，从而使得 表达的PIRA与包含对其响应的IRs的细胞接触以便拮抗此种IRs的活 性。
本发明还提供了包含PIRA编码核酸或包含其的载体的转基因生 物。合适的转基因生物包括小鼠、大鼠、鸡、植物、牛、山羊、豚鼠、 猴和其他非人类灵长类动物。转基因动物可以通过根据标准技术稳定引
入PIRA编码核酸来生产。
本发明的另 一个方面在PIRAs、 PIRA组合物以及相关分子和组合物 (例如，PIRA编码核酸，相关载体等)的新用途中具体体现。
在一个方面，本发明提供了治疗受试者(例如，哺乳动物宿主，例 如家庭宠物、家畜或人患者)中其中IR拮抗作用是有利的疾病、病症 或状况的方法，所述方法包括将治疗有效量的PIRA施用(或递送，除 非另有说明，这些术语一般在本文中是可互换的)于受试者，以便治疗 疾病、病症或状况。术语例如"治疗"指以预防任何症状或疾病状态发展 为目的，或以减轻、改善或根除(治愈)已发展的此类症状或疾病状态为目的，递送(例如，施用)有效量的治疗上活性的本发明PIRA化合 物或组合物。术语"治疗"因此一般意欲包括预防治疗。然而，应当理解 本发明的治疗方案和预防方案也可以被^L为本发明分开和独立的方面。 在另一个方面，本发明提供了 PIRAs在此种病症和状况治疗中有用的药 物生产中的用途。如上所述，PIRAs可以个别地或与其他药理学活性剂 组合施用。应当理解此种组合疗法包含不同的治疗方案，包括但不限于， 在单一剂型中或在不同的、个别剂型中共同施用多种试剂。如果试剂以 不同剂型呈现，那么施用可以是同时或接近同时的或可以遵循包含不同 试剂施用的任何预定方案。
在一个方面，本发明提供了治疗受试者中的高胰岛素血症的方法， 所述方法包括给受试者递送有效量的PIRA以便治疗所述状况。在一个 方面，本发明提供了治疗患有高胰岛素血症的受试者(例如，人受试者) 的方法，所述高胰岛素血症的特征是对于群体组(例如，具有正常葡萄 糖耐量和无糖尿病史或药疗法使用的非肥胖男性群体)具有对应于至少 约第75百分位空腹胰岛素水平(例如，至少约第80百分位、第85百 分位、第90百分位、第95百分位等)的血液胰岛素水平。在一个方面， 患有高胰岛素血症的受试者^皮定义为具有约10 ^U/mL (60 pmol/L)或 更多的空腹胰岛素水平，例如约12pU/mL (72pmol/L)或更多(例如， 至少约13 |aU/mL ( 78 pmol/L )、至少约14 pU/mL ( 84 pmol/L )、至少 约15 ^U/mL ( 90 pmol/L)、至少约16 ^U/mL ( 96 pmol/L)、至少约17 ^U/mL( 102 pmol/L )、至少约18 pU/mL( 108 pmol/L )、至少约19 |nU/mL (114 pmol/L )、至少约20 |uU/mL ( 120 pmol/L )、或超过20 |LiU/mL ( 120 pmol/L))。
在具体方面，本发明提供了减少受试者中与高胰岛素血症相关的病 症和症状开始的可能性的方法，例如减少焦虑、异常饥饿、异常疲劳、 暴食、与低血糖相关的精神病症状、和/或低血糖症(包括低血糖症相关 性癫痫发作、昏迷和死亡)。本发明的方法可以应用于治疗各种类型的 持续性高胰岛素血症状况，例如胰岛母细胞增生症(KATP-HI弥散性疾 病、KATP-HI局灶性疾病或"PHHI") 、 GDH-HI (胰岛素过多/高氨血症 综合征(HI/HA)、亮氨酸敏感性低血糖症或二氮。秦敏感性低血糖症)、 胰岛细胞调节异常综合征、婴儿期特发性低血糖症、婴儿期持续性高胰 岛素血症低血糖症(PHHI)、先天性胰岛素过多和胰岛素瘤。在另一个方面，施用或以其他方式递送PIRA以治疗或预防高胰岛素血症的本发 明方法可以应用于患有多嚢性卵巢综合征(PCOS)或处于发展PCOS 的逼近危险中的受试者，所述PCOS通常与高胰岛素血症相关。
在另一个具体方面，本发明提供了通过给受试者施用有效量的
PIRA,减少受试者中发展高胰岛素血症相关的低血糖症的可能性和/或 延迟其开始时间(和/或最终严重度)的方法。
在另外一个具体方面，本发明提供了治疗(提供关于其的疗法和/ 或预防)由高胰岛素血症带来的新生儿低血糖症(或其他"暂时的高胰 岛素血症")的方法，所述方法包括给婴儿受试者递送有效量的PIRA, 以便治疗状况或预防相关状况，减少相关状况的可能性，或延迟相关状 况的开始，所述相关状况如癫痫发作和神经病学后遗症。
在另 一 个方面，本发明提供了减少患有高胰岛素血症相关状况的患 者中的低血糖症严重度的方法。
在另外 一个方面，本发明提供了改善或维持诊断为具有发展胰岛素 瘤或处于发展胰岛素瘤的重大危险中的患者健康的方法，所述方法包括 给宿主递送有效量(治疗有效量或预防有效量)的PIRA。
在另外一个方面，本发明提供了用于维持或改善个体中的健康(和 /或调节个体中的IR活性)的方法，例如具有与高胰岛素血症的高危险 相关特征的个体(例如，高胰岛素血症相关状况的已知家族史或具有高 胰岛素血症的相对高发生的群体组成员，例如在日本人种起源的男性 中)，所述方法包括给个体施用(或以其他方式递送)生理学有效量(例 如，预防有效量)的PIRA。
在另一个方面，本发明提供了用于拮抗细胞中(例如在体外合适的 细胞群体中或在合适的脊推动物(例如，脊索动物)宿主中)的IR活 性的方法，所述方法包括给细胞递送生理学有效量的PIRA。
在另外一个方面，本发明提供了减少受试者中循环胰岛素的作用的 方法，所述方法包括给受试者递送生理学有效量的PIRA。
在另一个方面，本发明涉及关于高胰岛素血症或高胰岛素血症相关 状况(例如高胰岛素血症相关的低血糖症)的疗法，其中所述疗法包括 递送与相对减少量的次级试剂(例如胰高血糖素)组合的有效量PIRA， 如与不连同PIRA使用以达到类似疗效的量相比较的。
在进一步的方面，本发明提供了用于降低受试者中的血糖水平的方法，所述方法包括给受试者递送生理学有效量的PIRA。
在另外一个方面，本发明提供了减少受试者中胰岛素的作用的方 法，所述方法包括给受试者施用生理学有效量的PIRA。
在另一个方面，本发明提供了用于增加受试者中的胰岛素分泌的方 法，所述方法包括给受试者施用或以其他方式递送生理学有效量的 PIRA,以便增加其中的胰岛素分泌。不希望被任何具体理论束缚，在测 试哺乳动物中与PIRA施用相关的实验证据暗示胰岛素分泌得到增加， 推测是由于其中IR介导的反馈系统的关闭。在另一个方面，本发明提 供了治疗I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量降低、和/或空腹 葡萄糖耐量降低的方法，所述方法包括给受试者如，诊断为有此需 要的人受试者)施用(或以其他方式递送)预防或治疗有效量的PIRA， 任选地与适合于治疗待治疗病症的 一种或多种其他治疗活性剂(例如， 抗糖尿病剂)组合。在另一个方面，本发明涉及PIRA (或相关化合物/ 组合物-例如编码PIRA的核酸)在用于治疗下述病症的药物制备中的 用途I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量降低、和/或空腹葡 萄糖耐量降低。
在另一个方面，本发明涉及用于任何上述治疗方案或本文描述的其 他治疗目的的药物制备，其通过使用一种或多种PIRAs，任选地与本文 描述的其他次级治疗剂一起实现。因此，例如，在具体方面，本发明提 供了 PIRA在用于治疗高胰岛素血症的药物制备中的用途。
如本文其他地方所述，适当时，在本文描述的治疗方法的实践中(包 含此类试剂组合的组合物也是本发明的特征)，PIRA (s)可以与次级 试剂一起共施用，或与次级试剂结合施用，所述次级试剂可以包括例如 一种或多种抗胰岛素过多(例如，胰岛素生产减少)试剂和/或抗低血糖 症试剂例如二氮。秦、善得定、硝苯地平、奥曲肽、胰高血糖素、或其任 何或全部的组合。PIRA施用也可以与用于治疗高胰岛素血症相关状况 的外科手术例如胰切除术结合提供。
一般而言，在本文描述的本发明方法的实践中，PIRAs可以通过任 何合适的方式递送，例如通过在把宿主细胞中由编码PIRA生产的核酸 表达(例如，通过在诱导型启动子的控制下且包含在合适的基因转移载 体中由PIRA编码核酸表达，例如耙向的和复制缺陷型基因转移载体)。 一般地，PIRAs通过给受体宿主直接施用PIRA或PIRA组合物来递送。因此，PIRAs和PIRA组合物可以作为药物组合物来施用和/或通过基因 疗法来递送，所述药物组合物包含本领域已知的用于递送蛋白质和肽的 标准载体。 一般而言，并且适当时，术语施用和递送在本文中应被解释 为提供彼此的支持(例如， 一般应当认识到作为PIRA蛋白质直接施用 的可替代方法，PIRA编码核酸可以用于将棵PIRAs递送给靶宿主组织)， 尽管还应当认识到就任何具体分子而言每种此种方法是本发明的独特 方面，和一些分子(例如包含降解抗性有才几部分的缀合的PIRAs) <又顺 应某些递送/施用方式。用于施用蛋白质、核酸和相关组合物(例如，载 体和宿主细胞)的方法是众所周知的，并且因此仅在本文中简要描述。
PIRA组合物、相关组合物和组合组合物可以经由任何合适的途径 进行施用，例如经口、粘膜、口腔含化、鼻内、可吸入、静脉内、皮下、 肌内、肠胃外或局部途径。此类蛋白质还可以经由微泵或其他合适的装 置连续施用。
PIRA或其他PIRA —般将在疾病状况存在时施用，前提是蛋白质促 使状况停止恶化或改善。PIRA —般将作为药学上可接受的组合物的部 分施用，例如，如本文其他地方详细描述的。
一4殳而言，PIRA或相关化合物/组合物可以通过任何合适的途径施 用，但一般地以包含常规药学上可接受的载体、佐剂等(稳定剂、崩解 剂、抗氧化剂等)的剂量单位制剂肠胃外施用。如本文所使用的，术语 "肠胃夕卜"包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、脊柱内、 颅内、胸内、输注技术和腹膜内递送。因此，在一个方面，在本发明的 治疗方法的实践中，PIRA组合物静脉内或皮下施用。注射途径还包括 注射到肌肉内(肌内IM);在皮肤下注射(皮下(s.c.));注射到静 脉内(静脉内(IV));注射到腹腔内(腹膜内(IP));和其他递送 到皮肤内/穿过皮肤(皮内递送，通常经由多次注射，这可以包括生物弹 射(biolistic )注射)。
在一个方面，本发明提供了调节宿主中的IR活性的方法，所述方 法包括施用药物组合物，所述药物组合物包括药学(即，生理学)上可 接受的载体、赋形剂或稀释剂与作为活性剂成分的一种或多种IR激动 剂PIRAs (它可以进一步与如其他地方描述的次级活性剂组合)的混合 物。
本发明的药物组合物可以通过口或肠胃外途径全身地施用。非限制性肠胃外施用途径包括皮下、肌内、腹膜内、静脉内、经皮、吸入、鼻 内、动脉内、鞘内、肠内、舌下或直肠。由于一般的氨基酸序列的不稳 定性质，肠胃外施用可以是有利的。有利的施用方式包括例如，用于鼻
或支气管吸收的气溶胶；用于静脉内、肌内、胸骨内或皮下注射的悬浮 液；和用于经口施用的4匕合物。
静脉内施用例如可以通过注射单位剂量来进行。当关于本发明的药 物组合物使用时，术语"单位剂量，，指适合作为用于人的单一剂量的物理 上不连续单位，每个单位包含与所需稀释剂结合的计算产生所需疗效的 预定量活性材料；即，用于稀释浓缩的或纯物质(液体或固体)，从而 使得那种物质变成用于使用的正确(稀释)浓度的液体。对于可注射的 施用，组合物在无菌溶液或悬浮液中或可以在药学上和生理学上可接受 的水性或含油载体中乳化，所述载体可以包含防腐剂、稳定剂和用于使 得溶液或悬浮液与受体体液(即，血液)等渗的材料。
适合于与一般制剂一起使用的赋形剂包括水、磷酸緩冲盐水、氯化
钠水溶液、葡萄糖、甘油、稀释乙醇等、及其混合物。举例说明性稳定 剂是聚乙二醇、蛋白质、糖类、氨基酸、无机酸和有机酸，其可以独立 地或作为混合物使用。使用的量或数量、以及施用途径基于个体进行确 定，并且对应于本领域技术人员已知的相似类型的应用或适应症中使用 的量。
药物组合物一般可以以与剂量制剂相容的方式，并且以治疗有效量 进行施用。待施用的量取决于待治疗的受试者和所需IR调节程度(例 如，所需治疗或预防结果或效应)。待施用的所需活性成分的精确量取 决于从业者的判断并且对每个个体是特异的。然而，合适的剂量可以为 约1 - 200 nmol(例如，约10 - 200——例如约1 - 100,例如约10 - 100 ) nmol活性肽/千克个体体重/天，并且取决于施用途径。用于最初施用和 加强注射的合适方案也是可变的，但具有最初施用随后为以一个或更多 个小时时间间隔通过后续注射或其他施用的重复给药的特征。可替代 地，足以维持血液中的皮摩尔浓度(例如约IpM-约10nM)的连续静 脉内输注是预期的。
在另 一个具体方面，PIRA或PIRA组合物通过可注射的泵以用于由 此种装置使用的液体或其他合适的制剂进行递送。PIRAs也可以通过例 如目前用于递送胰岛素产品的笔(pen)施用。经皮贴剂(例如基质贴剂中的药物)的^f吏用也可以用于递送PIRAs (例如，通过^皮动递送或经 由离子电渗疗法的递送)。
药物制剂制备中的进一步指导可以在下述参考文献中找到，例如， Gilman等人(纟扁專辱)，1990, G/Zma"k.. 7Tze尸/za厂waco/og/ca/
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为了更好地举例说明具体方面，本文进一步提供了剂量原则的详细 讨论。
在一个方面，本发明的方法包括在1个月的时间段内施用或以其他 方式递送2种不同的PIRAs,疗法的开始涉及第一种PIRA的第一次递 送后约1-3周(例如，约10天)开始的第二种PIRA,或当宿主中发 展出针对第一种PIRA的显著免疫应答，从而使得第一种PIRA的继续 使用已变得对患者有害时，在任何时候开始的第二种PIRA。
本发明的特别有利的方面在配制用于经口施用的药学上可接受的 组合物和此种组合物在IR活性调节中的用途(例如，在治疗糖尿病或 相关状况例如IR调节的代谢紊乱的背景中)中具体体现，所述组合物 包含治疗和/或预防有效量的一种或多种消化酶稳定的PIRAs(包含如上 所述的一种或多种罕见的降解抗性氨基酸残基和/或降解抗性部分)。与 较大的蛋白质例如抗体(它在大小方面可以是数百个氨基酸，跨越至少 2条氨基酸链散布)相比较， 一般PIRAs的相对小尺寸和简单结构(例 如，在许多PIRAs的情况下约40个氨基酸残基的单链)本身且自然地 被认为帮助此种蛋白质的经口递送。N和/或C末端阻断修饰(特别地， 例如分别地乙酰化(或其他酰化)和酰胺化)的添加祐j人为增加此种分 子被经口递送的能力。与目前已知的胰岛素和胰岛素类似物形式相比 较，降解抗性的罕见氨基酸残基和/或有机部分的包括也被认为或可替代 地:故认为显著增加此种肽通过经口途径有效递送的能力。包含此种特征 组合的PIRAs被认为对于经口递送合适的治疗剂是特别有利的。在一个 方面，本发明提供了在经口施用后与肠胃外注射相比较，可以显示出至 少约1%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%或更多的相对生物利用度的PIRA经口制剂。PIRAs的固有经口递送能力可以 通过用经口递送增强组合物配制PIRAs得到增强，其中使用本领域已知 的和已证实在增强小肽的经口递送和利用率方面有效的方法。 一般地， 经口制剂试图抑制或调节使肽降解的蛋白水解活性；增强肽的细胞旁 (paracellular)和/或跨细胞转运；改善肽通过粘液屏障的穿透(特别是 在快速溶解形式和气溶胶递送或喷雾递送的经口施用形式的情况下)； 和/或增加肽在循环中的半衰期(特别是对于需要持续存在用于治疗效果 的肽)。i殳备可以帮助此种递送。例如，PIRA组合物可以配制用于通 过气溶胶喷雾设备递送，所述设备允许将组合物递送至其中可以发生制 剂吸收的颊粘膜和口咽区域。用于递送小肽例如胰岛素的此类设备的例 子是本领域已知的。
在一个方面，本发明提供了 PIRA经口制剂组合物，其中与不使用 稳定缀合或包装材料的PIRA稳定性相比较，PIRA与载体分子缀合或形 成胶嚢以改善PIRA的稳定性。PEG缀合物和一般地稳定和递送增强缀 合材料的例子。PIRAs可以例如与基于PEG的两亲寡聚体缀合，所述寡 聚体增加GI吸收和/或减少PIRA的蛋白水解降解。在另一个示例性方 面，包裹PIRA组合物的磷酸4丐-PEG-胰岛素-酪蛋白(CAPIC)颗粒用 作经口递送形式(微粒和纳米颗粒形式在这个部分中的其他地方进一步 描述)。
在 一个方面，PIRA与促进被动跨细胞转运的递送试剂或载体缀合。 理想地，此类载体或试剂进行工程改造以便在循环中与PIRA解离(例 如，达到暴露于低pH条件的某一水平后)。
在另一个方面，PIRA在包含一种或多种经口递送促进赋形剂，例 如胆酸钠和/或胰蛋白酶抑制剂的包有肠溶衣的微胶嚢或片剂中进行配 制。在另外一个进一步的方面，提供了包含有效量的去污剂组分的PIRA 经口制剂，所述去污剂组分增加肽的溶解度，减少与肠粘液的相互作用， 和/或增强细胞旁转运。
在另外一个方面，PIRA与一种或多种(一般地几种)低分子量 (LMW)聚合物缀合物进行缀合，所述缀合物通过例如就相关/相似的 棵PIRAs而言增加针对酶促降解的抗性，和/或允许更佳的胃肠转运(例 如，通过构成屏障的细胞和组织的水和脂肪部分的改善扩散，以沿着胃 肠途径吸收和进入血流内)来促进经口递送。用于构建经口递送增强小肽缀合物的组合物、方法和相关原理在例如，美国专利5,359,030; 5,438,040;5,681,811;和6,309,633中提供。
在另一个方面，本发明提供了包含基于氨基酸的胶嚢系统的经口递 送PIRA制剂，所述胶嚢系统促进肠衬里(lining)通过且抑制PIRA的 酶促降解。
在另外一个方面，本发明提供了包含PIRA或PIRA组合物的脂质 或脂质体胶嚢化的PIRA经口递送制剂，其促进通过一种或多种上皮屏 障的传输和/或保护PIRA免于酶促降解。理想地，此类脂质制剂促进药 物组合物经由口粘膜的显著吸收，>^人而避免"首过(firstpass)"效应。
在另一个方面，本发明提供了其中PIRA包含在微粒内的PIRA经 口递送制剂，所述制剂直接施用或插入胶嚢、包等内，用于直接经口施 用或经由经口递送设备施用(本文描述的其他经口递送形式一般也可以 通过此种方法递送给宿主)。在具体方面，本发明提供了由藻酸盐小球 体组成的PIRA经口递送制剂。理想地，藻酸盐是由US FDA分类为公 认安全的天然存在的藻酸盐，且任选地还诱导或促进对上胃肠道粘膜的 保护作用。在另一个方面，提供了包被的晶体制剂。挤出团成球状
(extrusion spheronization)是允许高浓度的活性物质净皮包括在高药物浓 度的小丸内且可以应用于PIRA制剂的技术。
在另一个方面，PIRA组合物呈现为在瓶或其他容器(例如，单位 剂量容器)中的包被颗粒的干糖浆悬浮液用于液体经口施用。
一般而言，本文描述的制剂可以是持续释放配制、味觉掩蔽或包有 肠溶衣的组合物。
在另 一个方面，本发明提供了在相对硬的明胶胶嚢中的半固体基质 系统用于经口施用。 一般地，此种胶嚢进一步包含递送促进试剂，例如 脂质肽递送系统。本发明还提供了包含包被微粒的软小丸片剂。可以是 水惰性(hydro-inert)和/或脂惰性(lipo-inert)的骨架片是另一种潜在 合适的经口递送形式。 一般地，此种片剂包含PIRA组合物的包被微粒 和任选地肽酶抑制剂和/或穿透增强剂或其他合适的赋形剂。合适的穿透 增强剂可以包括表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、柠檬酸盐和螯合剂(例 如，EDTA),尽管其他合适的穿透增强剂也可以包括在这些组合物或 本文描述的其他经口递送形式中。例如，环糊3睛可以用于增强PIRA樣t 粒、缀合物或其他药物形式的穿透。在另外的方面，本发明提供了包含一般促进与GI道结合的生物粘 附聚合物或其他生物粘附材料的PIRA组合物。此种聚合物的例子包括 聚卡波非和壳聚糖。如已提及的，载体系统例如纳米颗粒、小球体、脂 质体等(例如，单层小脂泡(SUVs);含清蛋白的纳米颗粒；含曱基丙 烯酸曱酯的纳米颗粒；和含清蛋白的小球体(例如，清蛋白/氧化铁磁性 和可耙向小球体或其他可粑向微粒/纳米颗粒制剂)也可以用于或可替代 地可以用于促进PIRA组合物给患者的经口施用。此种制剂可以进行工 程改造以增强来自GI道的各个区域的吸收和/或防止PIRA组合物的降 解。
乳剂和微乳也可以用作关于PIRAs的经口递送制剂。例如，包含疏 水相；不连续的水性亲水相；和用于使包含PIRA组合物的亲水相(疏 水相一般形成乳剂的约5-10重量％ )分散于疏水相(其一般以乳剂中 约65-80重量％存在)中的至少一种表面活性剂(例如，泊洛沙姆124, 聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride ),失水山梨糖醇月桂酸 酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯，或类似表面活性剂可以包括在此种 乳剂和相关预制乳剂浓缩物中)的油包水乳剂作为油包水乳剂在促进 PIRA组合物的经口递送中可以是有用的，所述疏水相包含油酸、顺9-二十石友烯酸、芥酸、亚油酸、亚麻酸、蓖麻油酸、花生四烯酸、此种酸 的甘油酯、油醇、d-a-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，其任何的组合、或相 似分子，所述PIRA组合物可以包括醇、盐溶液等)。乳剂可以包被在 包肠溶衣材料中，相对于适合于本发明的经口递送制剂的其他包衣材 料，所述包肠溶衣材料在如提及的酸性水环境中可以是可溶的。
在另一个方面，本发明提供了包含与硫醇化聚合物药物载体基质或 聚合物结合的PIRA的经口递送制剂。此种聚合物的例子是2-亚氨基硫 杂环戊烷(Iminothiolane )。在一个方面，此种聚合物与壳聚糖共价连 接以形成壳聚糖缀合物。任选地，酶抑制剂(例如，Bowman-Birk抑制 剂和/或弹性酶抑制剂)可以与缀合物的壳聚糖组分缀合。同样或可替代 地，渗透介质可以与PIRA组合物一起包括在由此种壳聚糖形成的片剂 中。硫醇基在聚合物上的固定可以增强此种制剂的粘膜粘着剂/粘合剂性 质。
胶嚢化包衣可以包括药学活性成分例如亲水性表面活性剂、亲脂性 表面活性剂和甘油三酯的不同组合。用于经口施用剂型的持续释放的经
35口递送系统和/或肠溶衣也是预期的，例如下迷美国专利号中描述的那
些于1987年11月3日颁发的美国专利号4,704,295,于1985年12月 3曰颁发的美国专利号4,556,552,于1982年1月5日颁发的美国专利 号4,309,404和于1982年1月5日颁发的美国专利号4,309,406。固体载 体的另外例子包括皂土、硅石等。另外的示例性材料在本文其他地方得 到描述。
在进一步的方面，提供了包含水凝胶的PIRA经口递送形式。PIRAs 可以在例如甲基丙烯酸乙二醇接枝共聚物的水凝胶中掺入并且经口递 送。PIRAs还可以与水凝胶复合。pH响应的复合水凝胶，例如包含悬垂 葡萄糖(P ( MAA-co-MEG ))或枝接的LMW (例如，约200 MW ) PEG 链(P (MAA-g-EG))的水凝胶可以有利地用作PIRA经口递送试剂。
纳米球体(nanosphere)、小球体和其他纳米颗粒/微粒可以由曱基 丙烯酸的交联网络形成和/或接枝有PEG (s)的丙烯酸可以是有用的经 口递送制剂。用于使药物产物在低pH (例如，约3)下截留在此种納米 球体中，但在生理学pH(例如，约7)下作为可释放试剂的方法是本领 域已知的。用于棵的和缀合的小肽递送的另外的示例性微粒制剂以及相 关方法和原理在例如美国专利6,191,105中阐述。
经口递送制剂还可以呈现为选自气溶胶、喷雾剂和干粉的可吸入组 合物。本发明的此种药物制剂可以以气溶胶喷雾剂的形式施用，使用例 如如下述美国专利号中描述的那些喷雾器于1986年11月25日颁发 的美国专利号4,624,251;于1972年11月21日颁发的美国专利号 3,703,173;于1971年2月9日颁发的美国专利号3,561,444和于1971 年1月13日颁发的美国专利号4,635,627。其他气溶胶递送系统例如如 下述参考文献中公开的加压计量剂量吸入器(MDI)和干粉吸入器可以 在本发明实践时使用:Newman, S. P. in Aerosols and the Lung, Clarke, S. W.和Davia, D.编辑，第197-224页，Butterworths, London, England, 1984。
在进一步的方面，PIRA组合物被配制成设计为将治疗剂量的PIRA (s)递送到患者的体循环内的粘膜粘着剂肠贴剂。此种肠贴剂^1认为 使结合的PIRA定位于接近粘膜并且保护其免于蛋白水解降解。此种贴 剂与肠的安全附着已由胰岛素制剂得到证实，且此种贴剂已显示对于肽 药物递送是有效的。
本文描述的经口递送制剂可以应用于本文具体描述的新PIRAs、其变体(如本文所描述的)、衍生自先前专利文件中描述的PIRAs的PIRAs (如通过本发明的各种方面中的一个或多个修饰的)，或甚至先前专利 文件中描述的未修饰的PIRAs,前提是在此种组合物中包括此种未修饰 和先前表征的PIRAs导致经口施用中的有效性增加。此种组合物在本发 明的各种方法中的用途是本发明的另 一个方面。
在另一个方面，本发明提供了用于PIRAs或PIRA组合物(例如包 含PIRAs和/或PIRA与次级试剂组合的组合物)的肺递送的制剂。PIRAs 可以直接施用于肺或在标准药物制剂中施用于肺(由于此种分子用于这 些递送形式的上述有利特征)，但更一般地在被工程改造用于肺递送的 制剂中施用，例如在可以作为用于吸入的气溶胶递送的颗粒中。PIRA 组合物可以例如^皮制备为用于通过干粉(并且在递送前贮藏于合适的组 合物中例如泡罩包装)吸入器施用的干粉。用于此种系统的干粉制剂中 的颗粒的颗粒大小直径小于约5 ,且对于药物组合物此种颗粒一般为 约90%或更纯。此种组合物可以通过已知的"玻璃稳定化技术"进行制 备。可替代地，PIRA组合物可以在水性组合物中进行配制(同样任选 地贮藏于泡罩包装中)且通过水性雾吸入器(例如，经工程改造以确保 正确给药的微处理器控制的水性雾吸入器)。此种装置可以提供递送中 超过常规喷雾器至少约5倍，例如约10倍的增加。喷雾器、计量剂量 吸入器(MDIs)和干粉吸入器(DPIs)可以用于此种制剂的递送。许多 此种设备和类似设备已开发用于肽药物的肺递送。制剂还可以就递送后 的长期IR调节活性进行工程改造，例如，在颗粒药物的情况下，通过 使用增强剂和/或通过使用长效促进颗粒特征(例如，包含大量例如至少 约50%乳酸乙醇酸共聚物的多孔颗粒；具有小空气动力学尺寸(例如， 约1 - 3)Lim),低密度(例如，约0.1 gm/ml或更少)，和大几何学颗粒 大小(例如，约10-20 pm)的干燥颗粒。
PIRA组合物可以包含增强此种分子的肺递送的PIRA衍生物，例如 低分子量聚乙二醇化的PIRAs。在另一个方面，PIRA组合物以PEG颗 粒、磷酸4丐(CAP)颗粒、或PEG-CAP颗粒(一般在悬浮液中)的形 式递送给肺，所述颗粒可以使用标准技术(例如，受控制的沉淀技术) 进^f亍制备。此种颗粒组合物可以通过例如气管内滴注和/或喷雾滴注特异 地递送给肺。此种颗粒还可以任选地与一种或多种酪蛋白结合(例如， 作为用于PEG、 CAP或PEG-CAP颗粒的包衣-通过向酪蛋白溶液中添加颗粒且允许酪蛋白在颗粒周围聚集和/或与颗粒复合而形成)。类似组 合物还可以用于经口递送形式或鼻递送形式(例如，经口喷雾制剂)， 且此种分子可以以其他形式(例如，水凝胶)使用。
用于小肽例如胰岛素的肺和经口递送的许多策略、组合物和设备已
在本领域中得到开发和描述，其同样可以应用于本发明的PIRA和PIRA 组合物(例如，通过修饰类似于其中描述的胰岛素分子的PIRA;配制 类似于其中描述的胰岛素制剂的PIRA组合物；使用类似于其中描述的 那些的方法和/或设备施用PIRA)。可能在此种制剂制备中有用的此种 方法、原理、递送设备和类似组合物的例子在例如下述参考文献中得到 描述例如，Garcia-Contreras等人，AAPS PharmSci 2003; 5 ( 2 ) Article 9 (2003 ); Steiner等人，Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2002 Jan; 110 (1 ): 17-21; Pfutzner等人，Diabetes Technol Ther. 2002; 4( 5 ): 589-94; Gonda, I.等人Journal of Controlled Release 1998; 53: 269-274; Schuster, 丄等人Pharmaceutical Research 1997; 14 ( 3 ): 354-357; Farr， S丄等 人，Interpharm Press Inc., Buffalo Grove, Illinois. 1996,第175-184页； Thippawong， J.等人,Diabetes Technology & Therapeutics 2002; 4(4): 499-504; Sangwan, S.等人，Journal of Aerosol Medicine. 2001; 14 ( 2 ): 185-195， Mudumba S.等人，Respiratory Drug Delivery VII. Dalby R.N.等 人(编辑)Serentec Press, Raliegh, NC. 2000.第329-332页;Brinda， Curr Opin Investig Drugs. 2002 May; 3 ( 5 ): 758-62; Brunner, G.A.等人， Diabetologia 1991 ; 44 : 305-308 ; 美国专利申请20040096401 ; 20040089290; 20030216542; 20030148925; 20030113273; 20020046750; 20010039260; 20030150446;以及美国专利6,635,617; 6,518,239; 6,349,719; 6,335,316; 6,098,615; 6,024,090; 5,672,581; 5,915,378; 5,970,240;和5,813,358。
其他应用
PIRAs可以应用于涉及胰岛素受体的任何化学或生物化学过程的研 究。某些PIRAs阻断胰岛素受体与胰岛素结合的能力可以允许研究者测 定胰岛素受体在涉及胰岛素信号传导或胰岛素清除率和/或降解的体内 和体外过程中的重要性。
关于PIRAs的此种应用的一个例子是定量哺乳动物中胰岛素或胰岛素类似物的受体介导降解的程度。该方法包括在连续输注后测量胰岛 素或胰岛素类似物的稳态血浆浓度，伴随或不伴随通过注射或输注施用
PIRA。根据伴随和不伴随PIRA施用的稳态浓度比，可以估计受体介导 的降解或清除率的贡献。
此种方法的另一个例子在其他相关细胞表面受体例如IGF1受体的 存在下，定量胰岛素受体对通过胰岛素或胰岛素类似物引起的细胞信号 传导过程的贡献中具体体现。该方法包括伴随或不伴随合适浓度的PIRA 的添加执行研究中的效应物测定，以阻断经由胰岛素受体激活引发的效 应。伴随和不伴随PIRA添加获得的结果之间的差异反映了胰岛素受体 介导的信号传导的贡献。
此种技术的另外一个例子是选择性针对组织(例如，脑)施用PIRA (例如，通过局部化的施用或通过由组织特异性耙向的载体表达，任选 地其中PIRA编码序列在组织特异性启动子的控制下)，以确定阻断胰 岛素受体信号传导在那种特定组织中的效应。此各种方法可以包括在胰 岛素的存在下在其中PIRA的效应局部化于问题的条件下，递送阻断胰 岛素与组织结合的PIRA(例如使用技术，例如在体内研究的情况下先 前提及的那些，或在体外研究的情况下通过获取组织样品)，和测量已 知和所需的胰岛素胰岛素受体反应参数(例如胰岛素相关的IR信号
传导)。
涉及PIRAs的另外一种分析法在鉴定与PIRAs竟争与IR结合的分 子中具体体现，作为鉴定另外的IR结合剂和调节剂(拮抗剂或激动剂) 的手段。此种方法涉及竟争型测定，其中向包含IR的介质中添加一种 或多种PIRAs和一种或多种测试化合物，且在PIRA(s)的存在下评估 一种或多种测试化合物与IR结合且调节IR的能力。
在另外一个例子中，可以给哺乳动物(例如，关于人糖尿病疾病状 态的合适的模型动物)施用(或以其他方式递送)延长时间段的PIRA , 以便诱导胰岛素抵抗或糖尿病，从而提供涉及疾病的用于研究的新和有 用的体内才莫型，所述疾病包括但不限于糖尿病和肥胖。
示例性实验方法和数据
下述实验方法用于进 一 步举例说明本文描述的本发明方法，但当然 不应被解释为以任何方式限制其范围。("尸/W潜^游都定
为了鉴定作为拮抗剂的胰岛素受体结合肽(PIRA)，候选肽可以在 葡萄糖摄取测定中在例如SGBS细胞(人脂肪细胞细胞系)或原代啮齿 类动物脂肪细胞中进行测试。简言之，使细胞与各种浓度的胰岛素温育， 且随后测量"C-葡萄糖摄取。为了就拮抗剂性质测试肽，添加次最大的 刺激浓度的胰岛素(例如，导致半数最大胰岛素应答)以及待测试的肽 的系列稀释物。如果肽是PIRA,那么伴随浓度渐增的PIRA胰岛素诱导 的应答减少至或〗氐于基线应答，且PIRA的效力可以由 见察到应答减少 所需的PIRA浓度估计。PIRA S661的此种效力测定的例子显示于图1 中。此种测定可以应用于其他候选PIRAs作为鉴定PIRAs的方法，且在 此种测定中显示此种性质的PIRAs可以视为本发明的另 一个特征。
9组5或6只雄性、16周大、平均重量约580克的Zucker Obese大 鼠(Charles River)维持不限制Purina 5008和不限制饮用水，且对于实 验禁食过夜。葡萄糖水平在命名为S661 (上文描述)的PIRA施用前20 分钟和10分钟时进4于测试。
溶于PBS或载体的不同剂量S661的静脉内(i.v.)施用随后为(S661 使用后IO分钟)溶于PBS或载体的不同量人胰岛素的腹膜内(i.p.)施 用。在胰岛素注射后10、 20、 30、 40、 60、 80、 120和180分钟时测量 血糖水平。这些实验的结果显示于图2中。
如由图2中可见的，在其中施用S661的大鼠中，血糖水平明显高 于其中单独施用胰岛素或仅有载体的情况下(与对照相比较3 nmol/kg
S661, 30 nmol/kg胰岛素导致略微更高的葡萄糖水平，且导致比单独的 胰岛素明显更高的水平；在所有其他情况下，施用S661时血糖水平中 的差异明显不同)。
这个实-验证实PIRAs例如S661在减少哺乳动物受试者中的胰岛素 作用方面是有效的。
8组5-7只雄性、15周大、平均重量约550克的Zucker Obese大 鼠(Charles River)维持不限制Purina 5008和不限制饮用水，且对于实 验禁食过夜。在溶于PBS的30 nmol/kg人胰岛素i.p.施用前各个时间点 时以30 nmol/kg i.v.施用溶于PBS的PIRA S661 。这些实马全的结果显示于图3中。随着时间过去的血糖测量显示PIRAS661在施用后6小时仍是 有效的拮抗剂。
为了测试与相关受体IGF1受体相对PIRA S661对于胰岛素受体的 选择性，使用2种受体及其1251-标记的形式的同源配体进行竟争结合测 定。鉴于S661对于胰岛素受体具有的亲和力是人胰岛素自身那种的48 %,它对于IGF1受体的亲和力太低而无法测量，即，为IGF1的那种的 至少1/200.000。这些结果指出PIRA S661不会以任何方式干扰IGF1经 由IGF1受体的信号传导。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利都在此引 入作为参考，其程度与每个参考文献个别且特别指出引入作为参考且在 本文中整体阐述相同。
除非本文另有说明或上下文明显相矛盾，在本发明描述背景中术语 "一个(a)"和"一种(an)"和"该(the)"及类似指示物的使用应被解释为包含 单数和复数。
除非另有说明或上下文明显相矛盾，本发明的任何方面或实施方案 的本文说明书就一种或多种元件而言使用术语例如"包含"、"具有"、"包 括"或"含有"意欲提供关于"由那种具体的一种或多种元件组成"、"基本 上由那种具体的一种或多种元件组成"、或"基本上包含那种具体的一种 或多种元件"的本发明的类似方面或实施方案的支持(除非另有说明或 上下文明显相矛盾，例如本文描述为包含具体元件的组合物应当理解为 同样描述由那种元件组成的组合物)。
权利要求
1.一种包含氨基酸序列的肽胰岛素受体拮抗剂，所述氨基酸序列包含与Gly Ser Leu Asp Glu Ser Phe Tyr Asp Trp Phe Glu Arg Gln Leu Gly(SEQ ID NO1)具有至少约80％同一性的式1型序列，和根据式LeuXaa Xaa Glu Trp Ala Xaa Xaa Gln Cys Glu Val Xaa Gly Arg Gly Cys ProSer的式6型序列，其中Xaa表示任何氨基酸残基；所述式1型序列和式6型序列在所述氨基酸序列中以N至C末端的方向定位；和(a)所述氨基酸序列包含位于所述式1型和式6型序列之间的至少一个氨基酸残基的氨基酸序列接头，(b)所述氨基酸序列与增强所述胰岛素受体拮抗剂在体内的稳定性的末端衍生部分结合，或(c)所述氨基酸序列包含位于所述式1型和式6型序列之间的至少一个氨基酸残基的氨基酸序列接头，且所述氨基酸序列与增强所述胰岛素受体拮抗剂在体内的稳定性的末端衍生部分结合。
2. 权利要求1的胰岛素受体拮抗剂，其中所述式6序列不是 WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (SEQIDNO: 14)或 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS ( SEQIDNO: 15)。
3. 权利要求1或权利要求2的胰岛素受体拮抗剂，其中所述式1型 序列是GSLDESFYDWFERQLG ( SEQ ID NO: 1 )。
4. 权利要求1 -3中任一项的胰岛素受体拮抗剂，其中所述式6型 序列与SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY ( SEQ ID NO: 16 )至少约85 % 等同。
5. 权利要求4的胰岛素受体拮抗剂，其中所述式6型序列是 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (SEQIDNO: 16)。
6. 权利要求1-5中任一项的胰岛素受体拮抗剂，其中所述式6型 序列包含在式Leu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaa8 Xaa9 Gin Cys Glu Val Xaa14 Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa21 ( SEQ ID NO: 17 )内，其中Xaa3 是Asp或Glu; Xaa4是Cys、 Asp、 Glu、 His、 Lys、 Asn、 Gln、 Arg、 Ser 或Thr; Xaa8是任何氨基酸残基；Xaa9是Ile、 Leu、 Val、 Met、 Phe、 Gly或Ala; Xaaw是Trp、 Phe或Tyr;和Xaa^不存在或选自Ser、 Thr、 Asn、 Gln、 Tyr、 Cys或Gly。
7. 权利要求1 - 5中任一项的胰岛素受体拮抗剂，其中所述式6型序列包含在式Xaa山eu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaa8 Xaa9 Gin Cys Glu Val Xaa14 Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa21 ( SEQ ID NO: 18 )内，其中Xaa! 是Trp或Ser， Xaa3是Glu或Asp; Xaa4是Glu或Gin; Xaa8是Gin或Trp; Xaa9是lie或Val; Xaai4是Trp或Tyr;和Xaa21不存在或是Tyr(式6b )。
8.权利要求1 -2和4-7中任一项的胰岛素受体拮抗剂，其中所述
9.权利要求1 - 8中任一项的胰岛素受体拮抗剂，其中所述氨基酸 序列进一步包含位于所述式1型序列和式6型序列之间1 -7个氨基酸 残基的氨基酸接头。
10. 权利要求9的胰岛素受体拮抗剂，其中形成所述接头的大部分 残基是Gly或Ser残基。
11. 权利要求1 - 10中任一项的胰岛素受体拮抗剂，其中所述胰岛 素受体拮抗剂包含末端衍生部分。
12. 权利要求11的胰岛素受体拮抗剂，其中所述末端衍生部分包含 酰胺衍生的氨基酸残基，所述氨基酸残基形成所述式6型序列的C末端 或位于所述式6型序列的C末端的C末端。
13. —种包含根据所述式 GSLDESFYDWFERQL國Z!國SLEEEWAQIQCEVWGRGCPS國Z2 ( SEQ ID NO: 20)的氨基酸序列的胰岛素受体拮抗剂，其中Z!表示氨基酸接头且Z2表 示任选存在的末端衍生部分、氨基酸或氨基酸序列、衍生的氨基酸残基、 或包含C末端衍生氨基酸残基的氨基酸序列。
14. 一种胰岛素受体拮抗剂，其包含化合物S661胺)。
15. —种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1 - 14中 任一项的胰岛素受体拮抗剂。
16. 根据权利要求15的组合物，其中所述组合物配制用于皮下注 射、经口递送或肺递送。
17. —种减少哺乳动物细胞中的胰岛素受体活性的方法，其包括给 所述细胞递送生理学有效量的根据权利要求1 - 14中任一项的胰岛素受 体拮抗剂，以便减少胰岛素受体活性。
18. —种治疗受试者中的高胰岛素血症的方法，其包括给所述受试者递送治疗有效量的根据权利要求1-14中任一项的胰岛素受体拮抗剂，以便治疗高胰岛素血症。
19. 一种预防或改善受试者中的高胰岛素血症相关的低血糖症的方 法，其包括给所述受试者递送治疗有效量的根据权利要求1 - 14中任一 项的胰岛素受体拮抗剂。
20. 根据权利要求1 - 14中任一项的胰岛素受体拮抗剂在生产治疗 高胰岛素血症或高胰岛素血症相关状况的药物中的用途。
全文摘要
提供了新肽胰岛素受体拮抗剂(PIRAs)以及相关化合物和组合物。还提供了PIRAs的新用途和获得PIRAs的方法。
文档编号C07K14/62GK101321780SQ200680045601
公开日2008年12月10日 申请日期2006年10月3日 优先权日2005年10月5日
发明者C·L·布兰德, J·斯图里斯, L·沙弗, U·里贝尔 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司