单异羟肟酯酯的钒络合物和含其的药用组合物的制作方法

专利名称：：单异羟肟酯酯的钒络合物和含其的药用组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及单异羟肟酸酯的钒络合物和可用于治疗糖尿病的含单异羟肟酸酯的钒络合物的药用组合物。缩写Asp(β)HXM，L-天冬氨酸β-单异羟肟酸酯；CytPTK，胞质蛋白-酪氨酸激酶；Glu(γ)HXM，L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯；HXM，单异羟肟酸酯；InsTRK，胰岛素受体酪氨酸激酶；IRS-1，胰岛素受体底物1；PTK，蛋白酪氨酸激酶；KRB，KrebsRinger碳酸氢盐；NaVO3，偏钒酸钠；STZ，streptozocin；VOSO4，硫酸氧钒；VOCl2，氯化氧钒。
背景技术：
：在最近20年内，对钒的胰岛素模拟效应进行了充分的研究(在Shechter等，1995中进行了综述)。在体外，钒盐模拟胰岛素对该激素主要靶组织的大多数效应，在体内，它们诱导血糖量正常，并改善胰岛素缺乏和胰岛素抗性糖尿病啮齿动物的葡萄糖体内平衡(在Brichard和Henquin，1995中进行了综述)。在基础研究的前沿，继续积累的数据表面，钒盐通过替代途径表现出胰岛素样代谢效应，所述替代途径不涉及胰岛素受体酪氨酸激酶的激活，也不涉及胰岛素受体底物1(IRS-1)的磷酸化。该后备系统的主要参与者看来涉及蛋白-磷酸酪氨酸磷酸酶的抑制和非受体蛋白酪氨酸激酶的激活(在Brichard和Henquin，1995中进行了综述)。在哺乳动物中，钒是超微量元素。膳食摄入在10-60μg／天之间变化，细胞内的浓度约为20nM(在Shechter等，1995以及Brichard和Henquin，1995中进行了综述)。大部分胞内钒可能为氧钒基(+4)形式。急性口服钒化合物证明有中等毒性。然而，口服钒疗法在胰岛素缺乏和胰岛素抗性糖尿病啮齿动物中的广泛的抗糖尿病效应(在Brichard和Henquin，1995中进行了综述)鼓舞人们开始临床研究。小剂量的钒(100-125mg／人／天，3周的时间)是允许的，尽管这低于大多数动物研究中所用浓度的10倍，但观察到几种有益效应(Cohen等，1995)。在促进胰岛素在体外(Li等，1996)和在体内在STZ大鼠中(Skurai等，1995)的代谢效应方面，有机螯合的钒(+4)络合物的效力比游离钒(+4)高5倍以上。其理论基础仍在研究中，这可能是将更具效力的胰岛素样钒种类稳定化的结果。钒盐在体外通过替代的非胰岛素依赖性机制组分模拟胰岛素的代谢效应，在糖尿病啮齿动物体内可以消除胰岛素抗性状态。因此，钒疗法可以成为胰岛素疗法的有用的、有吸引力的补充方法，只要钒盐的毒性较低，或可以进行某些操作，以不用过量的外源钒源或用减少量的外源钒源进行钒疗法。Israel的专利第99666号和相同申请人的相应的美国专利5，338，759号，描述了下式的二异羟肟酸酯的氧钒基络合物R2R3C｛CH2O(CH2)mCO[NHCHR(CH2)qCO]nNOHR1｝2该络合物被认为可用于治疗糖尿病，但本发明人后来发现，在体内不适用于在糖尿病大鼠模型中使血液葡萄糖水平正常化。表明异羟肟酸衍生物参与铁的微生物转运，因此提示可用于治疗铁缺乏病症。它们也是脲酶活性的抑制剂，表明可用于治疗肝昏迷。其大多数生物活性涉及其螯合多种金属的效力。在大多数异羟肟酸形成的金属螯合物中，通过将OH基团去质子化，并且随后(O，O)与羰基氧和去质子化的OH配位，发生配位。氨基酸单异羟肟酸酯是简单的氨基酸无毒衍生物。表明D-天冬氨酸β-异羟肟酸酯(D-Asp(β)HXM)在体内和体外均对鼠白血病L5178Y具有抗肿瘤活性，在体外具有抗Friend白血病细胞活性(Toumaire等，1994)。L-谷氨酸(γ)-单异羟肟酸酯(Glu(γ)HXM)在体外对白血病L1210细胞有细胞毒性，在体内对白血病L1210和黑素瘤B16细胞有细胞毒性(Vila等，1990)。发明概述按照本发明，现已发现，某些氨基酸单异羟肟酸酯(HXM)、特别是L形式的谷氨酸γ-单异羟肟酸酯(Glu(γ)HXM)和天冬氨酸β-异羟肟酸酯(D-Asp(β)HXM)，与钒(+4)和钒(+5)相互作用。在1∶1或2∶1HXM∶钒摩尔化学计量下，它们在体外主要增强钒(+4)和(+5)的胰岛素模拟效力，而在体内使streptozocin处理的大鼠的血液葡萄糖水平正常化。本发明涉及式(Ⅰ)的单异羟肟酸酯的新的钒络合物R-CO-NHOH．X(Ⅰ)其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；其中n为1、2或3，而Y为OH或NH2；X为选自氧钒基(VO2+)、偏钒酸(VO3-)或钒酸(VO43+)盐的钒化合物。按照本发明，在以上(ⅰ)的单异羟肟酸酯中，n优选为1或2，即分别为L-天冬氨酸和L-谷氨酸的β-和γ-单异羟肟酸酯。在最优选的实施方案中，所述氨基酸单异羟肟酸酯为Glu(γ)HXM，发现它与各种α-氨基酸单异羟肟酸酯相比，在大鼠脂肪细胞中胰岛素代谢效应的表现中最有效。非常有趣的是，在文献中公开的所有已知钒螯合剂中，诸如乙酰丙酮化物、bispicolinato和上述US5，338，759中描述的二异羟肟酸酯RL-252，在缺乏外部加入的钒的情况下，氨基酸单异羟肟酸酯在其体外产生胰岛素效应的能力方面是独特的，表明氨基酸单异羟肟酸酯可能能够将微小量的位于胞内的钒(+4，～20nM)转换为胰岛素模拟活性的种类。进一步的体外研究表明，Glu(γ)HXM促进所有的胰岛素生理相关生物效应。这些包括己糖摄入的激活和对异丙基肾上腺素介导的脂解的抑制。相当重要的是，由Glu(γ)HXM引起的激活对于饱和浓度的胰岛素产生的最大效应为加性的。在以上(ⅲ)的单异羟肟酸酯中，优选3-吡啶基，即烟酸异羟肟酸酯、2-或3-哌啶基和3-四氢异喹喔啉基。用于本发明的单异羟肟酸酯可溶于水，相比之下，上述US5，338，759的二异羟肟酸酯是水不溶性的。因此，通过将单异羟肟酸酯和所述钒盐简单地溶于水，制备本发明的钒络合物。用于形成本发明组合物中所用的络合物中的钒盐实例为但不限于VOCl2(+4)、VOSO4(+4)、NaVO3(+5)和Na3VO4(+5)。本发明设计了所述络合物的各种HXM∶钒盐化学计量摩尔比，但优选1∶1和2HXM∶1钒盐的摩尔比。通过将所述单异羟肟酸酯和所述钒盐的水溶液混合，冷冻并冻干所述溶液，由此获得可以例如于室温下贮存的干粉，可以制备本发明的式Ⅰ络合物。本发明还提供可用于治疗糖尿病、特别是在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和诱导血糖量正常的药用组合物，包含作为活性组分的式(Ⅰ)的单异羟肟酸酯的钒络合物和可任选的药学上可接受的载体。所述组合物可以用于治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。给予的剂量将取决于糖尿病患者的病况，剂量范围可以为每日0．2mg／kg至2mg／kg。因为在目前的临床试验中，容许用于糖尿病患者的钒剂量约为2mg／kg／天，所以本发明提供的最小量代表增加10倍的效力。包含式Ⅰ的钒络合物的本发明组合物以可溶性形式存在，诸如滴剂或胶囊或片剂形式，最好口服。可以将它们单独给予或与胰岛素联合给予。式Ⅰ的钒络合物也可以通过分别给予所述钒盐和所述单异羟肟酸酯在体内产生。本发明因此还包括包含以下药用组合物的药物包装药用组合物，包含式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯，其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)m-；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；n为1、2或3，而Y为OH或NH2；和药用组合物，包含选自氧钒基(VO2+)、偏钒酸(VO3-)或钒酸(VO43+)盐的钒化合物，并含有如何使用它们的说明书。包含所述钒盐的组合物最好在所述单异羟肟酸酯组合物之前给予。所述两种组分也可以由非透性膜分开，包含在单一组合物的一个区室内，例如在胶囊中。由于上式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯、特别是Glu(γ)HXM，本身可以结合内源胞内钒，将后者修饰为激发胰岛素代谢应答的活性种类，本发明还设想用于治疗糖尿病的药用组合物，包含式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯，其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；而n为1、2或3，Y为OH或NH2。本发明还涉及式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯用于制备治疗糖尿病的药用组合物的用途，其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；而n为1、2或3，Y为OH或NH2。在另一实施方案中，本发明涉及降低糖尿病患者血液葡萄糖水平的方法，所述方法包括单独或联合胰岛素治疗给予所述患者有效量的本文式(Ⅰ)的单异羟肟酸酯钒络合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯和选自氧钒基(VO2+)、偏钒酸(VO3-)或钒酸(VO43+)盐的钒化合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯。在再一实施方案中，本发明涉及诱导糖尿病患者血糖量正常的方法，所述方法包括单独或联合胰岛素治疗给予所述患者有效量的本文式(Ⅰ)的单异羟肟酸酯钒络合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯和选自氧钒基(VO2+)、偏钒酸(VO3-)或钒酸(VO43+)盐的钒化合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯。附图简述图1显示与游离VOCl2和游离Glu(γ)HXM相比，1∶1-1∶5的Glu(γ)HXM∶VOCl2络合物对脂肪生成的浓度依赖性激活。图2显示与游离VOCl2相比，1∶1的Glu(γ)HXM∶VOCl2(+4)络合物增强钒在STZ大鼠中的血糖量正常效应。图3显示Glu(γ)HXM∶NaVO3(1∶1络合物)、游离NaVO3和游离Glu(γ)HXM对脂肪生成的浓度依赖性激活。图4显示游离Glu(γ)HXM、游离NaVO3和2∶1的Glu(γ)HXM∶NaVO3络合物在两种不同浓度下刺激己糖流入。图5显示与游离Glu(γ)HXM和游离NaVO3相比，G1u(γ)HXM∶NaVO3(2∶1络合物)降低STZ处理的大鼠的血液葡萄糖水平。图6显示游离Glu(γ)HXM在缺乏外部加入钒的情况下，激活大鼠脂肪细胞中的脂肪生成。图7显示在星形孢菌素浓度增加下，由或者游离Glu(γ)HDXM、游离NaVO3或胰岛素激发的脂肪生成程度。图8显示在正常的脂肪细胞和富集钒的脂肪细胞中由浓度增加的游离Glu(γ)HXM激发的脂肪生成激活的比较。图9显示于室温下贮存的游离Glu(γ)HXM、VOCl2和NaVO3以及Glu(γ)HXM∶VOCl2和Glu(γ)HXM∶NaVO32∶1络合物的干粉的脂肪生成能力的比较。优选实施方案的描述按照本发明，用钒的某些单异羟肟酸酯络合剂达到独特和特异性地增强钒的胰岛素模拟效力。具体地说，L-谷氨酸(γ)单异羟肟酸酯(Glu(γ)HXM)在钒(+5)激活大鼠脂肪细胞葡萄糖代谢方面增强约7-10倍，将钒在STZ处理的糖尿病大鼠中体内降低血液葡萄糖水平方面的效力提高5-7倍。在2∶1的L-Glu(γ)HXM∶钒摩尔比下，增强最大。L-Glu(γ)HXM未修饰的α-氨基部分和α-羧基部分是所述增强作用必需的。此外，L-Glu(γ)HXM的协同作用是立体特异性的，不因D-Glu(γ)HXM增强，尽管后者也与钒络合。非常有趣的是，在所有文献记载的增强钒胰岛素模拟作用的钒络合剂中，在缺乏外部加入钒的情况下，在激活大鼠脂肪细胞脂肪生成方面L-Glu(γ)HXM也是独特的。本文通过实验数据还确立，这种效应通过钒途径表现，表明L-Glu(γ)HXM能够将大鼠脂肪细胞中生理上微小量的内源存在的钒转换为胰岛素模拟活性种类。对该活性络合物的化学物理研究显示出独特的物理化学特征。钒在生理pH值下维持+5氧化状态，如果用氧钒基+4阳离子制备，也处于平衡。本发明所用的体外筛选测定表明，除Glu(γ)HXM外，L-Asp(β)HXM和烟酸-HXM(1∶1的摩尔比)也增强钒(+4)的胰岛素模拟效力。其协同效应约为85％，Glu(γ)HXM施加的协同效应约为57％。相反，α-氨基酸异羟肟酸酯以及Glu(γ)HXM和Glu(γ)HXM的D-异构体不增强的VOCl2胰岛素模拟效力。现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。实验步骤(a)材料。D-[U-14C]葡萄糖和2-脱氧-D-[G-3H]葡萄糖购自NewEnglandNuclear(BostonMA)。I型胶原酶(134U／mg)得自WorthingtonBiochemicals(Freehold，NJ)。猪胰岛素购自EliLillyCo．(Indianapolis，IN)。根皮素、2脱氧葡萄糖、L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯(Glu(γ)HXM)、甘氨酸异羟肟酸酯(Gly-HXM)、L-异亮氨酸异羟肟酸酯(isoleu-HXM)、L-色氨酸异羟肟酸酯(Trp-HXM)、L-酪氨酸异羟肟酸酯(Tyr-HXM)和L-胱氨酸二异羟肟酸酯(胱氨酸(HXM2)购自SigmaChemicalCo．，St．Louis，MO。Krebs-Ringer碳酸氢盐(KRB)缓冲液(pH7．4)含有110mMNaCl、25mMNaHCO3、5mMKCl、1．2mMKH2PO4、1．3mMCaCl2、1．3mMMgSO4。用于该研究的所有其它化学药品和试剂均为分析级。(b)Streptozocin(STZ)处理的大鼠通过单次静脉内注射新鲜制备的streptozocin(55mg／kg体重)的0．1M柠檬酸缓冲液(pH4．5)溶液，诱导糖尿病。在诱导糖尿病后14天，测定测试化合物对血液葡萄糖水平的效应。(c)细胞制备和脂肪生成的生物测定基本上通过Rodbell，1964的方法制备大鼠脂肪细胞。将雄性Wistar大鼠的颊脂垫用剪刀切为小片，悬浮于3mlKRB缓冲液。在25ml挠性塑料瓶中，在卡波金氛围(95％O2，5％CO2)下，于37℃用胶原酶(1型，134单位／mg；1mg／ml)在剧烈搅拌下消化40分钟。消化后至少3小时，根据锥虫蓝排除，表明细胞制剂的存活率高于95％。然后加入5ml缓冲液，使细胞通过网筛。然后让细胞于室温下在塑料试管中静置数分钟，飘浮，并去除下面的缓冲液。重复该步骤(悬浮、飘浮和去除下面的缓冲液)3次。在脂肪生成测定中，为了测定葡萄糖的摄入及其向脂质中的掺入(脂肪生成)，将脂肪细胞悬液(3×105细胞／ml)分装到塑料管制瓶(0．5ml／管制瓶)中，在或者缺乏或者存在胰岛素(100ng／ml)的情况下，在卡波金氛围下，于37℃与0．2mM[U-14C]葡萄糖(4-7mCi／mol)和测试络合物一起孵育60分钟。加入基于甲苯的闪烁液(1．0ml／管制瓶)终止脂肪生成，并对所提取的脂质的放射活性进行计数(Moody等，1974)。在一个典型试验中，胰岛素刺激的脂肪生成高于基础4-5倍。V基础≈2000cpm／3×105／h；V胰岛素≈8，000-10，000cpm／3×105／h。实施例实施例1．等摩尔浓度的单异羟肟酸酯体外增强低浓度VOCl2(10mM)的脂肪生成能力。发现以下方案在体外是一个可靠的测定，它是STZ-大鼠体内所述氨基酸单异羟肟酸酯对钒(+4)增强作用的指标。如试验步骤(c)小节中所述，用10μM不同的游离氨基酸单异羟肟酸酯(HXM)溶液、10μMVOCl2(+4)溶液或10μM新鲜制备的氨基酸-HXM∶VOCl2的1∶1络合物溶液，进行脂肪生成的激活。测试以下氨基酸单异羟肟酸酯L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯(Glu(γ)HXM)、甘氨酸异羟肟酸酯(Gly-HXM)、L-异亮氨酸异羟肟酸酯(Ile-HXM)、L-色氨酸异羟肟酸酯(Trp-HXM)、L-酪氨酸异羟肟酸酯(Tyr-HXM)、L-胱氨酸二异羟肟酸酯(Cys(HXM2)、L-赖氨酸异羟肟酸酯(Lys-HXM)、烟酸异羟肟酸酯(Nic-HXM)、L-精氨酸异羟肟酸酯(Arg-HXM)、L-组氨酸异羟肟酸酯(His-HXM)、D-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯[D-Glu(γ)HXM]、N-乙酰-L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯[N-乙酰-Glu(γ)HXM]、L-天冬氨酸β-单异羟肟酸酯[Asp(β)HXM]、氨基丁酸单异羟肟酸酯[Aib-HXM]。表Ⅰ和表Ⅱ总结了所述结果。如表1所示，Glu(γ)HXM(10μM)、VOCl2(10mm)或其1∶1的络合物分别产生22％、40％和117％的最大胰岛素应答。因此净增强效应为51％。Nic-HXM也增强VOCl2的脂肪生成能力(表Ⅰ中的净增强效应为29％)。研究的其它氨基酸异羟肟酸酯不增强钒(+4)的效应。这同样适用于D-Glu(γ)HXM和N-乙酰-Glu(γ)HXM，表明Glu(γ)HXM、游离α-氨基和L-异构体形式是增强所必需的。表Ⅰ．等摩尔浓度的氨基酸单异羟肟酸酯增强低浓度VOCl2(10μM)的脂肪生成能力胰岛素最大效应的百分率<tablesid="table1"num="001"><table>仅氨基酸-HXM(10μM)仅VOCl2(10μM)VOCl2∶HXM1∶1(10μM)净增强效应(％)Glu(γ)HXM22％40％117％51％Nic-HXM11％40％80％29％Aib-HXM0％(-3％)40％22％0Lys-HXM0％(-4％)40％36％0D-Glu(γ)HXM1％40％17％0N-乙酰Glu(γ)HXM0％40％24％0L-Asp(β)HXM8％11％73％54％Arg-HXM4％11％17％～2％Trp-HXM2％11％22％～9％His-HXM4％11％18％～3％</table></tables>表Ⅱ．与L-Glu(γ)HXM∶VOCl2(1∶1)相比，各种VOCl2∶HXM(1∶1)的胰岛素模拟效应VOCl2的1∶1络合物和∶相对Glu(γ)HXMVOCl2的活性％L-Glu(γ)HXM100％L-Asp(β)HXM，Nic-HXM70％D-Glu(γ)HXM，N-乙酰Glu(γ)HXM，D-Asp(β)HXM0％Aib-HXM，Lys-HXM，Arg-HXM，Trp-HXM，His-HXM实施例2．与游离VOCl2和游离Glu(γ)HXM相比，Glu(γ)HXMVOCl2的1∶1至1∶5络合物浓度依赖性地体外激活脂肪生成。为了测定Glu(γ)HXM∶VOCl2络合物协同钒胰岛素模拟效力的最有效的比率，如试验步骤(c)小节所述，用Glu(γ)HXM∶VOCl2的1∶1至5∶1络合物、游离VOCl2和游离Glu(γ)HXM，进行脂肪生成。图1所示的结果表明，与单独的5mMVOCl2和与浓度增加的Glu(γ)HXM(5-25μM)络合的VOCl2的脂肪生成效力相比，发现这两者1∶1化学计量的络合物最有效地协同钒(+4)的胰岛素模拟效力。实施例3．Glu(γ)HXM∶VOCl2(1∶1络合物)对STZ-大鼠的血液葡萄糖水平(BGL)的效应；与单独的低浓度VOCl2比较。为了表明钒(+4)氨基酸单异羟肟酸酯螯合剂体内增强钒的血糖量正常效应，给STZ-大鼠(参见试验步骤(b)小节)腹膜内注射或者VOCl2(0．02mmol／kg／天)或VOCl2∶Glu(γ)HXM1∶1络合物(0．02mmol／kg／天)。在12天内测定血液葡萄糖水平。结果描述于图2，表明每日腹膜内注射低剂量的VOCl2本身(约2mg钒／kg／天)对降低血液葡萄糖水平没有显著效应，而Glu(γ)HXM∶VOCl2的1∶1络合物(约1mg／kg／天)有效，并在STZ-大鼠中导致显著降低血液葡萄糖水平趋向正常值。在给予所述络合物后2天之内已经达到稳定的血糖量正常，并且在给予后持续数天(图2，虚线代表对照健康大鼠的血液葡萄糖水平)。诱导血糖量正常所需的游离钒(+4)量为9．3mg／kg／天(腹膜内给予)。Glu(γ)HXM∶VOCl2络合物(1∶1)将日剂量降至约1mg／kg／天(腹膜内给予)。因此，在该体内STZ-大鼠模型中，钒(+4)与Glu(γ)HXM的络合看来增强钒(+4)约9倍。实施例4．单异羟肟酸酯也协同钒(+5)L-Glu(γ)HXM的胰岛素模拟效力，高度增强钒(+5)对大鼠脂肪细胞葡萄糖代静的激活。为了测试Glu(γ)HXM与钒(+5)络合时的协同效应，如试验步骤(c)小节所述，分别用浓度范围为10μM-50μM的Glu(γ)HXM∶VO4+3(+5)1∶1络合物、游离的Na3VO4和游离的Glu(γ)HXM，进行脂肪生成。与US5，338．759中所述命名为RL-252的二异羟肟酸酯不同，Glu(γ)HXM显著增强钒(+5)的胰岛素样效应(图3)，而发现RL-252增强钒(+4)的胰岛素模拟能力，但对钒(+5)体外效力不产生影响，并且甚至降低其效力。与或者游离的Na3VO4或游离的G1u(γ)HXM相比，估计Glu(γ)HXM∶VO4+3(+5)激活脂肪生成的效力高至少7倍。实施例5．Glu(γ)HXM和-Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)络合物刺激己糖的流入。为了测试游离Glu(γ)HXM和Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)络合物对葡萄糖进入细胞的特异性效应，用2-脱氧-D-[6-3H]葡萄糖(2-DG)进行体外测定。2-DG是一种葡萄糖的非代谢类似物，因此该测定代表化合物对葡萄糖流入细胞的影响，与葡萄糖代谢无关。在缺乏和存在胰岛素(17nM)和指定浓度(20和40μM)Glu(γ)HXM、Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)络合物和NaVO3的情况下，将新鲜制备的悬浮于含1．0％BSA的KRB缓冲液pH7．4中的脂肪细胞(3×105细胞／ml)预孵育30分钟。将等份(70μl)的上述样品转移到含2-脱氧-D-[6-3H]葡萄糖(0．1mM终浓度)的试管中。3分钟后，加入根皮素(0．1nM)以终止2-DG渗透入细胞。然后将悬浮细胞样品转移至具有硅油的试管中，当离心时，细胞与KRB培养基和余下的2-DG分离。如图4所示，发现游离的Glu(γ)HXM和Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)络合物激活葡萄糖进入细胞，而与葡萄糖代谢无关。效应的大小总计分别为约最大胰岛素应答的60％和120％。实施例6．Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)络合物降低STZ处理大鼠的血液葡萄糖水平。为了表明钒(+5)和单异羟肟酸酯螯合剂的络合物增强钒体内的血糖量正常效应，并测试游离Glu(γ)HXM体内的血糖量正常效应，将STZ糖尿病大鼠分为4组，每组4-5只大鼠∶糖尿病对照大鼠；钒(+5)处理的大鼠；Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)络合物处理的大鼠；和游离Glu(γ)HXM处理的大鼠。每组每日接受腹膜内注射0．05mmol／kg(于11．00a．m．)相应化合物。如图5所示，第一天(于8．00a．m．测定血液葡萄糖水平)后，所述络合物处理组的血液葡萄糖水平降至正常水平。实施例7．Glu(γ)HXM在缺乏外部加入钒的情况下激活大鼠脂肪细胞的脂肪生成。为了研究游离Glu(γ)HXM的血糖量正常的潜力，如上所述，用浓度范围为10-100μM的Glu(γ)HXM进行脂肪生成。如图6所示，在本文测试的所有钒结合剂中，Glu(γ)HXM在缺乏外部加入钒的情况下产生胰岛素效应的能力是特有的。设想在能够将微小量的位于胞内的钒(～20nM)转化为胰岛素模拟活性种类方面，L-Glu(γ)HXM不同于所有其它氨基酸-HXM。实施例8．星形孢菌素抑制Glu(γ)HXM激发的大鼠脂肪细胞的脂肪生成。与星形孢菌素对胰岛素和钒激发的脂肪生成的效应比较。星形孢菌素是一种大鼠脂肪细胞CytPTK(ki～2nM)的有效抑制剂和InsRTK(Ki～1μM)的弱抑制剂，它优先抑制钒刺激脂肪生成的效应。为了确定游离Glu(γ)HXM是否也通过钒途径起作用，于37℃使脂肪细胞经受各种浓度的星形孢菌素(如图7所示)处理30分钟。然后，用如上所述制备的脂肪细胞，在存在胰岛素(17nM)、偏钒酸钠(0．8mM)或Glu(γ)HXM(100μM)的情况下，进行脂肪生成。在缺乏星形孢菌素的情况下，最大激活(100％)为用胰岛素、钒酸盐或Glu(γ)HXM获得的激活。图7显示在浓度增加的星形孢菌素下由游离Glu(γ)HXM、偏钒酸钠或胰岛素激发的脂肪生成程度。Glu(γ)HXM的脂肪生成激活被星形孢菌素以剂量依赖性方式抑制。所述抑制曲线类似钒酸盐(非胰岛素)激发的脂肪生成获得的抑制曲线，表明游离的Glu(γ)HXM通过钒(非胰岛素依赖性)途径起作用。实施例9．脂肪生成用Glu(γ)HXM处理的正常脂肪细胞和钒富集的脂肪细胞之间的比较。在缺乏外部加入钒的情况下，在激活大鼠脂肪细胞脂肪生成方面，游离Glu(γ)HXM是独特的。本文通过试验数据确立，该效应通过钒途径表现，表明游离Glu(γ)HXM能够将大鼠脂肪细胞中生理微小量的内源存在的钒转换为胰岛素模拟活性种类。为了证实这种效应，雄性Wistar大鼠每日接受皮下注射NaVO3(12mg／kg／天)5天(此后称为“富集钒的大鼠”。如上所述，用游离Glu(γ)HXM进行脂肪生成，以比较从非富集钒的大鼠与富集钒的大鼠新鲜制备的大鼠脂肪细胞。如图8所示，发现游离Glu(γ)HXM在富集钒的大鼠中，在高得多的程度上增强胞内钒的效应。实施例10．Glu(γ)HXM钒络合物是稳定的。为了表明当作为干粉于室温下保持时，在较长时间内Glu(γ)HXM与NaVO3和VOCl2形成保留高度活性的稳定络合物，通过分别将所述单异羟肟酸酯和所述钒盐以2∶1等摩尔浓度溶于水中，制备的Glu(γ)HXM∶NaVO3和Glu(γ)HXM∶VOCl2的2∶1络合物。然后将水溶液混合，用液氮冷冻并冻干。让获得的干粉于室温下静置4周。然后如上所述，用游离Glu(γ)HXM、NaVO3和VOCl2以及作为干粉的Glu(γ)HXM∶NaVO3和Glu(γ)HXM∶VOCl2的2∶1络合物进行脂肪生成。如图9所示，两种络合物均保持其胰岛素模拟活性水平，表明它们是稳定的。参考文献Brichard，S．M．和Henquin，J．C．(1995)TrendsinPharmacol．Sci．16，265-270．Brown，D．A．，R．A．Coogan，N．J．Fitzpatrick，W．K．Glass，D．E．Abukshima，L．Shiels，M．Ahlgren，K．Smolander，T．t．Pakkanen，T．A．Pakkanen和M．Perakyla(1996)J．Chem．Soc．，PerkinTrans．2，2673-2679．Cohen，N．，Halberstam．M．，Shomovich，P．，Chang，C．R．，Shamoon，H．和Rossetti，L．(1995)J．Clin．Invest．95，2051-2509．Li，J．，Elberg，G．，Crans，D．C．和Shechter，Y．(1996)Biochemistry35，8314-8318．Moody，A，Sta，M．A．，Stan，M．和Glimann，J．(1974)Horm．Metab．Res．6，12-16．Rodbell，M(1964)J．Biol．Chem．239，375-80．Sakurai等(1995)BBRC，214，1095-1101．Shechter，Y．，ShishevaA．，Lazar，R．，Libman，J．和Shanzer，A．(1992)Biochemistry31，2063-68．Shechter，Y．，Li，J．，Meyerovitch，J．，Gefel，D．，Bruck，R．，Elberg，G．，Miller，D．S．和Shisheva，A．，(1995)Molec．Cell．Biochem．153，39-47．Tournaire，R．，S．Malley，F．Hamedi-Sangsari，N．Thomasset，J．Grange，J．F．Dore和J．Vila，(1994)Int．J．Cancer58，420-425．Vila，J．，N．Thomasset，C．Navarro和J．F．Dore(1990)Int．J．Cancer45，737-74权利要求1．式(Ⅰ)的单异羟肟酸酯钒络合物R-CO-NHOH．X(Ⅰ)其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-其中n为1、2或3，而Y为OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；而X为选自氧钒基(VO2+)、偏钒酸(VO3-)或钒酸(VO43+)盐的钒化合物。2．按照权利要求1的下式的L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯的1∶1或2∶1氧钒基络合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。3．按照权利要求1的下式的L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯的1∶1或2∶1钒酸盐络合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶NaVO3。4．按照权利要求1的下式的L-天冬氨酸β-单异羟肟酸酯的氧钒基络合物H2N-CH(COOH)-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。5．按照权利要求1的下式的烟酸异羟肟酸酯的氧钒基络合物吡啶基-3-CO-NHOH∶VOCl2。6．药用组合物，包含活性组分的有效量的权利要求1-5中任一项要求保护的单异羟肟酸酯钒络合物和可任选的药学上可接受的载体。7．按照权利要求6的药用组合物，它可用于降低糖尿病患者的血液葡萄糖水平和／或诱导血糖量正常。8．按照权利要求7的适用于口服形式的药用组合物。9．治疗糖尿病的药用组合物，包含选自的氧钒基、偏钒酸盐和钒酸盐的钒化合物和式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯，其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n为1、2或3，而Y为OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；其中所述钒盐和所述单异羟肟酸酯在所述组合物中相互分离。10．具有两个区室的药物包装，第一个区室包含选自氧钒基、偏钒酸盐和钒酸盐钒化合物，而第二个区室包含式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯，其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n为1、2或3，而Y为OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；以及如何将其给予以在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或诱导血糖量正常的说明书。11．权利要求1-5中任一项要求保护的单异羟肟酸酯钒络合物的用途，用于制备可用于在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或诱导血糖量正常的药用组合物。12．式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯的用途，其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n为1、2或3，而Y为OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；用于制备可用于在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或诱导血糖量正常的药用组合物。13．在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或诱导血糖量正常的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的式(Ⅰ)的单异羟肟酸酯钒络合物R-CO-NHOH．X(Ⅰ)其中R为选自以下的残基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-其中n为1、2或3，而Y为OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基；而X为选自氧钒基(VO2+)、偏钒酸(VO3-)和钒酸(VO43+)盐的钒化合物。14．按照权利要求13的方法，其中所述钒络合物为下式的L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯的1∶1或2∶1氧钒基络合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。15．按照权利要求13的方法，其中所述钒络合物为下式的L-谷氨酸γ-单异羟肟酸酯的1∶1或2∶1钒酸盐络合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶NaVO3。16．按照权利要求13的方法，其中所述钒络合物为下式的β-天冬氨酸单异羟肟酸酯的氧钒基络合物H2N-CH(COOH)-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。17．在糖尿病患者中诱导血糖量正常和／或降低血液葡萄糖水平的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的选自氧钒基、偏钒酸盐和钒酸盐的钒化合物和给予有效量的式R-CO-NHOH的单异羟肟酸酯，其中R为选自以下的残基(i)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n为1、2或3，而Y为OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氢异喹喔啉基。18．按照权利要求17的方法，其中所述钒化合物在所述异羟肟酸酯化合物之前给予。19．按照权利要求13-18中任一项的方法，其中所述钒络合物口服给予。20．按照权利要求13-18中任一项的方法，其中所述治疗联合给予胰岛素。全文摘要式(Ⅰ):R－CO－NHOH.X的单异羟肟酸酯钒络合物,其中R为选自以下的残基:(i)H文档编号C07C323/60GK1278785SQ98810940公开日2001年1月3日申请日期1998年9月10日优先权日1997年9月11日发明者Y·谢克特尔,M·弗里德金,I·格尔德瓦泽,E·格尔肖诺夫申请人:耶达研究及发展有限公司