产生物铁载体化合物的fedt-866真菌菌株及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物工程，涉及塔宾曲霉（AspergiWiAS1 )菌株及其制 备生物铁载体的方法。
【背景技术】
[0002] 铁离子对于生命体维持细胞内多种酶的活性必不可少，但在自然界，铁大多是 不溶解的氧化铁或氢氧化铁，生物可利用性极低。上世纪50年代，人们发现微生物中 存在一种对Fe3+有极高亲和性的小分子化合物，其分子量界于500~1500 Da，命名为 铁载体（Siderophore)，该类化合物存在于绝大部分类型的微生物中，但含量稀少。目 前已知的铁载体化合物约500种，根据其配位结构的特征，分为四种类型：异羟肟酸型 (hydroxamaces)、儿茶酸型（catecholates)、駿酸盐型（carboxylates)和混合型。研 究显示，铁载体类化合物并非仅亲和Fe3+，还可螯合锰、锌，甚至对生物体具有毒性的铅、 汞、铬以及镉等重金属离子。因此，它在生物医药、农业、环境修复等领域具有广泛的应 用前景。例如，对于感染性疾病，利用微生物特异的铁载体转运系统将结合体定向的转 入到病原微生物体内，像单克隆抗体一样定向杀死靶向病原微生物，避免病原微生物 对药物的抗性（Roosenberg JM, Lin YM, Lu Y, eiai · Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents [J] · 2000, 7: 159~197·)，而真菌铁载体本身 可以作为治疗心血管疾病的潜在药物（Pocsi I, Jeney V，Kertai P, ei a7 · Fungal siderophores function as protective agents of LDL oxidation and are promising anti-atherosclerotic metabolites in functional food[J]. Mol. Nutr. Food Res, 2008，52，1434~1447.)。农业上，产生铁载体的非病原真菌能够获取生长所需要的铁， 具有种间竞争上的优势，抑制不能携带铁载体的病原微生物生长。对于重金属污染环境修 复，铁载体促进植株根际周围矿物质溶解，使植株吸收包括铁在内的多种金属离子（Mishra B, Haack EA, Maurice PA, et al . A spectroscopic study of the effects of a microbial siderophore on Pb adsorption to kaolinite[J]. Chemical Geology, 2010, 275, 199-207. )〇
[0003] 近10年文献中，以原核生物，特别是海洋微生物的研究占据了相当比例，真核微 生物铁载体的研究只占了较少部分。相比其它微生物天然化合物，陆生碱性环境微生物铁 载体的研究目前尚处于空白。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在通过分离、筛选、提供一种铁载体活性较强的活性真菌菌株，并以该菌 株为出发菌株提供一种获得目的铁载体活性物质和化合物的制备方法。
[0005] 本发明通过以下技术方案实现上述技术发明目的： (一）产生物铁载体化合物的真菌菌株FEDT-866 所述菌株为塔宾曲霉（供1/76·_/6·) FEDT-866，保藏编号为CGMCC No : 10985。
[0006] (二）真菌菌株FEDT-866的制备方法 包括以下步骤： (1) 制备孢子悬液及液体培养液 将菌株FEDT-866接种于去铁查氏琼脂培养基的琼脂斜面上，每支斜面试管规格为 015X150 mm，该琼脂培养基体积5 mL，28°C培养4~7 d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜 面加入5 mL无菌去离子水，灭菌竹签轻刮洗菌苔制成孢子悬液； 制备所述的去铁查氏琼脂培养基（g/L) =NaNO3 2.0 g、K2HP04 1.0 g、KCl 0.5 g、MgS04〇. 5 g、鹿糖30. 0 g、琼脂20. 0 g、去离子水I L、pH自然，配好后121°C灭菌20 min ; (2) 制备种子液 取步骤（I)按一支FEDT-866菌株制备孢子悬液接种200 mL灭菌去铁查氏基础培养基， 28°C，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，以该培养液为种子液； (3) 制备发酵粗提的铁载体制剂 取种子液接种于去铁查氏基础培养基的三角瓶，种子液与去铁查氏基础培养基体积比 为5mL:200 mL，灭菌28°C，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，收 集培养液，过滤，弃菌渣，滤液用硅藻土吸附烘干即为发酵粗提的铁载体制剂； 所述的去铁查氏基础培养基与去铁查氏琼脂培养基的成分区别是：去铁的查氏基础培 养基不加入琼脂，其余成分相同。
[0007] 进一步的精制工艺中，所述的制备方法是： (1) 取步骤（3 )滤液缓慢加入填充75~150 μ m精细填料且高度为60 cm的110 X 2 cm 玻璃柱中，常压吸附，收集过柱液，循环3次；甲醇冲洗玻璃柱，收集洗脱液，保留过柱液与 洗脱液的活性部分； (2) 精制过柱液与洗脱液的活性部分 取步骤（1)过柱液减压蒸干，用丙酮溶解，过滤，蒸干丙酮，甲醇溶解，过滤，收集的白色 颗粒物放入去离子水中，45 °C水浴，溶解白色颗粒物，4 °C结晶，待短粗的无色透明棱形结晶 析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到过柱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈鲜艳的 桃红色； 取步骤（1)洗脱液蒸干，用石油醚洗涤，甲醇溶解，4°C结晶，待大量细长无色针状晶体 析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到洗脱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈紫红 色。
[0008] 本发明具有以下积极进步和意义： 选择前期从云南省永胜县碱性湖泊-程海泥样PH为8. 85~9. 05,湖水呈高硬度，Fe3+与 Fe2+浓度分别为0. 0005 mg/L及0. 0002 mg/L以及个旧大屯矿坝不溶解状态铁氧化类物质 pH :8. 64-8. 93,金属质量百分比：铁14. 64%、锡0. 29%、铅0. 044%、砷0. 18%、铜0. 12%的碱性 尾矿土壤样品中，分离获得100株真菌菌株；以CAS显色原理为指导比较不同层次的产铁载 体的活性及类型，筛选得到一株铁载体活性较强的活性真菌菌株FEDT-866。经过分子生物 学鉴定，FEDT-866被鉴定为塔宾曲霉供菌株，该菌株于2015年6 月17日在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"有效保藏，保藏号为：CGMCC No. 10985,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
[0009] 本发明以FEDT-866为出发菌株进行培养，培养物制备的方法包括发酵粗提的铁 载体制剂和进一步精制重结晶，获得目的铁载体活性化合物。该菌株所产铁载体为大极性 化合物，水溶解性好、活性高、可作为相关铁载体产品开发的优良候选材料，且菌株发酵工 艺简单、结晶工艺流程容易。
【附图说明】
[0010] 图1为菌株FEDT-866 ITS序列系统发育树状图。
[0011] 图2为菌株FEDT-866扫描电子显微镜形态。
[0012] 以下结合实施例做进一步说明。本发明实施例包括但不限制本发明的保护范围。
【具体实施方式】
[0013] 实例1.菌株初筛 将前期分离自云南程海泥样及个旧大屯碱性尾矿土壤的100株真菌接种于去铁查氏 琼脂培养基斜面上，试管规格为015 X 150 mm，培养基为5 mL，每株菌接种2支斜面（1支为 备用)，28°C培养4~7 d，待菌丝体形成大量孢子后，除备用斜面外，向斜面中加入5 mL无菌 去离子水，灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液备用。
[0014] 每株菌的孢子悬液分别接种到装有去铁查氏基础培养基的试管中（试管规格为 015X150 mm，液体培养基体积5 mL)，每株菌接种3支试管，设置未接菌的3支试管为阴性 对照，28°C培养7 d，待试管液体培养基表面有大量菌丝生长及孢子出现时进行初筛。
[0015] 其中，去铁的查氏琼脂培养基（g/L)配制方法是：NaNO3 2. 0 g ;K2HP04 I. 0 g ;KC1 0· 5 g ;MgS04 0· 5 g ;鹿糖30. 0 g ;琼脂20. 0 g ;去离子水I L ;pH自然；配好后121°C灭菌