的乙醇。把吸附柱 转到一个新的I. 5 mL离心管，在吸附柱中心加入30微升ddH20,室温放置lmin，13000 rpm 离心lmin，回收滤液即获DNA。PCR产物T载体连接体系为：4微升5XReaction Buffer ; 10 微升 PCR Product ;2 微升 PTZ57R/T Vector ; 1 微升 T4 DNA Ligase ;3 微升 ddH20。PCR 产物T载体连接程序：摇匀，离心，22°C放置I h，连接产物直接转化。解冻化学感受态细胞 T0P10,转移到1.5 mL离心管中，加入连接产物，冰上放置30 min。将离心管放于42°C水浴 90 s，冰浴2 min，室温放置5 min。每管加800微升无抗生素 LB液体培养基，37°C振荡45 min复苏。8000 rpm离心2 min，去掉800微升上清液，重悬后均匀涂布到Amp抗性平板上， 室温吹干，倒置于37°C培养箱，培养12~16 h长出菌落，进行菌落PCR鉴定和测序。
[0037] 2.分析ITS序列 FEDT-866菌株rDNA序列经PCR扩增和测序，获得长度为606个有效碱基的ITS序列。
[0038] 测得的DNA序列经NCBI BLAST引擎搜索后获取相关种属的ITS基因序列，用 ClustalX 1. 8软件进行排列。系统发育分析时排除碱基缺失位点，用邻接法构建系统发育 树。距离矩阵按照Kimura' s双参数模型进行计算，你 oteira/检验进行1000次取样。结 果显示，菌株FEDT-866在进化树上的位置可靠（你值>70)。线段标尺（0. 01)表 示1%序列差异的分支长度。由系统进化树得知菌株FEDT-866与标准菌株 供asis CBS 134. 48 ITS序列最大相似性达到99. 65% (见图1)。
[0039] 3. FEDT-866扫描电子显微镜观察 取FEDT-866菌株制备孢子悬液(实例I )200微升均匀涂布到PDA培养基上，以30~45° 角斜插入已灭菌的盖玻片，28°C培养5 d，待培养基表面大量着生孢子菌丝蔓延至盖玻片即 停止培养。取出盖玻片，置于灭菌105 mm培养皿内，室温下充分干燥5 d，菌丝体表面喷金， 扫描电子显微镜观察。
[0040] 其中，PDA培养基的成分为（g/L):马铃薯200. 0 g，蔗糖20. 0 g，琼脂20. 0 g，水 I L，pH自然。马铃薯去皮，切块煮沸30 min，过滤，加糖溶化，补足水至I L，121°C灭菌30 min〇
[0041] 扫描电子显微镜观察结果：菌株FEDT-866呈曲霉属微生物典型特征，分生孢子梗 由一根直立的菌丝形成，菌丝的末端形成球状膨胀。菌株分生孢子梗及孢子粗糙有棘(见图 2)。在自然光下观察，该菌株分生孢子呈深褐绿色。
[0042] 综合以上信息，推断菌株FEDT-866菌株属于塔宾曲霉供
[0043] 实例5.菌株FEDT-866铁载体的制备 将1支FEDT-866菌株制备孢子悬液(实例1)接种于200 mL灭菌液体去铁查氏培养基 中（实例1)，28°C，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养。以该培养 液为种子液，按5%接种比例将其平均接种到20瓶各装有200 mL灭菌液体去铁查氏培养基 的500 mL三角瓶内，28°C，180 rpm培养5 d。待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养， 收集培养液，过滤，弃菌渣，滤液用硅藻土吸附烘干即为铁载体制剂。
[0044] 实例6.菌株FEDT-866铁载体的精制 将1支FEDT-866菌株制备孢子悬液(实例1)接种于200 mL灭菌液体去铁查氏培养基 中（实例1)，28°C，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养。以该培养 液为种子液，按5%接种比例将其平均接种到20瓶各装有200 mL灭菌液体去铁查氏培养基 的500 mL三角瓶内，28°C，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，收 集培养液，过滤，弃菌渣，滤液备用。
[0045] 将75~150 μπι精细填料填充到110X2 cm玻璃柱中，填充高度大约为60 cm，纯 甲醇冲洗后，将滤液缓慢加入玻璃柱，常压吸附，过柱液收集后再加入到玻璃柱，循环3次， 纯甲醇冲洗玻璃柱，收集洗脱液，用CAS检测试剂检测过柱液与洗脱液的活性，保留活性部 分。
[0046] 以上过柱液减压蒸干后用丙酮溶解，过滤除去不溶物，蒸干丙酮，纯甲醇溶解，过 滤，白色颗粒物在45°C水浴中用去离子水溶解，4°C结晶，待短粗的无色透明棱形结晶析出 后再反复重结晶3次，过滤，烘干，得到菌株FEDT-866铁载体的精制品1，该精制品与CAS 显色液反应呈鲜艳的桃红色，为菌株FEDT-866主要的铁载体活性化合物之一。
[0047] 以上洗脱液蒸干后用石油醚洗涤去掉油状物，甲醇溶解，4°C冰箱结晶，待大量细 长无色针状晶体析出后再反复重结晶3次，过滤，烘干，得到菌株FEDT-866铁载体的精制品 2，该精制品与CAS显色液反应呈紫红色，为菌株FEDT-866另一主要的铁载体活性化合物。
【主权项】
1. 产生物铁载体化合物的真菌菌株FEDT-866,其特征是：所述菌株为塔宾曲霉 供asidFEDT-866,保藏编号为CGMCCN〇:10985。2. 如权利要求1所述的真菌菌株FEDT-866的制备方法，包括以下步骤： (1) 制备孢子悬液及液体培养液 将菌株FEDT-866接种于去铁查氏琼脂培养基的琼脂斜面上，每支斜面试管规格为 015X150mm，该琼脂培养基体积5mL，28°C培养4~7d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜 面加入5mL无菌去离子水，灭菌竹签轻刮洗菌苔制成孢子悬液； 制备所述的去铁查氏琼脂培养基（g/L):NaN03 2. 0g、K2HP04 1.0g、KCl0. 5g、MgS04 〇. 5g、鹿糖30. 0g、琼脂20. 0g、去离子水IL、pH自然，配好后121°C灭菌20min; (2) 制备种子液 取步骤（I)按一支FEDT-866菌株制备孢子悬液接种200mL灭菌去铁查氏基础培养基， 28°C，180rpm培养5d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，以该培养液为种子液； (3) 制备发酵粗提的铁载体制剂 取种子液接种于去铁查氏基础培养基的三角瓶，种子液与去铁查氏基础培养基体积比 为5mL:200mL，灭菌28°C，180rpm培养5d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养，收 集培养液，过滤，弃菌渣，滤液用硅藻土吸附烘干即为发酵粗提的铁载体制剂； 所述的去铁查氏基础培养基与去铁查氏琼脂培养基的成分区别是：去铁的查氏基础培 养基不加入琼脂，其余成分相同。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征是： (1) 取步骤（3 )滤液缓慢加入填充75~150ym精细填料且高度为60cm的110X2cm 玻璃柱中，常压吸附，收集过柱液，循环3次；甲醇冲洗玻璃柱，收集洗脱液，保留过柱液与 洗脱液的活性部分； (2) 精制过柱液与洗脱液的活性部分 取步骤（1)过柱液减压蒸干，用丙酮溶解，过滤，蒸干丙酮，甲醇溶解，过滤，收集的白色 颗粒物放入去离子水中，45 °C水浴，溶解白色颗粒物，4 °C结晶，待短粗的无色透明棱形结晶 析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到过柱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈鲜艳的 桃红色； 取步骤（1)洗脱液蒸干，用石油醚洗涤，甲醇溶解，4°C结晶，待大量细长无色针状晶体 析出后重结晶3次，过滤，烘干，得到洗脱液的精制品，该精制品与CAS显色液反应呈紫红 色。
【专利摘要】产生物铁载体化合物的FEDT-866真菌菌株及制备方法，属于微生物分离和培养。本发明以碱性及富含不溶解铁环境土壤样品分离微生物真菌菌株，筛选获得铁载体活性较强的塔宾曲霉（<i>Aspergillus？tubigensis</i>？）菌株FEDT-866，保藏号CGMCC？No.10985。制备包括菌株液体培养，发酵液前处理及精制铁载体活性物质等步骤。本发明菌株产孢丰富，培养基原料廉价，液体培养条件简单，易于工业化放大，具有生物医药、农业、环境修复等的应用前景。CGMCC No.1098520150617
【IPC分类】C12R1/66, C12N1/14, C12P1/02
【公开号】CN105176846
【申请号】
【发明人】李铭刚, 赵江源, 文孟良, 张孝龙
【申请人】云南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月30日