20 min。去铁的查氏基础培养基成分与去铁的查氏琼脂培养基相同，但其中不加琼脂。
[0016] 初筛是在96孔板中每孔中加入20微升CAS染液和等体积的上述菌株试管液体培 养液，二者充分混合，记录变为红色、紫色或黄色的培养液样品所对应的菌株编号作为下一 步复筛菌株。未接种真菌的培养液样本为阴性对照。乙二胺四乙酸（EDTA)饱和去离子水 溶液为阳性对照。根据CAS染液特有的颜色反应，共从100株真菌中筛选出36株有颜色变 化的真菌，其中24株颜色反应为红色或橘红色，7株为黄色，5株为紫色，将其作为复筛的目 标菌株。
[0017] 其中，CAS 染液的配制参照文献（Brian C. Louden; Daniel Haarmann; Aaron Lynne. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. β?&ΒΕ. , 2011,12 (1): 51_53.)进行。
[0018] 本发明将CAS液体检测法与96孔板法相结合来作为对产铁载体真菌的筛选，操作 简单、快速，适合于大批量的筛选。
[0019] 实例2.菌株复筛 1.培养液96孔板快速复筛 将初筛选出来的36株真菌分别制备孢子悬液(实例1 )，分别接种到100 mL液体去铁查 氏培养基中，每菌株接种250 mL三角瓶3瓶，孢子悬液接种量为5 mL/100 mL，未接种真菌 的培养液样本为阴性对照。各摇瓶统一在28°C、180 rpm摇床上培养5 d，待培养基内有大 量菌丝球出现即进行复筛。
[0020] 复筛中，以未接种真菌的培养液样本为阴性对照，EDTA饱和去离子水溶液为阳性 对照。向96孔板每孔加入40微升CAS染液和等体积的上述菌株试管液体培养液，轻微摇 晃，充分混合。用秒表测定混合后颜色变化时间，记录所对应的菌株编号，反应用时短、反应 颜色红的菌株产铁载体的螯合能力强，将其作为复筛入选菌株。
[0021] 在36株复筛菌株中，有7株菌的培养液与CAS染液的显色时间< 5秒，显色橘 黄、橘红及桃红，作为复筛入选菌株。而阳性对照Η)ΤΑ饱和去离子水溶液的显色时间为 2±0. 12秒，颜色为紫红色。
[0022] 2. CAS双层平板对照筛选验证 以CAS双层平板法进一步验证上述筛选程序获得的菌株是高产铁载体的真菌。将前期 复筛获得的7株真菌每株菌接种2支斜面，1支为备用，28°C培养4~7 d，待菌丝体形成大量 孢子后，向斜面中加入5 mL无菌去离子水，用灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液备用。
[0023] 在无菌条件下，每菌株孢子悬液用无菌滴管各吸取10微升菌悬液滴入事先放置 于CAS双层琼脂平板上的05 mm灭菌滤纸片上。处理好的平板用封口膜封好，28°C培养3~5 d后观察结果。未接菌的空白培养基作为阴性对照。用0.2微米滤头过滤的乙二胺四乙酸 (EDTA)饱和去离子水溶液作为阳性对照。
[0024] 其中，CAS双层平板配制方法为：当1%琼脂温度下降到65°C时，按5 mL CAS染液 100 mL 1 %琼脂的比例，将65°C水浴30 min的CAS蓝色检测液与其混合均勾，按20 mL / 皿量倒入01〇5 _平板，室温下凝固作为下层平板。之后将灭菌之后的去铁的查式培养基按 15 mL /皿量倒入下层CAS平板上，室温下凝固作为上层平板，放05 mm灭菌滤纸片备用。
[0025] 去铁的查氏琼脂培养基配制方法同上。
[0026] CAS双层平板验证结果：3 d后7株菌株在平板上都具有明显菌落生长，与阴性 空白对照相比，在菌落的下方或周围具有明显的颜色变化。其中，与阳性空白对照相比， FEDT-866菌落周围颜色变化非常明显，呈鲜艳桃红色，且扩散趋势强烈，菌落迅速将整个平 板颜色改变，说明菌株FEDT-866产铁载体的活性很强，亲水性好，并且所产铁载体随着菌 丝体生长不断分泌到细胞外，符合铁载体的筛选要求，将其作为最终入选菌株。
[0027] 实例3.目的菌株FEDT-866铁载体含量和结构类型检测 I. FEDT-866铁载体定量测定 制备FEDT-866菌株孢子悬液(实例1)，取100 mL孢子悬液在250 mL三角瓶的去铁查 氏培养基上接种，接种量为5 mL/100 mL，共3瓶，28°C、180 rpm培养5 d，待体培养基出现 大量菌丝球即作为发酵液进行铁载体定量测定。未接种的去铁查氏培养基作为空白对照。
[0028] 分别取5 mL发酵液用0. 2微米微孔滤膜过滤除菌，与5 mL CAS染液混匀，静止1 h，测定其0D_ (As)，以双蒸水作为对照调零，处理重复3次。用相同方法测定未接菌空白 培养基吸光值作为参比值（Ar)，铁载体的浓度用铁载体活性单位（Siderophoreunit, SU) 表示，SU= [ (Ar - As) /Ar] X 100%，SU值与铁载体活性正相关。一般产铁载体能力较高的微 生物As/Ar低于0. 5。结果显示(见表1)，菌株FEDT-866的As/Ar小于0. 5,表明其为高产 铁载体真菌。
[0029] 表1阳性菌株FEDT-866产铁载体的定量测定
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2. FEDT-866铁载体的化学结构类型检测 用氯化铁检测法（FeCl3 test)对异羟肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体进行检测。
[0030] 异羟肟酸型铁载体检测方法：将5 mL FEDT-866菌株发酵液用0. 2 μ m微孔滤膜 过滤除菌，取I mL滤液加入1~5 mL 2%氯化铁溶液。紫外分光光度计检测，螯合物为异羟 肟酸型铁载体的吸收峰在420~450nm之间。
[0031] 儿茶酚型铁载体检测方法：将5 mL FEDT-866菌株发酵液用0. 2 μπι微孔滤膜过 滤除菌，取I mL滤液加入I mL 250 μ mol CuSO4溶液和2 mL pH =4的醋酸盐缓冲液。紫 外分光光度计检测，螯合物为羧酸型铁载体的吸收峰在190~280 nm之间。
[0032] 表2 FEDT-866铁载体的化学结构类型检测
结果显示，FEDT-866铁载体的化学结构类型同时包括异羟肟酸型和羧酸型。
[0033] 实例4.目的菌株FEDT-866的分子生物学鉴定 1、基因组DNA提取、扩增和测序 将高产铁载体菌株FEDT-866接种在已灭菌的50 mL PDA液体培养基中，180 rpm，28 °C下培养3 d，提取基因组DNA及其扩增、测序。
[0034] 其中，PDA培养基的成分为（g/L):马铃薯200. 0 g，蔗糖20. 0 g，水I L，pH自然。 马铃薯去皮，切块煮沸30 min，过滤，加糖溶化，补足水至I L，121°C灭菌30 min。
[0035] 基因组DNA的提取方法为：取3~5 mL培养物，13000 rpm，离心I min，弃培养基。 加入真菌DNA提取裂解液300 μ L，涡旋沉淀，65°C水浴30 min :加入等体积氯仿与异戊醇 混合液，氯仿：异戊醇=24:1，祸旋混勾，13000 rpm离心5 min，取上清；加入等体积的异丙 醇，混勾，13000 rpm，离心5 min，弃上清；加入70%乙醇混勾，13000 rpm离心I min，弃乙 醇，倒置离心管，晾干。加入30 μ L ddH20,溶解DNA，进行下游PCR扩增。
[0036] 其中，rDNA-ITS的PCR扩增体系组成为：5微升10XK0D buffer ;5微升2 _ dNTPs ;1 微升 Genomic DNA ;1 微升 Forward Primer (IOum) ;1 微升 Reverse Primer (IOum) ; 1 微升 KOD DNA Polymerase ;36 微升 ddH20〇 扩增程序为：94°C 3 min ;94°C 30 s， 58°C 30 s，72°C 3 min，35个循环；72°C 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检 测，再扩增1个50 μ L体系的PCR后回收产物。PCR回收产物程序为：加入4倍体积（800 μ L)的Buffer CP到I. 5 mL离心管，剧烈震荡，短暂离心；把吸附柱放在收集管里；把PCR 扩增产物混合物按每次750微升转入吸附柱，13000 rpm离心I min，弃废液；加入700微升 洗脱液，13000 rpm离心I min，弃废液；加入500 μ L洗脱液，13000 rpm离心I min，弃废 液；将吸附柱放入收集管，空管13000 rpm离心2 min，以去除吸附柱上