专利名称：在芽孢杆菌细胞的枯草菌脂肽突变体中生产多肽的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及在一种芽孢杆菌细胞突变体中生产多肽的方法，获取芽孢杆菌细胞突变体的方法及芽孢杆菌细胞突变体。
相关技术的说明枯草菌脂肽是一种环脂肽，具很好的表面活性剂性质。该物质主要由好多种芽孢杆菌在生长稳定期产生(Carswell等，1994，应用微生物学和生物技术41281-285；Lin等，1994，应用和环境微生物学6031-38；Morikawa等，1992，发酵和生物工程杂志74255-261；Arima等，1968，生物化学生物物理研究交流31488-494)。该脂肽含七个氨基酸，L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu，其与3-羟基-13-甲基-十四酸通过一个酰胺键(脂肪酸的羧基与谷氨酸的氨基之间)和一个酯键(末端亮氨酸的羧基与脂肪酸的羟基之间)相连接。已经知道脂链长为13，14和15个碳原子的同源系列(Hosono和Suzuki，1983，抗生素杂志36667-673；Razafindralambo等，1993，层析杂志63981-85)，以及在第七或第四位氨基酸不同的分别叫做[Val7]-，[Ile7]-和[Ala4]-枯草菌脂肽的同种型(Peypoux等，1994，欧洲生化杂志22489-96；Baugmart等，1991，生物化学生物物理研究交流177998-1005)。
据报道，由srf操纵子编码的一种多酶复合物负责枯草菌脂肽的通过所谓的硫模板机制的非核糖体生物合成。该操纵子含有至少四个基因srfA，srfB，srfC和srfD。这四个基因以前分别叫做srfAA，srfAB，srfAC和srfAD。srfA，srfB和srfC编码枯草菌脂肽的合成酶亚单位，每个亚单位均包含有1个或多个氨基酸激活结构域，这些结构域对于激活枯草菌脂肽的底物氨基酸以产生枯草菌脂肽是必需的(van Sinderen等，1993，分子微生物学8833-841；Nakano和Zuber，1989，细菌学杂志8821-831Cosmina等，1993，分子微生物学8821-831)。该多酶复合物组合成七个大的结构域，它们群集在三个分开的蛋白质上(Menkhaus等，1993，生物化学杂志 2687678-7684；Gulli等，Biochimica et Biophysica Acta 120519-28)。该七个结构域负责激活并结合枯草菌脂肽的七个氨基酸。根据硫模板机制，特定氨基酸的腺苷化和结合发生在相应的氨基酸激活区，这一过程需辅因子4-磷酸泛酰巯基乙胺。随后的反式硫脂化反应逐步延长肽链，序列顺序由诸多酶亚单位的空间排列所决定。目前尚不清楚脂肪酸部分是何时及怎样连接到肽链上的，也不清楚酯键是怎样形成，进而使得分子变成环形的。而且，基因sfp也被认为参与枯草菌脂肽的表达(分泌)(Nakano等，1992，分子普通遗传学232313-323)。
芽孢杆菌是已经良好建立的、用于生产天然和重组蛋白质的宿主细胞系统。但是，具有所期望的蛋白质表达和分泌增多特性的芽孢杆菌宿主并不一定就具备成功发酵所期待的特性。特别是，由于伴随着生物量的增加，泡沫会相应增加，因而发酵可能并非最好。起泡增加限制了发酵的生产力。
因而本发明的一个目的就是提供改进的芽孢杆菌宿主，其既具有表达商业量蛋白质的能力，又有如意的发酵特性，诸如生长较快长和起泡较少，因而增强了发酵生产力。
发明概述本发明涉及生产多肽的方法，该方法包括(a)在有利于生产多肽的条件下培养芽孢杆菌细胞的突变体，其中，(i)该突变体包括两种核酸序列，其中第一种核酸序列编码多肽，第二种核酸序列包含负责枯草菌脂肽或其同种型的生物合成或分泌的至少一个基因的修饰，(ii)在同等条件下培养时，该突变体生产的枯草菌脂肽或其同种型比芽孢杆菌细胞低；和(b)从培养液中分离多肽。
本发明也涉及芽孢杆菌细胞的突变体及生产芽孢杆菌细胞突变体的方法。
附图简述
图1表示pShv2的限制酶切图谱。
图2表示pSJ3200的限制酶切图谱。
图3表示pSJ2662的限制酶切图谱。
图4表示pSJ2882-MCS中amyQ启动子-amyM基因融合体的构建。
图5表示pPL2419的限制酶切图谱。
图6表示pCAsub2的限制酶切图谱。
图7表示pBAN-NOV的限制酶切图谱。
图8表示pPL2541-tet的限制酶切图谱。
发明详述本发明涉及生产多肽的方法，该方法包括(a)在有利于生产多肽的条件下培养芽孢杆菌细胞的突变体，其中，(i)该突变体涉及负责枯草菌脂肽或其同种型的生物合成或分泌的至少一个基因发生修饰(如破坏)的芽孢杆菌细胞，(ii)在同等条件下培养时，该突变体生产的枯草菌脂肽或其同种型比芽孢杆菌细胞少；和(b)从培养液中分离多肽。
术语“枯草菌脂肽”此处定义为一种环形脂肽，其中氨基酸序列L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu与链长为13至15个碳原子的直链或支链b-羟基脂肪酸相连。术语“同种型”此处定义为枯草菌脂肽的变体，其内一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基所替换，例如[Val7]-，[Ile7]-和[Ala4]-枯草菌脂肽。
本发明方法中，芽孢杆菌细胞可以是野生型芽孢杆菌细胞或其突变体。本发明实施方案中可用的芽孢杆菌细胞包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，短芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的细胞。在优选的实施方案中，该芽孢杆菌细胞是解淀粉芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方案中，该芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌ATCC 6051或6051A，或者枯草芽孢杆菌NCFB736(原来叫NCDO736)。
可以运用本领域熟知的插入或缺失方法，通过减少或消除负责枯草菌脂肽或其同种型生物合成或分泌的一个或多个基因，构建成芽孢杆菌细胞突变体。例如，向其中一个基因中插入含有与该基因同源之核酸片段的整合质粒，使这一同源区域产生重复，并将载体DNA插入到重复区之间，这样，可以破坏该基因。如果插入的载体DNA将基因启动子和编码区隔开或者打断了编码区，导致产生非功能性基因产物，则能够消除基因表达。另外，也可对负责枯草菌脂肽或其同种型的生物合成或分泌的一个或多个基因表达有利或必需的一个或多个控制序列(如启动子)进行修饰。或者，基因表达的减少或消除也可通过基因转变方法(参看，如Iglesias和Trautner，1983，分子普通遗传学18973-76)或通过基因置换方法。在后一方法中，将该基因的突变形式引入到不复制的或温度敏感的质粒中，该质粒连有选择标记。在不让质粒复制的条件下，通过对标记的选择即可完成对质粒整合的选择。通过检查菌落中选择标记的丧失和突变基因的获得即可对产生基因置换的第二次重组进行选择(参看，如Perego，1993，A.L.Sonneshein，J.A.，Hoch和R.Losick编写，枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌，42章，美国微生物学学会，Washington，D.C.，1993)。再有，减小或消除负责枯草菌脂肽生物合成或分泌的一个或多个基因的表达还可运用本领域技术人员熟知的方法通过随机诱变来实现，这些方法包括，但不局限于转座和化学诱变。
也可以构建芽孢杆菌细胞突变体，以生产枯草菌脂肽的变体或同种型。变体或同种型与从天然来源中分离的该肽之间的区别在于变体不起泡，或具有减低的表面活性剂特点。对负责枯草菌脂肽生物合成的一个或多个基因的核酸序列的修饰可以通过本领域熟知的方法来实现，例如，替换结构域编码区以构建编码氨基酸特异性有所改变的肽合成酶的杂合基因，并产生具修饰过的氨基酸序列的肽(参看，如Stachelhaus等，1995，科学26960-72)。在本发明中更进一步地，氨基酸的替换可以产生枯草菌脂肽阴性表型，如用丙氨酸替换丝氨酸(D’Souza等，1993，细菌学杂志，1753502-3510；Vollenbroich等，1993，FEBS Letter325220-224；Stachelhaus等，1995，同前)。可以基于负责枯草菌脂肽生物合成的诸基因的核酸序列，通过引入会产生不同氨基酸序列而非天然枯草菌脂肽分子氨基酸序列的核苷酸替换而构建类似的核酸序列。核酸替换的一般阐述参看如Ford等，1991，蛋白质表达和纯化295-107。
本领域技术人员均显然知道，这种替换可以发生在对分子功能很重要的区域内或区域外。根据本领域技术人员所熟知的方法可以确认那些对该肽的表面活性剂性质很重要的氨基酸残基，这种方法例如是定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参看，如Cunningham和Wells，1989，科学2441081-1085)。在后一技术中，在该分子的每一个残基处引入突变，检测所得突变分子的表面活性剂活性，以确认对该分子的活性很重要的氨基酸残基。
在本发明所述的方法中，可对芽孢杆菌细胞内负责枯草菌脂肽或其同种型生物合成或分泌的任何基因进行修饰。例如，修饰的基因可以是srf操纵子中的任何基因，如srfA，srfB，srfC和srfD。或者，可以修饰基因sfp。
更进一步，本发明中可以修饰负责将脂肪酸部分连接到该肽上，或负责形成酯键以生成环形分子的基因，以得到不具有起泡特性的芽孢杆菌突变体细胞。
再更进一步，本发明中，芽孢杆菌细胞的突变体还可以含可能对多肽的生产，回收或应用有害的其它基因的缺失或插入。例如，在优选的实施方案中，该芽孢杆菌细胞可以是蛋白质酶缺失的细胞。在另一优选的实施方案中，该芽孢杆菌细胞不产生芽孢，如由于spoIIAC的缺失。也可缺失对多肽的生产、回收或应用有害的其它基因，如amyE基因。
本发明所述方法中，本发明的突变体在有利于多肽生产的条件下培养时，具有不起泡或减低起泡的特性。本发明的芽孢杆菌细胞突变体生产的枯草菌脂肽的量可用本领域技术人员熟知的方法来确定(参看，如Ohno等，1995，生物技术和生物工程学47209-214和Grossman等，1993，细菌学杂志1756203-6211)。在同等生产条件下，优选突变体细胞比相应的亲本芽孢杆菌细胞的枯草菌脂肽产量至少低约25％，更优选至少低约50％，还要更优选至少低约75％，最优选至少低约95％。在同等生产条件下，比起相应的亲本芽孢杆菌细胞，优选突变体细胞的多肽产量至少多约25％，更优选至少多约50％，还要更优选至少多约75％，最优选至少多约95％。
运用本领域熟知的方法，在适合多肽生产的营养培养基中培养细胞。例如，可以在适合多肽表达或/和分离的条件下，在合适的培养基中，经摇瓶培养，实验室或工业发酵罐中的少量或大量发酵(包括连续发酵，分批发酵，补料分批发酵，或固态发酵)培养细胞。培养是在含有碳源，氮源和无机盐的合适培养基中，通过本领域熟知的方法进行的。合适培养基可购自商业供应商，也可根据已发表的组合物配制(如美国典型培养物保藏中心的目录)。分泌的多肽可直接从培养基中回收。
运用本领域熟知的专门检测多肽的方法可检测到多肽。这些检测方法可包括运用特异的抗体，形成酶产物，酶底物的消失，或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。例如，可用酶测定来确定多肽活性。许多酶的酶活性测定方法为本领域所熟知。
产生的多肽可用本领域熟知的方法来分离。如，可用常规方法从营养培养基中分离多肽，这些方法包括但不局限于离心，过滤，提取，喷雾射干燥，蒸发，或沉淀。运用各种层析方法可对分离得到的多肽进一步纯化，如离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等。
可用本领域熟知的许多方法纯化多肽，这些方法包括但不局限于层析方法(如离子交换层析，亲和层析，疏水层析，层析聚焦，和大小排阻层析)，电泳方法(如制备性等电聚焦(IEF))，差异溶解性(如硫酸铵沉淀)，或者提取(参看，如《蛋白质纯化》，J.-C.Janson和LarsRyden编著，VCH Publishers，纽约，1989)。
所述多肽可以是任何多肽。此外，该多肽可以是芽孢杆菌细胞的天然或异源多肽。术语“多肽”在这里并不是指特定长度的编码产物，因而包含肽，寡肽和蛋白质。术语“多肽”也包括组合在一起形成编码产物的两种或多种多肽。术语“多肽”也包括杂合多肽，其包含得自至少两种不同多肽的部分或全部多肽序列的组合，所述至少两种不同多肽中的一种或多种可能是芽孢杆菌细胞的异源多肽。多肽还包括前述多肽和杂合多肽的天然等位基因变体或工程化变体。
优选地，该多肽是激素，激素变体，酶，受体或其部分，抗体或其部分，或报道分子。在更优选的实施方案中，该多肽是氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，或连接酶。在更优选的实施方案中，该多肽是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，壳多糖酶，角质化酶，环状糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，转化酶，漆酶，脂酶，甘露糖苷酶，齿斑葡聚糖酶(mutanase)，氧化酶，果胶分解酶，过氧化物酶，肌醇六磷酸酶，多酚氧化酶，蛋白质水解酶，核糖核酸酶，转谷氨酰胺酶(transglutaminase)或木聚糖酶。
在本发明方法中，所述芽孢杆菌细胞突变体可以是重组细胞，其中包含编码异源多肽的核酸序列，该细胞可有利地用于多肽的重组生产中。优选向细胞中转入包含有编码该异源多肽之核酸序列的载体，然后整合该载体到染色体中。“转化”意指向宿主细胞中引入含有第二种核酸序列的载体，使得该载体作为染色体的整合体或能自我复制的染色体外载体而维持。整合通常被认为更有利，因为这种情况下，该核酸序列更有可能在细胞内稳定维持。通过同源重组，非同源重组或转座，载体整合到染色体中。
编码异源多肽的核酸序列可得自原核，真核或其它来源，如古细菌。本发明中，就一指定来源所用的术语“得自”是指该多肽是由该来源产生的，或由已插入了来自该来源的基因的细胞产生的。
在本发明方法中，芽孢杆菌细胞突变体也可用于芽孢杆菌细胞天然多肽的重组生产中。天然多肽可通过以下方法重组生产，如将编码该多肽的基因置于不同的启动子控制下，以增加该多肽的表达，利用信号序列使目的天然多肽输出到细胞外，及增加编码芽孢杆菌正常生产之多肽的基因的拷贝数。在术语“异源多肽”的适用范围内，本发明也包括同源多肽的重组生产，其中这种表达涉及非该芽孢杆菌天然的遗传因子的使用，或已被加工而以宿主细胞中非常见方式发挥作用的天然元件的使用。
用于分离或克隆编码异源多肽的核酸序列的技术为本领域所熟知，包括自基因组DNA中的分离，自cDNA中的制备，或其组合。从这种基因组DNA中克隆核酸序列可运用熟知的聚合酶链反应(PCR)来完成。参看，如Innis等，1990，PCR方案方法和应用指导手册，AcademicPress，New York。克隆方法可以涉及包括编码多肽的核酸序列的所需核酸片段的切割和分离，将该片段插入到载体分子中，和将该重组载体掺入到芽孢杆菌细胞内，其中该核酸序列的多拷贝或克隆将得到复制。该核酸序列可以是基因组，cDNA，RNA，半合成的，合成的，或其任意组合。
本发明所述的方法中，异源多肽也可包括融合多肽，其中另一多肽与所述多肽或其片段在N-末端或C-末端相融合。可通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一多肽的核酸序列(或其部分)融合而产生融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域所熟知，包括连接编码诸多肽的编码序列，以使它们读框一致，并且融合多肽的表达受相同启动子或终止子所控制。
“核酸构建体”在此处定义为一种单链或双链的核酸分子，它分离自天然存在的基因，或已被修饰而含有几个核酸片段，这些片段以天然并不存在的方式组合和合并在一起。当核酸构建体包含本发明编码序列表达所需的所有控制序列时，术语“核酸构建体”可能与术语表达盒同义。这儿定义的“编码序列”是指置于前述控制序列的控制下能转录为mRNA并翻译为本发明多肽的序列。编码序列的边界一般由5’-端的翻译起始密码子ATG和3’-端的翻译终止密码子所确定。编码序列可以包括但不局限于DNA，cDNA和重组核酸序列。
分离得到的编码多肽的核酸序列可用多种方法来加工，以使其表达多肽。根据表达载体的不同，在将核酸序列插入到载体内之前对其进行操作可能会是期望的或必要的。运用克隆方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。
包括编码多肽之核酸序列的核酸构建体可有效地与一个或多个控制序列连接，所述控制序列能在与其相容的条件下指导编码序列在芽孢杆菌细胞突变体中的表达。
在此定义的术语“控制序列”包括对核酸序列中编码序列的表达必需或有利的所有组分。每个控制序列都可以是编码多肽之核酸序列的天然或外源序列。这些控制序列包括但不局限于前导序列，启动子，信号序列和转录终止子。最低限度控制序列包括启动子，转录和翻译终止信号。控制序列中还可加入接头，以引入特定限制酶切位点，便于控制序列与编码多肽之核酸序列的编码区间的连接。
控制序列可以是合适的启动子序列，即可被芽孢杆菌细胞识别以表达所述核酸序列的一种核酸序列。启动子序列含有转录控制序列，可介导多肽表达。启动子可以是在所选芽孢杆菌细胞中显示转录活性的任一核酸序列，可以得自编码与芽孢杆菌细胞同源或异源的细胞内或细胞外多肽的基因。能指导本发明核酸构建体转录(特别是在芽孢杆菌细胞内)的合适启动子的例子是来源于以下的启动子大肠杆菌lac操纵子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌左聚蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖源淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院学报753727-3731)，及tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院学报8021-25)。更多的启动区在下面文章中有描述“来源于重组细菌的有用蛋白质”，科学美国人，1980，24274-94；和Sambrook等，1989，出处同前。
控制序列也可以是一段合适的转录终止子序列，即可被芽孢杆菌细胞识别以终止转录的序列。终止子序列有效地连接到编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选芽孢杆菌细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明中。
控制序列也可以是一段合适的前导序列，即mRNA中对芽孢杆菌细胞翻译很重要的非翻译区。前导序列有效地连接到编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选芽孢杆菌细胞中有功能的任何前导序列均可用于本发明中。
控制序列也可以是一段信号肽编码区，其编码与多肽的氨基端相连接的氨基酸序列，能指导表达多肽进入细胞的分泌途径。信号肽编码区可以是本发明多肽的天然区域，也可来源于外源。核酸序列编码序列的5’末端自身可含有一段信号肽编码区，该编码区与编码分泌多肽的编码区部分翻译读框一致地天然相连。或者，编码序列的5’末端自身可含有异源于编码分泌多肽之编码序列部分的信号肽编码区。编码序列正常不含有信号肽编码区时可能需要外源信号肽编码区。或者，外源信号肽编码区可简单地替换掉天然的信号肽编码区，目的在于与编码序列通常相关的天然信号肽编码区相比，能更加增强多肽的分泌。信号肽编码区可得自芽孢杆菌的淀粉酶或蛋白酶基因。但是，任何能够指导表达多肽进入所选芽孢杆菌细胞分泌途径的信号肽编码区均可用于本发明。
在芽孢杆菌细胞中有效的信号肽编码区是来源于以下基因的信号肽编码区芽孢杆菌NCIB 11837的麦芽糖源淀粉酶基因，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因，地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因，地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因，嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)，和枯草芽孢杆菌prsA基因。更多的信号肽描述可见Simonen和Palva，1993，微生物学评论57109-137。
本发明所述方法中，包含核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体可用于多肽的重组生产。上面所述的各种核酸序列和控制序列可结合使用以生产重组表达载体，该载体可含一个或多个方便的限制酶切位点，使得可以在这些位点插入或替换编码多肽的核酸序列。或者，可将核酸序列或含该序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中而表达该核酸序列。构建表达载体时，将编码序列置于载体中，使编码序列有效地与用于表达和分泌(可能的话)的合适控制序列相连接。
重组表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作和使核酸序列表达的任何载体。载体的选择通常取决于载体与将导入载体的芽孢杆菌细胞间的相容性。载体可以是线形或闭环质粒。载体可以是自主复制载体，也就是能作为染色体外实体存在、其复制不依赖于染色体复制的载体，如质粒，染色体外元件，微型染色体，或人工染色体。载体可含有任何确保自我复制的成分。或者，载体可以是当引入芽孢杆菌细胞时能整合到基因组中，并与其整合入的染色体一同复制的载体。载体系统可以是单一载体或质粒，也可以是合在一起含有要引入到芽孢杆菌细胞基因组内的完整DNA两个或多个载体或质粒，或者是转座子。
当引入到芽孢杆菌细胞时，载体可能会整合到芽孢杆菌细胞基因组中。为了进行整合，载体可能会依赖于编码多肽的核酸序列或载体的其它元件，以使载体通过同源重组稳定地整合到基因组中。或者，载体可能含有额外的核酸序列，以指导其通过同源重组整合到芽孢杆菌细胞的基因组中。额外的核酸序列使得载体能在染色体的准确位置处整合到芽孢杆菌细胞基因组中。为提高在准确位置整合的可能性，整合成分优选应含足够数目的核酸，如100至1500bp，优选是400至1500bp，最优选是800至1500bp，并且与相应的目标序列高度同源，以增加同源重组的概率。整合成分可以是与芽孢杆菌细胞基因组中目标序列同源的任何序列。此外，整合成分可以是编码或不编码的核酸序列。
为了进行自主复制，载体还可以包括一个复制起点，以使载体能在研究的芽孢杆菌细胞中自主复制。细菌复制起点的例子是能在大肠杆菌内复制的质粒pBR322，pUC19，pACYC177和pACYC184的复制起点，和能在芽孢杆菌内复制的pUB110，pE194，pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以含能使其功能在芽孢杆菌细胞内成为温度敏感型的突变(参看，如Ehrlich，1978，美国国家科学院学报751433)。
超过一个拷贝的编码本发明多肽的核酸序列可以被插入到芽孢杆菌细胞中，以增加该核酸序列的表达。稳定地扩增核酸序列可以通过运用本领域熟知的方法将该序列至少一个额外的拷贝整合到芽孢杆菌细胞基因组内和选择转化体来达到达到扩增基因组DNA序列的一个方便方法在WO94/14968中有阐述。
载体优选含有一个或多个可选择性标记，以便方便地选择转化细胞。可选择性标记是一个基因，其产物具有杀生物剂抗性，重金属抗性，为营养缺陷体提供原养型，等等。细菌可选择性标记的例子是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性，如青霉素抗性，卡那霉素抗性，红霉素抗性，氯霉素抗性，或四环素抗性的标记。此外，可以运用共转化来达到选择目的，如像在WO91/09129中阐述的一样，其中可选择性标记位于另一分开的载体上。
前面所述的连接各个成分以构建本发明重组表达载体的方法为本领域技术人员所熟知(参看，如Sambrook等，1989，同前)。
芽孢杆菌细胞的转化可通过多种方法进行，例如，原生质体转化(参见，如Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168111-115)，利用感受态细胞(参见，如Young和Spizizin，1961，细菌学杂志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志56209-221)，电穿孔(参见，如Shigekawa和Dower，1988，生物技术6742-751)，或者接合(参见，如Shigekawa和Thorne，1987，细菌学杂志1695271-5278)。
本发明由下面的实施例中更进一步阐述，但这些实施例不应被解释成是对本发明范围的限制。
实施例所有引物和寡聚物均在应用生物系统模型394合成仪(AppliedBiosystems Inc.Foster City，C.A.)，根据生产厂家的说明所合成。实施例1枯草芽孢杆菌供体菌株BW154的构建这里所述枯草芽孢杆菌宿主菌株A164(ATCC6051A)和1630(NCFB736)中均有数个基因(spoIIAC，aprE，nprE，amyE，和srfC)被缺失。为了完成这个任务，利用pLS20介导的接合系统(Koehler和Thorn，1987，见前)，向这些菌株中导入了含有这些基因的缺失形式的质粒。简要地说，这个系统包括一个含有大质粒pLS20的枯草芽孢杆菌“供体”菌株。pLS20编码将pLS20迁移至枯草芽孢杆菌受体菌株所必需的功能。此外，已知质粒诸如pUB110和pBC16也可由这个接合系统(在pLS20存在下)进行迁移。这些质粒含有顺式作用区(oriT)和编码作用于oriT位点并推动这些质粒向受体菌株转移的反式作用功能的基因(orf-beta)。如果供体菌株含有pLS20以及pUB110和pBC16二者中的任一种，则仅含有oriT的质粒也能被迁移(这时，orf-beta功能由反式提供)。
有效的供体菌株必须含有质粒pLS20或其衍生质粒如pXO503(Koehler和Thorne，1987，见前)。此外，也希望在接合完成之后有反筛选供体菌株的方法。已经发展了一种非常“干净”(无背景)且易于实施的反筛选方案。这涉及在供体菌株的dal基因(编码细胞壁合成所需的D-丙氨酸消旋酶)中导入缺失以及将接合实验后所得细胞混合物涂板于丙氨酸缺失的固体培养基上而对供体菌株进行筛选(枯草芽孢杆菌dal-菌株只能在添加了外源丙氨酸的培养基中才能生长)。
为了缺失上面所提到的基因，必须将含有这些基因的缺失形式的pE194复制子(红霉素抗性)(Gryczan等，1982，《细菌学杂志》152722-735)和oriT序列转移到枯草芽孢杆菌A164和A1630菌株中。合适的供体菌株应有以下特征1)dal基因已缺失(为了进行反筛选)，和2)它还必须含有质粒pLS20(此时pXO503不适用，因为pE194复制子必须通过红霉素筛选保持，而pXO503已赋予对红霉素的抗性)，以及pUB110或pBC16以反式提供orf-beta功能。有关枯草芽孢杆菌BW154如何构建成为供体菌株的叙述如下。(A)在枯草芽孢杆菌中导入dal缺失突变，得到枯草芽孢杆菌BW96。
首先，选择bac-1基因内有突变的枯草芽孢杆菌菌株(该基因突变使得菌株失去了合成二肽抗生素杆菌溶素的能力)，因为前面已述，在接合过程中，野生型枯草芽孢杆菌细胞会杀死其他种芽孢杆菌，而bac-1-细胞中这种潜在的杀伤力则大大降低。因此，所有供体菌株均是在bac-1背景下构建的。
构建合适供体菌株的第一步为缺失背景为bac-1的枯草芽孢杆菌菌株1A758(Bacillus Stock Center，哥伦比亚，俄亥俄州)中dal基因的部分。体外构建了能够替换细菌染色体上野生型dal基因的dal基因缺失形式。利用PCR扩增得到dal基因的5’和3’部分，引物1和2用来扩增该基因的5’部分(核苷酸19-419，ATG密码子的A是+1位)，引物3和4用来扩增该基因的3’部分(核苷酸618-1037)。引物15’-GAGCTCACAGAGATACGTGGGC-3’(SEQ ID NO1)引物25’-GGATCCACACCAAGTCTGTTCAT-3’(SEQ IDNO2)(划线部分为BamHI位点)引物35’-GGATCCGCTGGACTCCGGCTG-3’(SEQ ID NO3)(划线部分为BamHI位点)引物45’-AAGCTTATCTCATCCATGGAAA-3’(SEQ ID NO4)(划线部分为HindIII位点)扩增反应(100μl)含有以下组分200ng枯草芽孢杆菌168染色体DNA，每一引物浓度均为0.5μM，dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度各为200μM，1×Taq聚合酶缓冲液，以及1U Taq DNA聚合酶。依照Pitcher等，1989，应用微生物学通讯8151-156所述方法得到枯草芽孢杆菌168的染色体DNA。反应条件如下95℃ 3分钟，然后再进行30个循环，每个循环程序为95℃ 1分钟、50℃ 1分钟和72℃ 1分钟，最后为72℃ 5分钟。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测。根据生产商的操作指示，利用TA克隆试剂盒(Invitrogen，圣地亚哥，加州)将5’和3’PCR产物克隆至pCRII载体中。鉴定出含有dal基因5’端一半且由PCR引物导入的BamHI位点与pCRII载体多接头的BamHI位点相邻的pCRII克隆(另一方向的克隆中BamHI位点间相距要远得多)。然后用BamHI和HindIII消化含有dal基因3’端一半的pCRII克隆，再将该dal基因片段克隆至前述含有dal基因5’端一半的pCRII克隆的BamHI-HindIII位点，这样所产生的pCRII载体含有中部缺失了约200bp的dal基因，在该基因的5’末端有一NotI位点(pCRII多接头的部分)，3’末端为HindIII位点。
为了将该dal缺失导入细菌染色体，将该缺失基因克隆至枯草芽孢杆菌温度敏感型复制子pE194(Gryczan等，1982，见前)中。然后经两步将该缺失dal基因导入染色体中首先通过同源重组将此质粒整合到染色体dal位点，接着再除去质粒(还是通过同源重组)，使得dal基因的缺失形式仍保留在细菌染色体上。这可通过下列步骤完成将该缺失dal基因片段(如上述)克隆至温度敏感型质粒pSK+/pE194的NotI-HindIII位点(实质上是用dalΔ片段替代pSK+载体序列)。质粒pSK+/pE194的构建方法如下用XbaI酶切消化BluescriptSK+(Stratagene，La Jolla，CA)和pE 194，然后用小牛肠碱性磷酸酶处理pSK+载体，再将两质粒连接起来。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α，转化体在含氨苄青霉素(100μg/ml)和X-gal的LB培养基上进行筛选。从数个“白色”菌落中纯化出质粒，利用限制酶切消化并随后凝胶电泳鉴定出含有pE194和pSK+的嵌合体。用HindIII和NotI消化该质粒。然后凝胶纯化含有pE194复制子的片段，并将其连至同样经凝胶纯化的dalΔ基因片段(HindIII-NotI)上。连接产物被用来转化枯草芽孢杆菌bac-1菌株1A758(Bacillus Stock Center，哥伦Columbus，OH)，并在含红霉素(5mg/ml)的胰蛋白胨血琼脂碱(TBAB)平板中选择转化体，在许可温度34℃下进行培养。从5个红霉素抗性转化体中纯化出质粒，并经限制酶切消化/凝胶电泳分析。鉴定出对应于含有dal缺失片段的pE194的质粒。带有这个质粒的菌株随后被用来通过同源重组向染色体中导入dal缺失。
为了获得首次交换(dal缺失质粒整合到染色体上的dal基因内)，将转化菌株在含有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和红霉素(5μg/ml)的TBAB平板上划线，在非许可温度45℃下生长过夜。取一大菌落再次于相同条件下进行划线，得到染色体上的dal基因内整合有温度敏感型质粒的细胞的均一群体。在非许可温度下，由于质粒不能复制，因此只有在染色体上含有该质粒的细胞才能在红霉素平板上生长。为了获得第二次交换事件(导致质粒从染色体上切出，只留下dal基因的缺失形式)，将一环细胞转移至20ml含D-丙氨酸(0.1mg/ml)的Luria培养液中，在许可温度34℃下进行无选择生长至对数后期，以使得复制起点保持功能，并发生第二次交换事件。细胞再转移四次(每次转移稀释100倍)，以使得质粒从染色体上切除并从群体中分离出来。最后，细胞在34℃下涂板于添加有D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板上以生长出单菌落，并将菌落印迹转移至无D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板上和有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和红霉素(5μg/ml)的TBAB平板上，以便对dal-和erms菌落计数。50个菌落中有2个具有这种表型。将所得菌株命名为枯草芽孢杆菌BW96，这是一种bac-1，dal-菌株。(B)将pLS20和pBC16导入枯草芽孢杆菌bac-1、dal缺失菌株，得到接合有效供体菌株枯草芽孢杆菌BW154。
选择一种供体菌株，用于向枯草芽孢杆菌BW96中导入pLS20和pBC16质粒，该供体菌株应具有以下特征本身为红霉素敏感型的含有pLS20和pBC16的枯草芽孢杆菌菌株(为了提供对抗供体菌株的反筛选)。一种含有pLS20和pBC16的dal缺失枯草芽孢杆菌菌株被选为合适的供体菌株，其构建如下用pHV1248(Petit等，1990，《细菌学杂志》1726736-6740)转化枯草芽孢杆菌DN1686(美国专利号4,920,048)，使得细胞获得红霉素抗性。通过与枯草芽孢杆菌(natto)3335UM8(Koehlr和Thorne，1987，见前)的接合转移，接合元件pLS20和质粒pBC16一起被转移至枯草芽孢杆菌DN1686(pHV1248)菌株中。筛选得到的转接合子为含有dal缺失突变的四环素和红霉素抗性菌落。根据带有pLS20的菌落通过接合转移pBC16至其它枯草芽孢杆菌菌株的能力对它们进行评分。最后，通过提高培养温度至50℃，使得接合菌株丢掉pHV1248，从而得到供体菌株含有pLS20和pBC16的枯草芽孢杆菌DN1686。
为了将这些质粒导入枯草芽孢杆菌BW96中，必须执行恰当的反筛选，因此，用赋与红霉素抗性的温度敏感型质粒pSK+/pE194转化枯草芽孢杆菌BW96，其随后可通过生长于非允永许温度下而除去。根据以下程序，将pLS20和pBC16从含有pLS20和pBC16的枯草芽孢杆菌DN1686中迁移至枯草芽孢杆菌BW96(带有pSK+/pE194)中。每种类型细胞各取一接种环的量，混合涂在添加了D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上，33℃下温育5小时。从平板上刮取细胞，转移至1ml LB培养基中。将多种稀释度的细胞铺在添加了四环素(10μg/ml)，红霉素(5μg/ml)和D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上，34℃生长，以筛选获得了pBC16以及许多情况下也获得了pLS20的受体细胞。为了检测pLS20是否也存在于任一转接合子中，测试了十个菌落转移pBC16至枯草芽孢杆菌PL1801中的能力。枯草芽孢杆菌PL1801为缺失了apr和npr基因的枯草芽孢杆菌168(芽孢杆菌储藏中心，哥伦布，OH)。然而，也可用枯草芽孢杆菌168。能够迁移pBC16的供体一定也含有pLS20。一旦鉴定出能有效接合的菌株(含有pLS20及pBC16和pSK+/pE194的bac-1，dal-枯草芽孢杆菌)，通过在添加了四环素(5μg/ml)和D-丙氨酸(50μg/ml)的LB培养基中于45℃过夜增殖细胞，在33℃铺板于添加了D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上以获得单菌落，并鉴定出红霉素敏感型菌落，即可从该菌株中除去pSK+/pE194质粒。该程序产生枯草芽孢杆菌BW154，即含有pLS20和pBC16的bac-1，dal-枯草芽孢杆菌。
表1简要总结了各芽孢杆菌菌株和质粒。
表1芽孢杆菌菌株和质粒枯草芽孢杆菌菌株枯草芽孢杆菌(纳豆) pLS20DN1686 dal-DN1280 dal-MT101DN1280(pXO503)1A758168 bac-1(芽孢杆菌储藏中心，哥伦布，Ohio)BW96 1A758 dalΔBW97 1A758 dalΔ∷cat(pXO503)BW99 1A758 dalΔ(pPL2541-tet)BW1001A758 dalΔ(pX0503)，(pXL2541-tet)PL1801 aprΔ，nprΔ质粒pBC16 Mob+，TcrpE194 温度敏感型pLS20 Tra+pXO503 Tra+，MLSr(＝pLS20∷Tn917)pPL2541-tetMob+，Tcr(pE194 ts ori)pCAsub2Mob+，Cmr，Apr，(pE194-ts ori)pSK+/pE194Emr，Apr，温度敏感型pShv2 Tra+，Emr，Cmr，温度敏感型pHV1248Emr，温度敏感型Tra+表示该质粒赋与携有它的任一枯草芽孢杆菌菌株进行接合的能力，也就是说，该质粒编码将一接合型质粒从供体细胞转移至受体细胞所需的全部功能。
Mob+表示质粒可被含有Tra+质粒(pLS20或pXO503)的菌株通过接合进行转移。该质粒必须含有顺式作用序列和编码反式作用蛋白的基因(例如在pBC16中分别为oriT和orf-beta)，或仅有oriT序列(例如pPL254-tet，这时细胞中还必须存在反式提供orf-beta功能的质粒，如pBC16)。实施例2枯草芽孢杆菌A164(ATCC 6051A)中spoIIAC基因的缺失利用重叠延伸剪切(SOE)技术(Horton等，1989，《基因》7761-68)，生成spoIIAC基因的缺失形式，该基因编码sigmaF，使得细胞通过孢子形成II期。利用Pitcher等(1989，出处同前)的方法获得枯草芽孢杆菌A164(ATCC6051A)的染色体DNA。合成下面列出的引物5和6，以用于PCR扩增枯草芽孢杆菌A164的染色体DNA上从spoIIAC基因ATG起始密码子上游205个核苷酸至ATG起点下游209个核苷酸的区域。上游引物的下划线核苷酸为添加的HindIII位点。下游引物的下划线核苷酸与ATG翻译起始密码子下游507至524位碱基互补。合成引物7和8，以用于PCR扩增ATG翻译起始密码子下游从507位延伸至884位核苷酸的序列区。引物7的下划线区与用于扩增上游片段的引物6的3’端部分完全互补。引物55’-AAGCTTAGGCATTACAGATC-3’(SEQ ID NO5)引物65’-CGGATCTCCGTCATTTTCCAGCCCGATGCAGCC-3’(SEQ ID NO6)引物75’-GGCTGCATCGGGCTGGAAAATGACGGAGATCCG-3’(SEQ ID NO7)引物85’-GATCACATCTTTCGGTGG-3’(SEQ ID NO8)在各自的PCR扩增中使用这两套引物来分别扩增spoIIAC基因的上游和下游片段。扩增反应体系(25μl)含有以下组分200ng枯草芽孢杆菌A164染色体DNA，每条引物0.5μM，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP各为200μM，1×Taq DNA聚合酶缓冲液，以及0.625U的TaqDNA聚合酶。反应条件如下96℃3分钟，然后依次按96℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分钟为一个循环进行30个循环，最后再72℃3分钟以确保扩增片段末端加上腺嘌呤(Invitrogene，圣地亚哥，加州)。目标产物的扩增经1.5％琼脂糖凝胶电泳加以确证。
然后在含上述每种扩增反应产物各2.5μl，而除了只加有引物5和8外其它反应条件同上的新的PCR反应体系中完成扩增，得到长为1089个核苷酸的“剪切”片段，代表内部缺少298个核苷酸的spoIIAC基因。利用Invitrogen TA克隆试剂盒，按照生产商的操作指示，将该片段克隆至pCRII载体中，作为HindIII-EcoRI片段切出，再克隆至用HindIII/EcoRI消化过的pShv2中。pShv2是一个穿梭载体，通过将含有pUB110 oriT的pBCSK+(Stratagene，La Jolla，加州)XbaI酶切片段与pE194(图1)XbaI酶切片段连接，再连入来自pUB110的经PCR扩增出的含有SstI相容性末端的oriT片段而构建成。通过pLS20介导的接合(Battisti等，1985，细菌学杂志162543-550)，oriT片段使得该质粒迁移至枯草芽孢杆菌A164中。pShv2-ΔspoIIAC被转入供体菌株枯草芽孢杆菌BW154(实施例1)。枯草芽孢杆菌BW154(pShv2-ΔspoIIAC)被用作供体菌株，向枯草芽孢杆菌A164中导入该带有缺失基因的穿梭载体。
通过转有pShv2-ΔspoIIAC的枯草芽孢杆菌BW154与枯草芽孢杆菌A164的接合，筛选红霉素抗性转接合子，并于45℃培养，可实现缺失基因与完整染色体基因间的交换。在45℃下，pE194复制子没有活性，细胞只能通过含有缺失基因的质粒在spoIIAC位点的Campbell整合才能保持红霉素抗性。通过在34℃，即允许pE194复制子行使功能的温度下，在无抗生素选择的LB培养基中培养菌株两轮，完成第二次重组，导致载体DNA脱落(loopout)，并且缺失基因替代了完整spoIIAC基因。根据以下标准选择出已经发生基因替代的菌落1)穿梭载体pShv2编码的红霉素(erm)抗性缺失，2)在孢子形成培养基上菌落不透明度降低，表明不能产生孢子，和3)用引物5和8经PCR扩增可获得一条791个核苷酸的片段而不是该基因未缺失形式的1089个核苷酸。实施例3枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC中nprE基因的缺失根据实施例2所述方法制备出枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC染色体DNA作为模板，利用下述引物9和10，PCR扩增出中性蛋白酶(nprE)基因的上游部分序列(GTG起始密码子下游第40-610位核苷酸)。利用下列引物11和12，经PCR扩增出nprE基因的下游部分(核苷酸1040-1560)。引物10和11设计成在两片段中有15个碱基对重叠(下划线部分)。扩增反应体系(25μl)含有实施例2所述的相同组分，并在相同条件下完成。引物95’-CGTTTATGAGTTTATCAATC-3’(SEQ ID NO9)引物105’-AGACTTCCCAGTTTGCAGGT-3’(SEQ ID NO10)引物115’-CAAACTGGGAAGTCTCGACGGTTCATTCTTCTCTC-3’(SEQ ID NO11)引物125’-TCCAACAGCATTCCAGGCTG-3’(SEQ ID NO12)参照生产商的操作指示，对所扩增的上游和下游片段用QiaexII试剂盒(Qiagen，Chatsworth，加州)进行凝胶纯化。在含每种纯化片段各约20ng的新的PCR混合物(100μl)中进行反应。以下条件用来进行SOE反应按实施例2的条件，先不加引物进行第1-3个循环，产生“剪接”片段，再在加入引物9和12的条件下进行第4-30个循环。所扩增的SOE片段被克隆进pCRII载体，并进行限制性酶切分析确证。该片段随后作为BamHI-XhoI片段克隆进pShv2。这个质粒，pShv2-ΔnprE被转化至枯草芽孢杆菌BW154中，得到可用于接合的合适供体菌株。该质粒随后被迁移至枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC中。利用实施例2所述的温度变换方法，将ΔnprE基因引入枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIAC的染色体上。将erms菌落涂在加有1％脱脂奶粉的TBAB琼脂平板上，37℃生长过夜，从而对nprE-表型评分。(nprE-菌株的清亮带显著减弱。)利用引物9和12进行染色体DNA的PCR分析，证实有430个碱基对被删除。实施例4枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprE中aprE基因的缺失利用SOE方法产生出枯草芽孢杆菌中编码碱性枯草溶素(subtillisin)蛋白酶的aprE基因的缺失形式。根据实施例2所述方法，利用下列引物13和14，从枯草芽孢杆菌A164染色体DNA上PCR扩增出aprE基因的上游部分序列，得到从翻译起始密码子上游189个核苷酸至起始点下游328个核苷酸的一个片段。引物13中带下划线的核苷酸为添加的EcoRI位点。引物14中带下划线的核苷酸处添加有SalI位点，并为下游PCR片段提供互补性。选用引物15和16，经PCR扩增出aprE基因的下游部分序列，得到从aprE翻译起始密码子下游789位核苷酸至1306位核苷酸的一个片段。引物14和引物15中带下划线的区域为上游片段与下游片段间提供互补。引物16的下划线核苷酸添加了HindIII位点。扩增反应体系(25μl)含有如实施例2所述的相同组分，并在相同条件下执行。引物135’-GCGAATTCTACCTAAATAGAGATAAAATC-3’(SEQ ID NO13)引物145’-GTTTACCGCACCTACGTCGACCCTGTGTAGCCTTGA-3’(SEQ ID NO14)引物155’-TCAAGGCTACACAGGGTCGACGTAGGTGCGGTAAAC-3’(SEQ ID NO15)引物165’-GCAAGCTTGACAGAGAACAGAGAAGCCAG-3’(SEQ ID NO16)参照生产商的操作指示，利用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Chatsworth，加州)纯化出扩增得到的上游和下游片段。然后利用引物13和16将两种纯化片段剪接在一起。除了染色体DNA用上游和下游PCR产物各2μl替代外，扩增反应体系(50μl)含有与前述相同的组分。反应先在96℃3分钟温育1个循环(无dNTPs和Taq聚合酶)，然后进行30个循环，每个循环程序为96℃1分钟再72℃1分钟。这样产生了aprE中缺失编码区460个核苷酸的缺失形式。反应产物经琼脂糖电泳分离，克隆至pCRII中，以EcoRI-HindIII片段切出，再克隆至经EcoRI/HindIII消化的pShv2载体中，得到pShv2-ΔaprE。该质粒被导入以上所述的供体菌株中，用于接合转移至枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprE中。
根据以上所述spoIIAC和nprE的缺失方法，用缺失基因替换aprE基因。利用红霉素敏感型以及在加有1％脱脂奶粉上层的TBAB琼脂平板上清亮带的减弱，选择出aprE基因已被缺失的菌落。AprE的缺失经PCR确证。
枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE在这里被称为枯草芽孢杆菌A164Δ3。实施例5枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE中amyE基因的缺失利用SOE方法产生编码枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的amyE基因的缺失形式。利用下列引物17和18从枯草芽孢杆菌A164染色体DNA中扩增出amyE的上游部分序列，得到从amyE翻译起始密码子上游421位核苷酸延伸至amyE编码区第77位核苷酸的DNA片段，并在上游末端加有SalI位点，在下游末端加有SfiI和NotI位点。选用引物19和20，经PCR扩增出amyE基因的下游部分序列，得到从amyE编码区第445位核苷酸至953位核苷酸的片段，并在上游末端加有SfiI和NotI位点，在下游末端加有HindIII位点。限制性酶切位点用下划线标出。扩增反应体系(25μl)含有与实施例2所述的相同组分，并在相同条件下执行。
利用引物17和20通过PCR将两条片段剪接起来。除了其中染色体DNA被换成上游和下游PCR产物各2μl外，扩增反应体系(25μl)含有与前述相同的组分。反应先在96℃3分钟温育1个循环(无dNTPs和Taq聚合酶)，然后进行30个循环，每个循环程序为96℃1分钟再72℃1分钟。该反应通过两片段在互补区的重叠(SfiI和NotI位点)将这两片段融合，得到缺少编码区367个核苷酸、并在amyE的两部分序列之间导入了SfiI和NotI位点的amyE片段。根据标准方法进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离出反应产物。参照生产商的操作指示，将该片段克隆至pCRII中，产生pCRII-ΔamyE。引物175’-CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3’(SEQ ID NO17)(划线处为SalI位点)引物185’-CGCGGCCGCAGGCCCTTAAGGCCAGAACCAAATGAA-3’(SEQ ID NO18)(划线处为NotI和SfiI位点)引物195’TGGCCTTAAGGGCCTGCGGCCGCGATTTCCAATG-3’(SEQ ID NO19)(划线处为SgiI和NotI位点)引物205’-GAAGCTTCTTCATCATCATTGGCATACG-3’(SEQ ID NO20)(划线处为HindIII位点)用NotI消化pShv2，用Klenow片段和dNTP补平粘性末端，并重新连接该质粒，得到pShv2.1。该步骤破坏了pShv2的NotI位点。从pCRII-ΔamyE上以SalI-HindIII形式切下缺失型amyE片段，克隆至用SalI和HindIII双消化的pShv2.1中，得到pShv2.1-ΔamyE。将该质粒导入枯草芽孢杆菌BW154，以便接合转移至枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE中。
根据以上就spoIIAC，nprE和aprE所述的方法，用缺失基因替代amyE基因。利用红霉素敏感性以及失去在加有天青色淀粉顶层的平板上产生清亮带的能力，选择出已经发生基因替代的菌落。通过利用引物17和20对染色体DNA进行该缺失基因的PCR扩增，证实amyE基因的缺失。实施例6缺失枯草芽孢杆菌A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE中的srfC基因，得到枯草芽孢杆菌A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC合成下列引物21-24，用于缺失枯草菌脂肽操纵子的srfC基因。引物21与srfC基因中已存在的HindIII位点(下划线)有重叠，与引物22相配合，可以PCR扩增出从srfC翻译起始点下游410位核苷酸至848位核苷酸的DNA片段。引物22的下划线部分与ATG起始密码子下游第1709-1725位核苷酸互补。用引物23和24用PCR扩增出srfC翻译起始点下游1709至2212位核苷酸的区域。引物23的下划线部分与ATG密码子下游835-848位核苷酸互补。扩增反应体系(25μl)含有与实施例2所述相同的组分，并在相同条件下执行。引物215’-AAGCTTTGAATGGGTGTGG-3’(SEQ ID NO21)引物225’-CCGCTTGTTCTTTCATCCCCTGAAACAACTGTACCG-3’(SEQ ID NO22)引物235’-CAGTTGTTTCAGGGGATGAAAGAACAAGCGGCTG-3’(SEQ ID NO23)引物245’-CTGACATGAGGCACTGAC-3’(SEQ ID NO24)利用Qiagen PCR离心柱(Qiagen，Chatsworth，加州)，从PCR产物中除去引物和其它污染物。经PCR产生的两个片段间的互补性使得可通过SOE完成剪接。除前3个循环是在加入引物之前进行的，以延伸重叠区外，其它PCR条件与以上所述相同，加入“外端引物”—引物21和24，将PCR产物(每种2μl或大约50ng)剪接到一起。经SOE反应得到缺失srfC基因内部859个核苷酸的长为955个核苷酸的片段。srfC基因被缺失的部分负责向枯草菌脂肽分子添加第七个氨基酸(即亮氨酸)，它的缺失进一步引起基因的移码突变，导致肽在类似硫酯酶活性位点的区域之前终止，而推测该区域参与SrfC蛋白的枯草菌脂肽释放(Cosmina等，1993，见前)。
根据以上就spoIIAC，nprE，aprE和amyE述及的缺失方法，用缺失基因替代srfC基因。利用红霉素敏感性特征以及失去在血琼脂平板上产生清亮带的能力(Grossman等，1993，细菌学杂志1756203-6211)，以及在加有50ml含有10％蔗糖，4％大豆粉，0.42％无水Na2HPO4和0.5％CaCO3并添加5μg/ml氯霉素的PS-1培养基的250ml摇瓶中，37℃，250rpm培养4天，缺少泡沫的产生，来选择已经发生基因替代的菌落。利用引物21和24，从染色体DNA中PCR扩增缺失基因，确证srfC基因已发生缺失。
枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC在这里被称为枯草芽孢杆菌A164Δ5。实施例7枯草芽孢杆菌A1630ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC的构建根据实施例1-6就枯草芽孢杆菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC(枯草芽孢杆菌A164Δ5)所述的相同程序，利用为枯草芽孢杆菌A164缺失所构建的诸缺失质粒，从枯草芽孢杆菌A1630(NCFB736，旧称NCDO736)构建出枯草芽孢杆菌A1630ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC。
枯草芽孢杆菌A1630ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC在这里被称为枯草芽孢杆菌A1630Δ5。实施例8构建用于将amyQ启动子-amyM转录盒整合至枯草芽孢杆菌A164菌株中的载体在紧接着编码解淀粉芽孢杆菌淀粉酶(BANTM，Novo NordiskA/S，Bagsverd，丹麦)的amyQ基因的启动子下游导入NOVAMYLTM(amyM)基因和其天然核糖体结合位点，构建成转录融合体。利用下列引物25和26，在与实施例2所述相同的条件下，PCR扩增出amyQ基因启动子(BANTM启动子)，并克隆在pCRII载体上，测序确证无扩增错误，然后连至已用SfiI和SstI双切的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHP13-ampMCS的多克隆位点中。引物255’-TTTGGCCTTAAGGGCCTGCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAG-3’(下划线部分分别为SfiI和ClaI位点)(SEQ ID NO25)引物265’TTTGAGCTCCATTTTCTTATACAAATTATATTTTACATATCAG-3’(下划线部分为SstI位点)(SEQ ID NO26)用AatII酶切pUC19，Klenow片段和脱氧核糖核苷酸补平后再用HindIII酶切，构建出pHP13(Haima等，1987，《分子和普通遗传学》209335-342)的变体pHP13-ampMCS。用Qiaex试剂盒(Qiagen，Thousand Oaks，加州)凝胶纯化较大的2.2kb片段。pHP13经HpaI(在红霉素抗性基因内切开)酶切，补平，再用HindIII酶切。然后将来自pHP13的3.0Kb较大片段与含有pUC9复制起点和氨苄青霉素抗性基因的2.1Kb pUC9片段相连接。最后，在50mM NaCl，10mM Tris pH7.5和1mM EDTA中，使下列两种寡核苷酸27和28各100pmol沸煮5分钟，然后在2小时期间缓慢冷至室温，从而进行退火，得到新的多克隆位点(MCS)，并用其替代pUC9的多克隆位点。寡聚体275’-AGCTAGGCCTTAAGGGCCCGGGACGTCGAGCTCAAGCTTGCGGCCGCCATGGTCGACG-3’(SEQ ID NO27)寡聚体285’-AATTCGTCGACCATGGCGGCCGCAAGCTTGAGCTCGACGTCCCGGGCCCTTAAGGCC-3’(SEQ ID NO28)由于用于PCR扩增BANTM(amyQ)启动子的引物导入了SfiI和SstI位点，为了构建转录融合体，必须在NOVAMYLTM(amyM)开放阅读框上游导入Sst I位点。因此，设计含有SstI接头的5′PCR引物(下列引物27)，使其与NOVAMYLTM(amyM)核糖体结合位点上游4个核苷酸可以退火。这个PCR引物的位置紧邻一潜在发夹结构的下游，因此在扩增步骤中会将其略去。在实施例2所述条件下，以200ng pSJ3200(图2)作模板DNA，利用与PvuII位点重叠的PCR引物(下列引物28)和含有SstI位点的引物组合，扩增出编码NOVAMYLTMN-末端327个核苷酸的片段。引物295’-CTGAGCTCTACGAAAGGAGACACACATGC-3’(划线为SstI位点)(SEQ ID NO29)引物305’-ACGCCCAGCTGTTTAAGATAAG-3’(划线为PvuII位点)(SEQ ID NO30)将NOVAMYLTM基因作为PstI-BglII片段克隆至含有较大多克隆位点的pUB110衍生质粒pSJ2662(图3)中，构建出pSJ3200质粒(图2)。
为了重新构建amyM基因，将经PCR扩增得到的327个核苷酸的片段作为SstI-PvuII片段切出，并与下游2.2Kb PvuII-SstI片段(编码amyM的后半部分)一起以3-片段连接的方式连入用SstI切开的pUC118中。然后将重新构建的amyM基因作为SstI片段切出，克隆于pSJ2882-MCS中所含的amyQ启动子下游。图4总结了这些克隆步骤。pSJ2882-MCS来自pHP13(Haima等，1987，分子普通遗传学209335-342)，但含有两端为SifI-Not I的多克隆位点，还具有含来自pUB110的oriT区的0.5Kb SstI片段。后一片段使得可通过pLS-20介导的接合而将质粒迁移至枯草芽孢杆菌A164中(Battisti等，1985，细菌学杂志162543-550)。
将连接反应物直接转入枯草芽孢杆菌PL1801spoIIE中。根据生长在含有5μg/ml氯霉素的天青色淀粉平板上出现或缺少带晕圈的菌落，来确认pSJ2882-MCS中amyM开放阅读框相对于amyQ启动子的合适方向。
为了构建整合载体pCAsub2，用BclI和BglII消化切下pPL2419(图5)的新霉素抗性基因，并代之以pMI 1101上含有氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的BamHI片段(Young man等，1984，质粒121-9)，得到质粒pPL2419-cat。(BamHI粘性末端与BclI和BglII粘性末端相容)。然后，通过在50mM NaCl，10mM Tris pH7.5，1mM EDTA中混合下列两种寡核苷酸(SEQ ID NO31和SEQ ID NO32)，每种各100pmol，沸煮5分钟，再经超过2小时的时间缓慢冷却至室温，而将这两种寡核苷酸退火，得到含有SfiI和NotI位点的新多克隆位点，用来替代pPL2419-cat的多克隆位点(MCS)。
(下划线表示HindIII和KpnI相容位点，下划双线表示SfiI和NotI位点)(SEQ ID NO31)5’-CTGCAGCGGCCGCGGATCCGATATCGGGCCCTTAAGGCCA-3’(SEQ ID NO32)将已退火的寡核苷酸(2μl)连至经HindIII和KpnI切开的pPL2419-cat(0.2μg)中，得到p2419MCS5-cat。然后，利用枯草芽孢杆菌菌株A164Δ5染色体DNA(如实施例2所述制得)作模板，含有NotI和KpnI(Asp718)接头的下述引物(SEQ ID NO33和SEQ ID NO34)，如实施例2所述，PCR扩增amyE(GenBank Locus BSAMYL，接受号V00101，J01547)的942至1751位核苷酸，并插入经NotI和Asp718消化的p2419MCS5中，得到整合载体pCAsub2(图6)，CAsub是指氯霉素抗性，淀粉酶同系物，用于枯草芽孢杆菌类宿主。5’-GCGGCCGCGATTTCCAATGAG-3’(划线部分表示设计的NotI位点)(SEQ ID NO33)5’-GGTACCTGCATTTGCCAGCAC-3’(划线部分表示设计的Asp718I位点)(SEQ ID NO34)该载体独自整合至枯草芽孢杆菌168中，涂板于天青色淀粉顶层平板上，示出淀粉酶活性已完全丧失。
将amyQ启动子-amyM构建物作为SfiI-NotI盒从pSJ2882-MCS中切出，克隆至用同样的酶切开的pCAcub2中，得到完全整合载体pBAN-NOV(图7)。实施例9构建枯草芽孢杆菌供体菌株BW100构建能够保持和迁移基于pE194的“奴隶型”整合质粒，如实施例8中所述的pCAsub2(赋予氯霉素抗性并含有oriT)的合适供体菌株。这种供体菌株应有以下特征bac-1-，dal-缺失，含有pLS20或pX0503和基于pE194的“辅助”质粒(含有oriT和orf-beta，以迁移“辅助”和“奴隶型”质粒，还含有repF，以反式提供repF蛋白，从而使得“奴隶型”质粒能够复制并作为质粒复制子保持下去)(WO91/09129)。该菌株构建如下将可提供针对供体菌株的反筛选的辅助质粒pPL2541-tet(图8)转入枯草芽孢杆菌BW96中，得到枯草芽孢杆菌BW99。接下来，利用枯草芽孢杆菌BW97作为供体菌株，通过接合将质粒pXO503导入枯草芽孢杆菌BW99中。枯草芽孢杆菌BW97构建如下首先，将pXO503质粒从枯草芽孢杆菌MT101供体菌株中迁移至bac-1菌株枯草芽孢杆菌1A758中，在加有红霉素(5μg/ml)的TBAB平板上选择出转接合子(dal-供体菌株不能生长，因为培养基中不含D-丙氨酸)。这样得到了带有pXO503质粒的枯草芽孢杆菌bac-1-菌株。枯草芽孢杆菌MT101来自枯草芽孢杆菌DN1280，后者是含有dal基因缺失的枯草芽孢杆菌168的衍生菌株(Diderichsen，《芽孢杆菌分子遗传学和生物技术应用手册》，A.T.Ganesan和J.A.Hoch主编，学术出版社有限公司，纽约，1986)。
接下来，将实施例8中所述的两端为BamHI位点的cat基因盒(赋予氯霉素抗性)插入pCRII-dalΔ质粒的BamHI位点。该质粒用ScaI线性化，并转入含有接合质粒pXO503的bac-1菌株中，在加有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和氯霉素(5μg/ml)的TBAB平板上进行氯霉素抗性(经由双交换同源重组)筛选，得到bac-1，dalΔ∷cat接合有效供体菌株-枯草芽孢杆菌BW97。最后，枯草芽孢杆菌BW97与含有pPL2541-tet的枯草芽孢杆菌BW99接合，在加有D-丙氨酸(0.1mg/ml)，四环素(10μg/ml)和红霉素(5μg/ml)的TBAB平板上筛选出转接合子，得到供体菌株枯草芽孢杆菌BW100一种含有pXO503和辅助质粒pPL2541-tet的bac-1-，dal-缺失的枯草芽孢杆菌。实施例10枯草芽孢杆菌A164菌株中amyQ启动子-amyM盒的整合与扩增将实施例9所述含有位于pBAN-NOV中的amyQ启动子-amyM盒以及辅助质粒pPL2541-tet的枯草芽孢杆菌BW100供体菌株通过pLS20介导的接合(Battisti等，1985，出处同前)与枯草芽孢杆菌A164Δ3和枯草芽孢杆菌A164Δ5菌株进行接合。
在含有添加了5μg/ml氯霉素的10ml LB培养液的125ml摇瓶中培养枯草芽孢杆菌A164Δ3和Δ5转接合子连续两代，然后在45℃涂板，以阻断pPL254-tet辅助质粒的复制，并筛选出在amyE位点上具有整合质粒整合的克隆。整合子随后涂板于含浓度按15，30，45，60，和80μg/ml逐渐增高的氯霉素的培养基上，以选择出含抗氯霉素基因的amyQ启动子-amyM盒得到扩增的克隆。实施例11摇瓶培养转化了amyQ启动子-amyM盒的枯草芽孢杆菌A164菌株在含有50ml PS-1培养基的250ml摇瓶中，37℃，250rpm振荡培养含有染色体整合拷贝的amyQ启动子-amyM盒或只含有整合载体的枯草芽孢杆菌A164Δ3和枯草芽孢杆菌A164Δ5约4天。
培养大约50和100小时后，取培养物上清液制样；用终浓度为2mM的PMSF进行处理，冻存。为了估计NOVAMYLTM的表达，将上清液与等体积的2×Laemmli上样缓冲液混匀，立即沸煮，并上样于购自商家(NOVEX，圣地亚哥，加州)的14％或8-16％丙烯酰胺Tris-甘氨酸凝胶上，进行电泳。也将已知量的NOVAMYLTM标准样品上样于同一凝胶上，用来估计产生的NOVAMYLTM的量。有些情况下，利用麦芽三糖作底物来确定NOVAMYLTM的滴度。具体地说，取酶的样品与麦芽三糖在pH5.0，37℃时共温育30分钟。然后将pH调至大约11以终止反应。在标准条件下，用葡萄糖脱氢酶和NADH在340nm进行检测，可确定由麦芽三糖降解的葡萄糖和麦芽糖所产生的葡萄糖的量。已知量的NOVAMYLTM标准(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)用作对照。
结果显示，培养2天后，srfC未缺失菌株产生8厘米高的泡沫，而缺失了srfC的菌株只产生0.5厘米高的泡沫。在血琼脂平板上生长时，srfC缺失菌株不产生溶血，这证实了该菌株不产生枯草菌脂肽。这些结果进一步表明，两种菌株产生NOVAMYLTM的量相似，但srfC缺失菌株与未缺失菌株相比，前者产生的泡沫显著减少。实施例12枯草芽孢杆菌A164菌株的发酵在含有1.5升由典型碳源和氮源，矿物质盐，微量元素以及至少3ml/L抗起泡剂(Sigma混合型289，Sigma Chemical Company，圣·路易斯，MO)组成的培养基的3升发酵罐中，分别培养只整合/扩增了奴隶型质粒pCAsub2的枯草芽孢杆菌A164Δ3和枯草芽孢杆菌A164Δ5。培养物中以每分钟1.5升的速率通气，并用两个标准涡轮以1000至1500rpm的转速搅动。发酵温度保持在37℃至39℃。
通过测定由起泡作用带出发酵罐的液体体积来定量估计起泡量。按与实施例11所述相同的方法测定NOVAMYLTM活性。
结果表明，发酵5小时内，枯草芽孢杆菌A164Δ3开始产生泡沫，泡沫充满发酵罐上部的1.5升空间，并开始通过排气管溢出至收集瓶中。在10至20小时内，由于泡沫的溢出，使得发酵罐里的液体体积通常损失700至900ml。这个阶段过后，系统稳定下来，但发酵罐中只剩下初体积的45％至60％，这使得该菌株不适合用于大规模生产中。对枯草芽孢杆菌A164Δ5进行的类似发酵，由于在至少50小时的发酵时间内不产生泡沫，因此不丧失任何体积。每毫升发酵液中两种菌株产生的NOVAMYLTM的量相似。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Novo Nordisk Biotech，Inc.
(B)街道1445 Drew Avenue(C)城市Davis，California(D)国家美国(E)邮编(ZIP)95616-4880(F)电话(916)757-8100(G)传真(916)758-0317(ii)发明名称在芽孢杆菌细胞突变体中生产多肽的方法(iii)序列数目34(iv)联系地址(A)地址Novo Nordisk of North Americ(B)街道405 Lexington Avenue-64th Fl.
(C)城市New York(D)州NY(E)国家美国(F)邮编(ZIP)10174(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)当前申请信息(A)申请号(B)申请日1997年6月12日(C)分类号(vii)代理人/代理机构信息
(A)姓名Lambiris，Elias J(B)登记号33,728(C)参考/文档号5111.204-WO(viii)联系信息(A)电话212-878-9652(B)电传212-878-9655(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGCTCACAG AGATACGTGG GC 22(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2GGATCCACAC CAAGTCTGTT CAT 23(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO3O GGATCCGCTG GACTCCGGCT G 21(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO4AAGCTTATCT CATCCATGGA AA 22(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO5AAGCTTAGGC ATTACAGATC 20(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO6CGGATCTCCG TCATTTTCCA GCCCGATGCA GCC33(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO7GGCTGCATCG GGCTGGAAAA TGACGGAGAT CCG 33(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO8GATCACATCT TTCGGTGG 18(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO9CGTTTATGAG TTTATCAATC 20(2)SEQ ID NO10的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO10AGACTTCCCA GTTTGCAGGT 20(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO11CAAACTGGGA AGTCTCGACG GTTCATTCTT CTCTC35(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO12TCCAACAGCA TTCCAGGCTG 20(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征
(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO13GCGAATTCTA CCTAAATAGA GATAAAATC 29(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO14GTTTACCGCA CCTACGTCGA CCCTGTGTAG CCTTGA 36(2)SEQ ID NO15的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO15TCAAGGCTAC ACAGGGTCGA CGTAGGTGCG GTAAAC 36(2)SEQ ID NO16的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO16GCAAGCTTGA CAGAGAACAG AGAAGCCAG29(2)SEQ ID NO17的资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO17CGTCGACGCC TTTGCGGTAG TGGTGCTT 28(2)SEQ ID NO18的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO18CGCGGCCGCA GGCCCTTAAG GCCAGAACCA AATGAA36(2)SEQ ID NO19的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO19TGGCCTTAAG GGCCTGCGGC CGCGATTTCC AATG 34(2)SEQ ID NO20的资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO20GAAGCTTCTT CATCATCATT GGCATACG 28(2)SEQ ID NO21的资料(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO21AAGCTTTGAA TGGGTGTGG 19(2)SEQ ID NO22的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO22CCGCTTGTTC TTTCATCCCC TGAAACAACT GTACCG 36(2)SEQ ID NO23的资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO23CAGTTGTTTC AGGGGATGAA AGAACAAGCG GCTG 34(2)SEQ ID NO24的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO24CTGACATGAG GCACTGAC 18(2)SEQ ID NO25的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO25TTTGGCCTTA AGGGCCTGCA ATCGATTGTT TGAGAAAAGA AG42(2)SEQ ID NO26的资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO26TTTGAGCTCC ATTTTCTTAT ACAAATTATA TTTTACATAT CAG 43(2)SEQ ID NO27的资料(i)序列特征(A)长度58个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO27AGCTAGGCCT TAAGGGCCCG GGACGTCGAG CTCAAGCTTG CGGCCGCCAT GGTCGACG 58(2)SEQ ID NO28的资料(i)序列特征(A)长度57个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO28AATTCGTCGA CCATGGCGGC CGCAAGCTTG AGCTCGACGT CCCGGGCCCT TAAGGCC 57(2)SEQ ID NO29的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO29CTGAGCTCTA CGAAAGGAGA CACACATGC 29(2)SEQ ID NO30的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO30ACGCCCAGCT GTTTAAGATA AG 22(2)SEQ ID NO31的资料(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO31AGCTTGGCCT TAAGGGCCCG ATATCGGATC CGCGGCCGCT GCAGGTAC 48(2)SEQ ID NO32的资料(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO32CTGCAGCGGC CGCGGATCCG ATATCGGGCC CTTAAGGCCA 40(2)SEQ ID NO33的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO33GCGGCCGCGA TTTCCAATGA G 21(2)SEQ ID NO34的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO34GGTACCTGCA TTTGCCAGCA C 2权利要求
1.一种生产多肽的方法，包括(a)在有利于该多肽生产的条件下培养芽孢杆菌细胞的突变细胞，其中，(i)该突变细胞包含第一种核酸序列和第二种核酸序列，所述第一种核酸序列编码所述多肽，所述第二种核酸序列中含有负责枯草菌脂肽或其同种型生产的、选自srfA、srfB、srfC、srfD和sfp基因中的至少一种基因的修饰，(ii)在相同条件下培养时，与芽孢杆菌细胞相比，该突变细胞产生的枯草菌脂肽或其同种型要少，并且(iii)该多肽是芽孢杆菌细胞的异源多肽；和(b)从培养基中分离多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌细胞是嗜碱芽孢杆菌细胞，解淀粉芽孢杆菌细胞，短芽孢杆菌细胞，环状芽孢杆菌细胞，凝结芽孢杆菌细胞，坚强芽孢杆菌细胞，灿烂芽孢杆菌细胞，迟缓芽孢杆菌细胞，地衣芽孢杆菌细胞，巨大芽孢杆菌细胞细胞，短小芽孢杆菌细胞，嗜热脂肪芽孢杆菌细胞，枯草芽孢杆菌细胞，或苏云金芽孢杆菌细胞。
3.权利要求2的方法，其中，所述芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
4.权利要求3的方法，其中，所述枯草芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌ATCC 6051或枯草芽孢杆菌ATCC 6051A。
5.权利要求3的方法，其中，所述枯草芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌NCFB 736。
6.权利要求1的方法，其中，所述基因是srf操纵子基因。
7.权利要求6的方法，其中，所述基因是srfA。
8.权利要求6的方法，其中，所述基因是srfB。
9.权利要求6的方法，其中，所述基因是srfC。
10.权利要求6的方法，其中，所述基因是srfD。
11.权利要求1的方法，其中，所述基因是sfp。
12.权利要求1的方法，其中，在同等条件下培养时，所述突变细胞比芽孢杆菌细胞生产的枯草菌脂肽或其同种型至少少约25％。
13.权利要求1的方法，其中，所述修饰导致产生枯草菌脂肽或其同种型的不起泡变体。
14.权利要求1的方法，其中，所述多肽是芽孢杆菌细胞的异源多肽。
15.权利要求1的方法，其中，所述突变还包含编码蛋白酶的一或多个基因的修饰。
16.权利要求15的方法，其中，所述基因是nprE和/或aprE。
17.权利要求1的方法，其中，所述突变还包括对spoIIAC和/或amyE基因的修饰。
18.一种相应亲本芽孢杆菌细胞的突变体，其包含第一种核酸序列和第二种核酸序列，所述第一种核酸序列编码异源多肽，所述第二种核酸序列中含有负责枯草菌脂肽或其同种型生物合成或分泌的至少一种基因的修饰，其中，在相同条件下培养时，与芽孢杆菌细胞相比，该突变体产生的枯草菌脂肽或其同种型要少。
19.一种芽孢杆菌细胞的突变体，其包含至少两个拷贝的第一种核酸序列和第二种核酸序列，所述第一种核酸序列编码天然多肽，所述第二种核酸序列中含有负责枯草菌脂肽或其同种型生物合成或分泌的至少一种基因的修饰，其中，在相同条件下培养时，与芽孢杆菌细胞相比，该突变体产生的枯草菌脂肽或其同种型要少。
20.获得权利要求19的突变体的方法，包括(a)向芽孢杆菌细胞内引入含负责枯草菌脂肽或其同种型生物合成或分泌之至少一个基因的修饰的第一种核酸序列，以及编码芽孢杆菌细胞异源多肽的第二种核酸序列；和(b)鉴定出步骤(a)中包含所述核酸序列的突变体。
21.获得权利要求19的突变体的方法，包括(a)向芽孢杆菌细胞内引入含负责枯草菌脂肽或其同种型生物合成或分泌之至少一个基因的修饰的第一种核酸序列，以及编码该芽孢杆菌细胞天然多肽的第二种核酸序列；和(b)鉴定出步骤(a)中包含所述核酸序列的突变体。
全文摘要
本发明涉及多肽的生产方法,该方法包括:(a)在有利于生产多肽的条件下培养芽孢杆菌细胞的突变体,其中,该突变体(i)包含两种核酸序列,其中第一种核酸序列编码所述多肽,第二种核酸序列包含负责枯草菌脂肽或其同种型生物合成或分泌的至少一种基因的修饰,(ii)在同等条件下培养时,与芽孢杆菌细胞相比,该突变体产生的枯草菌脂肽或其同种型要少;和(b)从培养基中分离多肽。本发明也涉及芽孢杆菌细胞的突变体及产生突变体的方法。
文档编号C07K14/32GK1240482SQ97180644
公开日2000年1月5日 申请日期1997年11月18日 优先权日1996年11月18日
发明者A·斯洛马, D·斯特恩比格, L·F·阿达斯, S·布朗 申请人:诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司