一种抗炎环肽Cyclosquamosin D的化学合成方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及医药技术领域，是环（亮氨酰-丝氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘 氨酰-甘氨酰-缬氨酰）肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 环肽 Cyclosquamosin D 是 TNF 和 IL-6 的抑制剂，具有抗炎作用（1^;1^:]\481·;^· Food Chem. 2008, 56, 386-392)。目前关于环肤Cyclosquamosin D功能性方面的研究是一 个热点方向。但是市场上对环肽Cyclosquamosin D的合成方法仍处于初级阶段，本发明可 以有效的提高产物的成功率和收率，降低合成的成本。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种固相合成环肽Cyclosquamosin D的方法。本发明的技 术方案为：环肽Cyclosquamosin D的一种固相合成方法，包括以下步骤：
[0004] 1.以Fm〇C-Val-OH等为原料合成直链八肽亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔 丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酸。
[0005] 2.使用PyBop，HOBt和DIEA体系对直链肽进行液相环合，最后在TFA/DCM (1 : 4) 作用下脱去保护基得到环肽Cyclosquamosin D。
[0006] 具体反应步骤为：
[0007] (l)Fmoc-Val-OH和2-氯三苯甲基氯树脂溶解到适量的二氯甲烷中，加入DIPEA， 室温搅拌反应lh，合成的N-芴甲氧羰基缬氨酸-2-氯三苯甲酯再经过20%的哌啶脱保护 得到缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂。
[0008] ⑵将Fmoc-Gly-ΟΗ加入到缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂溶液中，室温搅拌，再加入 DMF，DCC，HOBt，反应4h，得到N-芴甲氧羰基甘氨酰-缬氨酸2-氯三苯甲酯树脂，经过20 % 的哌啶脱保护后得到甘氨酰-缬氨酸2-氯三苯甲酯树脂。后面的6个氨基酸按相同的方 法依次反应生成带有直链八肽的树脂，亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪 胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂树脂。
[0009] (3)用乙酸/三氟乙酸/二氯甲烷（1 : 2 : 16)体系将直链八肽从树脂上切下， 得到直链八肤 NH2-Leu-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Tyr (tBu) -Pr〇-Gly-Gly-Val-C00H。
[0010] (4)将直链八肤 NH2-Leu-Ser (tBu)-Tyr (tBu)-Tyr (tBu)-Pr〇-Gly-Gly-Val-C00H 溶于二氯甲烷，加入PyBop，HOBt，DIEA，冰浴下搅拌反应，生成环（亮氨酰-丝氨酰（叔丁 基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰）肽。
[0011] (5)将环（亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯 氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰）肽，在TFA/DCM(1 : 4)作用下脱去保护基得到环肽 Cyclosquamosin D〇
[0012] 本发明中的一些缩写具有以下含义：
[0013] Fmoc :荷甲氧羰基
[0014] DMF :N，N-二甲基甲酰胺
[0015] DCC :二环己基碳二亚胺
[0016] HOBt : 1-羟基苯并三唑
[0017] PyBop :六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
[0018] DIEA:二异丙基乙胺
[0019] TFA:三氟乙酸
[0020] DCM:二氯甲烷
[0021] Sephadex LH-20 :轻丙基葡聚糖凝胶
[0022] NH2-Leu-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Tyr (tBu) -Pro-Gly-Gly-Val-COOH :亮氨醜-丝氨醜 (叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酸
[0023] 合成路线如下：
[0024]
[0025] Scheme 1. Reagents and conditions ： (a) (i) Fmoc-Val-〇H/DCM, DIPEA, lh(ii)20 % piperidine/DMF,2h ； (b) (i)Fmoc-aa-〇H/DMF, DCC, HOBt,4h(ii)20 % piperidine/DMF,2h ； (c)Ac0H/TFE/DCMl ： 2 ： 16,lh(70%).
[0026]
[0027] Scheme 2. Reagents and conditions ：(d)PyBop, HOBt, DIEA, DCM,0°C (82% )； (e)TFA/DCM(l ： 4)(/8%).
【具体实施方式】：
[0028] 实施例1，参照合成路线schemel，Fmoc-Val-OH(507mg，1. 5eq)，2-氯三苯甲基氯 树脂（lg，）溶解在无水DCM(20mL)中，加入DIPEA(0.52mL，3eq)，室温反应lh，用甲醇和二 氯甲烷洗涤树脂，干燥后加入20%的哌啶（20mL)室温搅拌反应3h，脱去Fmoc，再用二氯甲 烷（20mL)洗涤树脂，真空干燥，得到缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂。将Fmoc-甘氨酸（450mg， 1.5eq)溶于DMF(lOmL)和DCM(lOmL)中，用H0Bt(304mg)活化，再将该溶液加入到缬氨 酸-2-氯三苯甲酯树脂中，冰浴下加入DCC(464mg)，然后撤去冰浴，室温反应4h。再用上 述相同的方法脱去Fmoc。后面的氨基酸用相同的方法连接上去，最后得到含有直链八肽的 树脂，亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨 酰-甘氨酰-缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂树脂。将获得的树脂在乙酸/三氟乙酸/二氯甲 烷1 : 2 : 16(20mL)中室温反应lh，过滤，树脂用DCM(15mL)洗涤3次，滤液真空浓缩，可 得直链八肽亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘 氨酰-甘氨酰-缬氨酸。
[0029] 实施例2,参照合成路线scheme2,将HOBt (329mg，溶于少量无水DMF)， PyB0P(l. 27g)和DIPEA(0. 49mL)溶于无水DCM中倒入圆底烧瓶，将直链八肽亮氨酰-丝氨 酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酸 溶于DCM(0. 5mg/mL)，0°C下滴加到圆底烧瓶中，快速搅拌，滴加完后室温搅拌反应过夜。蒸 去溶剂，用S印hadex LH-20处理得到固体环（亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁 基）_酪胺酰（叔丁基）_脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰）肽。得到的环肽加入TFA/ DCM(1 : 4,20ml)室温搅拌lh，脱去tBu保护基得到环肽Cyclosquamosin D粗品。粗品用反 相 HPLC(RP-HPLC)纯化，流动相用 water/acetonitrilel : 1，可获得纯的 Cyclosquamosin D〇
【主权项】
1.环（亮氨酰-丝氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰）肽的 合成方法包括以下步骤： (1) 将N-芴甲氧羰基缬氨酸溶解在二氯甲烷中，加入2-氯三苯甲基氯树脂，N，N-二异 丙基乙胺，室温搅拌反应lh，生成的N-芴甲氧羰基缬氨酸-2-氯三苯甲酯经过20%的哌啶 脱保护得到缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂。 (2) 将N-芴甲氧羰基甘氨酸加入到缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂溶液中，室温搅拌，再 加入二环己基碳二亚胺，1-羟基苯并三唑和N，N-二甲基甲酰胺，反应4h，得到N-芴甲氧羰 基甘氨酰-缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂，该产物再经过20 %的哌啶脱保护得到甘氨酰-缬 氨酸-2-氯三苯甲酯树脂。后面的6个氨基酸按相同的方法依次反应生成带有直链八肽的 树脂，亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨 酰-甘氨酰-缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂。 (3) 将亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘 氨酰-甘氨酰缬氨酸-2-氯三苯甲酯树脂用乙酸/三氟乙酸/二氯甲烷1 : 2 : 16脱去 2_氯三苯甲基氯树脂，得到直链八肽亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺 酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酸。 (4) 将直链八肽亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯 氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酸溶于二氯甲烷，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡 咯烷基，1-羟基苯并三唑和二异丙基乙胺，冰浴下搅拌反应，生成环（亮氨酰-丝氨酰（叔 丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰）肽。 (5) 将环（亮氨酰-丝氨酰（叔丁基）_酪胺酰（叔丁基）_酪胺酰（叔丁基）_脯 氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰）肽，在TFA/DCM(1 : 4)作用下脱去保护基得到环肽 CyclosquamosinD〇
【专利摘要】本发明涉及环(亮氨酰-丝氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰)肽的一种合成方法。主要合成步骤：a.将Fmoc-Val-OH引入到2-氯三苯甲基氯树脂后，利用Fomc氨基酸保护与哌啶脱Fmoc保护策略，固相合成直链八肽NH2-Leu-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Val-COOH。b.利用PyBOP/HOBt/DIPEA体系对得到的直链肽进行液相环合，再利用TFA/DCM(1∶4)脱去叔丁基保护即可得到目标环(亮氨酰-丝氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-缬氨酰)肽。本发明具有有效的提高产物的成功率和收率，降低合成的成本的优点。
【IPC分类】C07K1/04, C07K1/06, C07K7/64
【公开号】CN105440110
【申请号】CN201410471159
【发明人】孙良玉, 夏斌
【申请人】上海翱博生物科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月16日