专利名称：一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测TYMS mRNA基因表达量的试剂盒及方法。
背景技术：
氟尿嘧啶(Fluorouraci 1，5_FU)是第一个抗代谢药物，也是目前临床上应用最广泛的抗嘧啶类药物。它对消化道肿瘤及其他实体瘤均有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。5-FU本身没有抗肿瘤活性，当其进入人体后，可被转化为活性代谢产物:一磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUMP)、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUTP)和三磷酸氟尿嘧啶(FUTP)，进而产生抗肿瘤活性。除5-FU，氟类药物还包括替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等。TYMS (Thymidylate Synthetase，TS)基因编码的胸苷酸合成酶，是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是5-FU发挥细胞毒作用的目标酶。5-FU转化为FdUMP后，与TS、5，10-亚甲基四氢叶酸结合形成三联复合物，dUMP与TS结合后转化为脱氧胸腺嘧啶核苷dTMP，使DNA合成受限。多种肿瘤的临床研究均显示TYMS mRNA表达水平与5-FU疗效密切相关，例如:结直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等。临床研究表明，低TYMS mRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长。反之，TYMS高表达的患者接受氟类治疗疗效较差(Yasumatsua R et al.Chemotherapy.2009;55:36-41.) 荧光定量PCR技术的出现，为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞(来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等)中TYMS mRNA的表达量，用于临床医生对氟尿类的合理化使用。
发明内容
本发明旨在提供一种检测TYMS基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒及方法，能简单快速、准确可靠的检测TYMS基因。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为:
一种检测TYMS基因表达量的荧光定量PCR试剂盒，包含以下组成部分:
(I )TYMS基因标准品:含有TYMS基因编码序列的重组载体，所述TYMS基因编码序列如SEQ ID N0.1 所示；
(2)检测TYMS基因的上、下游引物:
TYMS-上游引物:5’ - CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’ (SEQ ID N0.2)TYMS-下游引物:5，- ATGGCATGGAGGCAGCG -3，(SEQ ID N0.3)
进一步，所述含有TYMS基因编码序列的重组载体的空载体为pUC57载体；
进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT) ,dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5X逆转录缓冲液(有浓度为50mmol/L、pH 为 8.0 的 Tris-HCl、浓度为 SOmmoI /I,的 KCl、浓度为 4 mmol /I,的 MgC12 和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成)等；所述逆转录引物Oligo-(dT)为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液为dATP (脱氧腺苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR缓冲液为常规定量PCR缓冲液，如5 X定量PCR缓冲液(由浓度为lOmmol/L，pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl和浓度为2 mmol/L的MgC12组成)等。本发明还提供了基于上述试剂盒检测TYMS mRNA基因表达量的方法，包括以下步骤:
(O从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA ；· (2)分别将已知拷贝数的TYMS基因标准品倍比稀释至108、IO7,IO6, ΙΟ5、104、IO3,102、10个拷贝数/ μ 1 ；
(3)分别以步骤(I)所制备的待测CDNA及步骤(2)倍比稀释的TYMS基因标准品为模板，加入检测TYMS基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR ；
(4)由于模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，因此，根据倍比稀释的TYMS基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制TYMS基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的TYMS基因的初始拷贝数进行定量分析，从标准曲线上读取其含有的TYMS基因的初始拷贝数。进一步，所述步骤(3)的PCR扩增条件为:95°C预变性3分钟，然后95°C变性30秒、57°C退火40秒，共38个循环。本发明的定量PCR检测试剂盒，能够灵敏、特异、准确地同时检测TYMS基因，适用于临床上对氟尿类疗效反应的评价，利于临床医生对治疗方案做出合理的选择。
图1为本发明/m 基因的标准曲线；
图2为本发明/7# 基因的溶解曲线；
图3为本发明/7# 基因的扩增曲线。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。一、TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的配置
本实施例的TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分:
1)TYMS基因标准品:含有TYMS基因编码序列(GeneBank编号为匪001071.2的第649位至第728位碱基)的重组pUC57载体；
2)检测TYMS基因的上、下游引物:
TYMS-上游引物:5’ - CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’ (SEQ ID N0.2)TYMS-下游引物:5，- ATGGCATGGAGGCAGCG -3，(SEQ ID N0.3)；
3) 5X逆转录缓冲液，浓度为lOpmol/μ I的逆转录引物Olig0-(dT) 16，浓度为20pmol/ μ I的dNTPs溶液，浓度为IOU/ μ I的M-MLV逆转录酶，5 X定量PCR缓冲液，浓度为2U/ μ I的TaqDNA聚合酶。其中，TYMS基因标准品由以下方法制得:
a)直接合成获得含有TYMS基因编码序列的片段DNA；
b)经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，克隆至PUC57载体进行连接；
c)连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆；
d)提取重组质粒，即得分别含有TYMS基因编码序列的重组PUC57载体。此外，逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶均为RT-PCR的常规试剂，故本发明的检测试剂盒也可以不包括上述常规试剂。二、TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测
本实施例的TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
(1)从待测外周血、肿瘤组织、穿刺标本或其它标本中提取总RNA，测RNA的浓度；
(2)将所得RNA逆转录为cDNA，转录体系如表I所示:
表I
权利要求
1.一种检测TYMS mRNA基因表达量的试剂盒，其特征在于:包括以下组成部分: (I )TYMS基因标准品:含有TYMS基因编码序列的重组载体，所述TYMS基因编码序列如SEQ ID N0.1 所示； (2)检测TYMS基因的上、下游引物: TYMS-上游引物:5’ - CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’ ； TYMS-下游引物:5，- ATGGCATGGAGGCAGCG -3，。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述重组载体的空载体为PUC57载体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。
4.一种基于权利要求1至3任一项所述试剂盒检测TYMS mRNA基因表达量的方法，包括如下步骤: (O从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA ； (2)分别将已知拷贝数的TYMS基因标准品倍比稀释至108、IO7,IO6, ΙΟ5、104、IO3,102、10个拷贝数/ μ I ； (3)分别以步骤(I)所制备的待测CDNA及步骤(2)倍比稀释的TYMS基因标准品为模板，加入检测TYMS基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR ； (4)根据倍比稀释的TYMS基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制TYMS基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的TYMS基因的初始拷贝数。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)的PCR扩增条件为:95°C预变性3分钟，然后95°C变性30秒、57°C退火40秒，共38个循环。
全文摘要
本发明公开了一种检测TYMS mRNA基因表达量的试剂盒及方法。该试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系。通过该方法能准确、快速、定量地确定TYMS基因表达量。本发明所述方法和试剂盒应用在临床中，有利于医生合理化选择氟类药物进行治疗。
文档编号C12Q1/68GK103088122SQ20121052130
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者郭成贤, 张伟, 陈小平, 刘昭前, 周宏灏 申请人:周宏灏