专利名称：一种检测 RRM1 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测RRMl mRNA基因表达量的试剂盒及方法。
背景技术：
吉西他滨(Gemcitabine)为脱氧胞嘧啶核苷的类似物，为核苷酸还原酶抑制剂。属细胞周期特异性抗代谢类化疗药，主要作用于S期(DNA合成期)的肿瘤细胞，同时也阻断细胞周期由Gl期(DNA合成前期)向S期过渡。吉西他滨作为一种前体药在细胞内是脱氧胸苷激酶磷酸化的底物，在酶的作用下转化成活性代谢物dFdCDP (吉西他滨二磷酸盐)和dFdCTP (吉西他滨三磷酸盐)。dFdCDP可抑制核糖核苷酸还原酶(ribonucleotidereductase, RR),导致dFdCTP大量积聚。dFdCTP则与dCTP竞争结合进入DNA链，插入至DNA链中脱氧胞苷的位点，并允许鸟苷与其配对，使其免受核糖核酸外切酶的移除修复，造成DNA链合成停止，进而导致DNA断裂、细胞死亡，达到治疗肿瘤的目的。临床上主要用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌·、膀胱癌、乳腺癌和其他实体肿瘤。RRMl基因(定位于I号染色体短臂)编码核糖核苷酸还原酶Ml亚单位(RRMl)。核糖核苷酸还原酶(RR)参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核酸的过程，是DNA合成通路中的限速酶。RRMl是吉西他滨作用的靶点之一。所有肿瘤细胞中都存在RRMl表达，而且表达水平差异很大。临床研究显示，患者RRMl表达水平与吉西他滨的疗效相关，RRMl mRNA低表达的非小细胞肺癌患者经吉西他滨治疗疗效较好，中位生存期较长(Bepler G et al.J Clin Oncol.2006; 24(29): 4731-4737; Reynolds C et al.J Clin Oncol.2009;27(34):5808-15.)。RRMl mRNA也可以预测乳腺癌、胰腺癌、胆管癌患者的化疗受益情况及预后(Jordheim LP et al.Lancet Oncol.2011; 12(7): 693-702.)。因此，美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南(第二版，2010)中指出:非小细胞肺癌患者RRMl的表达与吉西他滨的疗效密切相关，在吉西他滨用药前应进行RRMl基因表达水平的检测(NCCNClinical Practice Guidelines in Oncology for NSCLC.V2.2010)。因此，对 RRMl 表达量实时、准确、定量地检测，有利于临床医生及时、准确、合理的制定个体化治疗方案。荧光定量PCR技术的出现，为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞(来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等)中RRMl mRNA的表达量，用于临床医生对吉西他滨的合理化使用。
发明内容
本发明旨在提供一种检测RRMl基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒，能简单快速、准确可靠的检测RRMl基因。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为:
一种检测RRMl基因表达量的荧光定量PCR试剂盒，包含以下组成部分:(1)RRMl基因标准品:含有RRMl基因编码序列的重组载体，所述RRMl基因编码序列如SEQ ID N0.1 所示；
(2)内对照P-actin基因标准品:含有P-actin基因编码序列的重组载体，所述3 -actin基因编码序列如SEQ ID N0.2所不；
(3)检测RRMl基因的上、下游引物:
RRMl-上游引物:5’ - CTGGAAGCAGGGTTTGAAGAC -3’ (SEQ ID N0.3)
RRMl-下游引物:5’ - GATTGGATTAGCCGCTGGTC -3’ (SEQ ID N0.4)
(4)检测P-actin基因的上、下游引物:
3-actin -上游引物:5，- CTCGCCTTTGCCGATCC -3，(SEQ ID N0.5)
3-actin -下游引物:5，- CATGCCGGAGCCGTTG -3，(SEQ ID N0.6)
进一步，所述含有RRMl基因编码序列的重组载体和含有P -actin基因编码序列的重组载体的空载体均为PUC57载体；
进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT) ,dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5X逆转录缓冲液(有浓度为50mmol/L、pH 为 8.0 的 Tris-HCl、浓度为 SOmmoI /I,的 KCl、浓度为 4 mmol /I,的 MgC12 和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成)等；所述逆转录引物Oligo-(dT)为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液为dATP (脱氧腺苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR缓冲液为常规定量PCR缓冲液，如5 X定量PCR缓冲液(由浓度为lOmmol/L，pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl和浓度为2 mmol/L的MgC12组成)等。本发明还提供了基于上述试剂盒检测RRMl mRNA基因表达量的方法，包括以下步骤:
(1)从待测标本(肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等)中提取细胞总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo- (dT) ,dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA ；
(2)分别将已知拷贝数的RRMl基因标准品和内对照P-actin基因标准品倍比稀释至108、107、IO6、105、IO4、103、IO2UO 个拷贝数 /u I ；
(3)分别以步骤(I)所制备的待测cDNA及步骤(2)倍比稀释的RRMl基因标准品为模板，加入内对照P -actin基因标准品，检测RRMl基因的上、下游引物，检测内对照P -actin基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR ；
(4)由于模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，因此，根据倍比稀释的RRMl基因标准品和内对照P-actin基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制RRMl基因和内对照P -actin基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的RRMl基因和内对照P -actin基因的初始拷贝数进行定量，从标准曲线上读取其含有的RRMl基因和内对照P -actin基因的初始拷贝数。进一步，所述步骤(3)的PCR扩增条件为:95°C预变性3分钟，然后95°C变性30秒、57°C退火40秒，共40个循环。本发明的定量PC R检测试剂盒由于选择了合适的引物，制备了合适的RRMl基因标准品和内对照P-actin基因标准品，能够灵敏、特异、准确地同时检测RRMl基因，适用于临床上对吉西他滨疗效反应的评价，利于临床医生对治疗方案做出合理的选择。
图1为本发明7 //基因的标准曲线；
图2为本发明RRMl基因的溶解曲线；
图3为本发明7 //基因的扩增曲线。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。一、RRMl基因的荧光定量PCR检测试剂盒的配置
本实施例的RRMl基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分:
1)RRMl基因标准品:含有RRMl基因编码序列(GeneBank编号为NM_001033.3的第2500位至第2564位碱基)的重组pUC57载体；
2)内对照P-actin基因标准品:含有P-actin基因编码序列(GeneBank编号为NM_001101.3的第37位至第133位碱基)的重组pUC57载体；
3)检测RRMl基因的上、下游引物:
RRMl-上游引物:5’ - CTGGAAGCAGGGITTGAAGAC-3’ (SEQ ID N0.2)
RRMl-下游引物:5’ - GATTGGATTAGCCGCTGGTC-3’ (SEQ ID N0.3)；
4)检测内对照P-actin基因的上、下游引物:
3-actin -上游引物:5，- CTCGCCTTTGCCGATCC-3’
3-actin -下游引物:5’ - CATGCCGGAGCCGTTG-3’ ；
5)5X逆转录缓冲液，浓度 为lOpmol/ill的逆转录引物01igo-(dT)16，浓度为20pmol/ u I的dNTPs溶液，浓度为IOU/ U I的M-MLV逆转录酶，5 X定量PCR缓冲液，浓度为2U/ ill的TaqDNA聚合酶。其中，RRMl和内对照@ _actin基因标准品由以下方法制得:
a)直接合成获得含有RRMl和P-actin基因编码序列的片段DNA;
b)经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，克隆至PUC57载体进行连接；
c)连接产物转化大肠杆菌DH-5a感受态细胞，筛选阳性克隆；
d)提取重组质粒，即得分别含有RRMl和P-actin基因编码序列的重组pUC57载体。此外，逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶均为RT-PCR的常规试剂，故本发明的检测试剂盒也可以不包括上述常规试剂。二、RRMl基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测
本实施例的RRMl基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
(1)从待测外周血、肿瘤组织、穿刺标本或其它标本中提取总RNA，测RNA的浓度；
(2)将所得RNA逆转录为cDNA，转录体系如表I所示:
表I
权利要求
1.一种检测RRMl mRNA基因表达量的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括以下组成部分: (1)RRMl基因标准品:含有RRMl基因编码序列的重组载体，所述RRMl基因编码序列如SEQ ID N0.1 所示； (2)内对照P-actin基因标准品:含有P-actin基因编码序列的重组载体，所述3 -actin基因编码序列如SEQ ID N0.2所不； (3)检测RRMl基因的上、下游引物: RRMl-上游引物:5’ - CTGGAAGCAGGGTTTGAAGAC -3’ ；RRMl-下游引物:5’ - GATTGGATTAGCCGCTGGTC -3’ ； (4)检测P-actin基因的上、下游引物: 3-actin-上游引物:5，- CTCGCCTTTGCCGATCC -3，； 3-actin-下游引物:5，- CATGCCGGAGCCGTTG -3，。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述含有RRMl基因编码序列的重组载体和含有0 -actin基因编码序列的重组载体中的空载体均为pUC57载体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。
4.一种基于权利要求1至3任一项所述试剂盒检测RRMl mRNA基因表达量的方法，包括如下步骤: (1)从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA ； (2)分别将已知拷贝数的RRMl基因标准品和内对照P-actin基因标准品倍比稀释至108、107、IO6、105、IO4、103、IO2UO 个拷贝数 /u I ； (3)分别以步骤(I)所制备的待测cDNA及步骤(2)倍比稀释的RRMl基因标准品为模板，加入内对照P -actin基因标准品，检测RRMl基因的上、下游引物，检测内对照P -actin基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR ； (4)根据倍比稀释的RRMl基因标准品和内对照P-actin基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制RRMl基因和内对照P -actin基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的RRMl基因和内对照P -actin基因的初始拷贝数。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)的PCR扩增条件为:95°C预变性3分钟，然后95°C变性30秒、57°C退火40秒，共40个循环。
全文摘要
本发明公开了一种检测RRM1 mRNA基因表达量的试剂盒及方法。该试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系。通过该方法能准确、快速、定量地确定RRM1基因表达量。本发明所述方法和试剂盒应用在临床中，有利于医生合理化选择吉西他滨进行治疗。
文档编号C12Q1/68GK103088121SQ20121052116
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者郭成贤, 张伟, 陈小平, 刘昭前, 周宏灏 申请人:周宏灏