一种小牛血去蛋白提取物组合物及其注射剂和制法
【专利摘要】本发明公开了一种小牛血去蛋白提取物的制法，包括如下步骤：a)缓化；b)酸沉；c)低温冷冻、升温溶解、离心，取上清液；d)碱沉；e)重复c)步骤；f)将步骤e)的上清液醇沉、离心，取上清液；g)将步骤f)的上清液超滤、真空浓缩，得浓缩超滤液；h)将步骤g)的浓缩超滤液超滤，收集超滤液，即得。本发明所提供的制法，既不破坏生物活性、又不引入外源离子、能有效去除其中杂蛋白；由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，不会引发过敏反应，安全度高，能有效治疗脑中风、脑外伤、脑功能不全及脑痴呆等脑细胞代谢障碍性疾病，改善细胞氧含量和微循环；注射剂的制备方法，能充分保证最终产品的质量稳定性和安全度，保证制剂的药用效果，消除现有制剂的副作用。
【专利说明】一种小牛血去蛋白提取物组合物及其注射剂和制法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，特别涉及一种小牛血去蛋白提取物及其注射剂和制法。 技术背景
[0002] 小牛血去蛋白提取物水针剂，曾用名：血活素注射液，系由新鲜小牛血或血清经去 蛋白、浓缩、超滤或透析等工艺制得的含有无机物及小分子有机物的灭菌水溶液。可增强组 织细胞对氧及葡萄糖摄取与利用，改善细胞乏氧状态和机体内环境，增加心、脑、肝等脏器 的血流量，改善微循环。用于脑缺血、脑痴呆、脑外伤及大脑功能不全等脑细胞代谢障碍性 疾病的治疗。目前，已公开了一些有关小牛血去蛋白提取物的制备工艺，多数工艺采用乙醇 沉淀、酶解、高温、酸碱等方法去除杂蛋白，也有用柱层析除杂的方法。这些方法都存在去除 蛋白不完全的问题，临床使用时会由于杂蛋白未有效去除而发生不良反应，其中的有机物 类物质如氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等发生聚合为大分子物质而易引起过敏反应；而且酶 解、高温、酸碱等方法去除杂蛋白时，还存在破坏其中原有的生物活性、降低其药用价值的 缺点；另外，酸碱法去除杂蛋白还会引入外源离子，这都会降低其药用价值；另外，由于工 艺重现性不好，而难以大规模生产。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种既不破坏生物活性、又不引入外源离子、能有效去除其 中杂蛋白的的小牛血去蛋白提取物的制法，及由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂及制 法。
[0004] 本发明的小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0005] a)将小牛血在30-40°C缓化20min，得缓化后的小牛血；
[0006] b)向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至3. 5? 4.0,得酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为36%?38%的盐酸按照 1:1的体积比配制的；
[0007] c)将步骤b)得到的酸化后的小牛血在_25°C下低温冷冻24h，然后再以1°C /min 的升温速度升温至60°C，并60°C恒温lh，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为15000 转/分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用；
[0008] d)向步骤C)得到的上清液中加入质量分数为20%的NaOH溶液，调节pH值至 8. 0?8. 5,得碱化后的上清液；
[0009] e)将步骤d)得到的碱化后的上清液在-20°c下低温冷冻24h，然后再以1°C /min 的升温速度升温至40°C，并40°C恒温lh，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为13000 转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；
[0010] f)将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照上清液 与乙醇溶液的体积比为1 : 2的比例，缓慢加入质量分数为80%的乙醇溶液，在离心机转速 为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；
[0011] g)将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，所 得超滤液在真空度为-〇. lMPa、60°C恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超滤液体积的 1/15,得浓缩超滤液；
[0012] h)将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤， 收集超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min，即得小牛血去 蛋白提取物。
[0013] 步骤c)、e)对小牛血进行冷冻、融化的循坏，可以促使细胞内外的有效物质充分 释放，不破坏有效成分的生物活性、保证有效成分的充分提取；步骤c)以1°C /min的升温 速度升温至60°C，并60°C恒温lh，对冷冻的小牛血进行融化，不仅可以有效地、完全地去 除其中的杂蛋白，而且不会破坏有效成分的生物活性，同时具有杀菌作用，能对牛源性病毒 充分灭活，保证了小牛血去蛋白提取物的安全性；步骤e)以1°C /min的升温速度升温至 40°C，并40°C恒温lh，可以进一步去除杂蛋白，灭活牛源性病毒；步骤f)中进一步用乙醇以 一定的比例对步骤b)得到的上清液进行混合，进一步去除杂蛋白，充分保证了杂蛋白去除 的完全性；超滤柱的使用，进一步保证了杂蛋白去除的完全性。
[0014] 本发明的小牛血去蛋白提取物的制备方法，不仅能有效地、完全地去除其中的杂 蛋白，而且不会破坏有效成分的生物活性，同时具有杀菌作用，能对牛源性病毒充分灭活， 保证了小牛血去蛋白提取物的安全性；另外工艺重现性好，利于大规模生产。
[0015] 由本发明的的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，包括粉针剂和 水针剂。
[0016] 为了方便存放和运输，将由本发明的的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物制成 粉针剂和水针剂，存放和携带方便，便于运输。
[0017] 本发明的注射剂为粉针剂，粉针剂包括下列重量份的原料：
[0018] 小牛血去蛋白提取物4000
[0019] 冻干保护剂 200
[0020] 注射用水 4000，
[0021] 所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3 : 1的重量份数比组成。
[0022] 冻干保护剂的加入，可有效保证最终的冻干剂中活性成分的生物活性，特别是海 藻糖与PEG以3 : 1的重量份数比作为冻干保护剂，在保证有效保证最终的冻干剂中活性 成分的生物活性的同时，也具有稳定作用，使最终制得的冻干剂生物活性高、性质稳定。
[0023] 本发明的注射剂为水针剂，水针剂包括下列重量份的原料：
[0024] 小牛血去蛋白提取物600
[0025] 注射用水 400。
[0026] 本发明的注射剂的制备方法，包括如下步骤：
[0027] a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；
[0028] b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1. 0560补加注 射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行 预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配 罐中，得浓配液，备用；
[0029] c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1. 0260?1. 0560补加 注射用水进行稀配，得稀配液，备用；
[0030] d)向步骤c)得到的稀配液中添加10%的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 8?7. 3， 搅拌lOmin至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；
[0031] e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均 匀，然后经0. 22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；
[0032] f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin，得处理后的除 菌稀配液；
[0033] g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡 器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得 灌装稀配液；
[0034] h)冻干：将步骤g)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得注射剂，即粉针 剂。
[0035] 对小牛血去蛋白提取物先浓配后稀配，得到的最终产品中，小牛血去蛋白提取物 分散均匀，最终产品质量稳定；灭菌处理可以保证最终产品的安全性；制备方法工艺简单， 工艺可重复性好，利于大规模生产。
[0036] 现有的小牛血去蛋白提取物药物，患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用， 本发明在制备小牛血去蛋白提取物的粉针剂过程中，通过对制备工艺的改进，解决了该技 术问题，防止了患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。其对制备工艺的改进是：在 步骤f)中，将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin。
[0037] 优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤e)中，除菌过滤器上、下游压力的压差 不超过〇. 〇8Mpa。
[0038] 在这个参数设置范围内，可以有效保证除菌效果，保证最终产品的安全性。
[0039] 优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤f)中，灌装过程每30分钟抽检装量一 次，每个针头抽检2支，罐装量为3. 95?4. 05ml/支。
[0040] 可以有效地保证最终产品的质量，保证其安全性和稳定性。
[0041] 优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤g)中，冻干过程的干燥设置如下：
[0042] 冷冻控制：设定导热油温度_45°C?-50°C，持续时间90分钟；设定导热油温 度-10°c持续时间15分钟；设定导热油温度-45°c?-50°c，持续时间180分钟；
[0043] 后箱预冷：设定后箱温度为-45°C?-50°C ;
[0044] 预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0. 15mPa ;
[0045] 升华干燥：
[0046] 设定干燥箱真空度为0. 10?0. 30mPa，导热油温度为-15°C，持续时间840分钟；
[0047] 设定干燥箱真空度为0. 10?0. 30mPa，导热油温度为-10°C，持续时间180分钟；
[0048] 设定干燥箱真空度为0. 10?0. 30mPa，导热油温度为-5°c，持续时间180分钟；
[0049] 设定干燥箱真空度为0. 10?0. 30mPa，导热油温度为0°C，持续时间180分钟；
[0050] 解析干燥：
[0051] 设定干燥箱真空度为0. 10?0. 30mPa，导热油温度为5°C，持续时间120分钟；
[0052] 设定干燥箱真空度为0. 10?0. 30mPa，导热油温度为15°C，持续时间120分钟；
[0053] 设定干燥箱真空度为0. 05mPa，导热油温度为36°C，持续时间360分钟。
[0054] 冻干过程中各个阶段的温度设置对冻干的效果影响很大，如上的设置可保证小牛 血去蛋白提取物的生物活性和制剂的冻干效果，保证最终产品的质量。
[0055] 本发明的注射剂的制备方法，包括如下步骤：
[0056] a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；
[0057] b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1. 0260补加注 射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去 蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀 配罐中，搅拌l〇min至均匀，得浓配液，备用；
[0058] c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1. 0242?1. 0260补加 注射用水进行稀配，得稀配液，备用；
[0059] d)向步骤c)得到的稀配液中添加5%的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 7?7. 1，搅 拌lOmin至均匀，取样检测，得合格的稀配液；
[0060] e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得 除菌稀配液；
[0061] f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin，得处理后的除 菌稀配液；
[0062] g)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌 操作法连接安装到灌封机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配 液；
[0063] h)灭菌：用推板将步骤g)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转 盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，得注射剂，即水针剂。
[0064] 对小牛血去蛋白提取物先浓配后稀配，得到的最终产品中，小牛血去蛋白提取物 分散均匀，最终产品质量稳定；灭菌处理可以保证最终产品的安全性；制备方法工艺简单， 工艺可重复性好，利于大规模生产。
[0065] 现有的小牛血去蛋白提取物药物，患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用， 本发明在制备小牛血去蛋白提取物的粉针剂过程中，通过对制备工艺的改进，解决了该技 术问题，防止了患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。其对制备工艺的改进是：在 步骤f)中，将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin。
[0066] 优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤g)中，灭菌条件为115°C、30分钟。
[0067] 在这种灭菌条件设置下，对水针剂的灭菌效果最好，产品的稳定性和安全度高。
[0068] 本发明的有益效果为：
[0069] 本发明所提供的小牛血去蛋白提取物的制法，既不破坏生物活性、又不引入外源 离子、能有效去除其中杂蛋白；由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，不会引发过敏反 应，安全度高，能有效治疗脑中风、脑外伤、脑功能不全及脑痴呆等脑细胞代谢障碍性疾病， 改善细胞氧含量和微循环；注射剂的制备方法，能充分保证最终产品的质量稳定性和安全 度，保证制剂的药用效果，防止患者使用后出现兴奋、睡眠质量差等副作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0070] 图1为对照组耳缘静脉组织照片（X 200倍）；
[0071] 图2为给药组耳缘静脉组织照片（X 200倍）。
【具体实施方式】
[0072] 下面结合实施例对本发明作进一步说明：
[0073] 实施例1小牛血去蛋白提取物的制法
[0074] -种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0075] a)将小牛血在35°C缓化20min，得缓化后的小牛血；
[0076] b)向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至4. 0,得 酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为37%的盐酸按照1 : 1的体积比配 制的；
[0077] c)将步骤b)得到的酸化后的小牛血在_25°C下低温冷冻24h，然后再以1°C /min 的升温速度升温至60°C，并60°C恒温lh，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为15000 转/分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用；
[0078] d)向步骤c)得到的上清液中加入质量分数为20%的NaOH溶液，调节pH值至 8. 0?8. 5,得碱化后的上清液；
[0079] e)将步骤d)得到的碱化后的上清液在_20°C下低温冷冻24h，然后再以1°C /min 的升温速度升温至40°C，并40°C恒温lh，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为13000 转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；
[0080] f)将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照上清液 与乙醇溶液的体积比为1 : 2的比例，缓慢加入质量分数为80%的乙醇溶液，在离心机转速 为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；
[0081] g)将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，所 得超滤液在真空度为-〇. lMPa、60°C恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超滤液体积的 1/15,得浓缩超滤液；
[0082] h)将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤， 收集超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min，即得小牛血去 蛋白提取物。
[0083] 实施例2粉针剂
[0084] 处方：
[0085] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0086] 冻干保护剂 200g
[0087] 注射用水 4000g
[0088] 所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3 : 1的重量份数比组成；
[0089] 制法：
[0090] a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；
[0091] b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1. 0560补加注射用水进 行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行预滤，然后 再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配罐中，得浓 配液，备用；
[0092] c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260补加注射用水 进行稀配，得稀配液，备用；
[0093] d)向步骤c)得到的稀配液中添加10%的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8,搅拌 lOmin至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；
[0094] e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均 匀，然后经0. 22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；所述除菌过滤器上、下 游压力的压差为〇· 〇8Mpa ;
[0095] f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin，得处理后的除 菌稀配液；
[0096] g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡 器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤e)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得 灌装稀配液；灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为4. 00ml/支；
[0097] h)冻干：将步骤f)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得冻干剂；冻干过 程中干燥设置如下：
[0098] 冷冻控制：设定导热油温度_45°C，持续时间90分钟；设定导热油温度-10°C持续 时间15分钟；设定导热油温度-45°C，持续时间180分钟；
[0099] 后箱预冷：设定后箱温度为_45°C ;
[0100] 预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0. 15mPa ;
[0101] 升华干燥：
[0102] 设定干燥箱真空度为0. lOmPa，导热油温度为-15°C，持续时间840分钟；
[0103] 设定干燥箱真空度为0. lOmPa，导热油温度为-10°C，持续时间180分钟；
[0104] 设定干燥箱真空度为0. lOmPa，导热油温度为-5°C，持续时间180分钟；
[0105] 设定干燥箱真空度为0. lOmPa，导热油温度为0°C，持续时间180分钟；
[0106] 解析干燥：
[0107] 设定干燥箱真空度为0. lOmPa，导热油温度为5°C，持续时间120分钟；
[0108] 设定干燥箱真空度为0. lOmPa，导热油温度为15°C，持续时间120分钟；
[0109] 设定干燥箱真空度为0. 05mPa，导热油温度为36°C，持续时间360分钟。
[0110] 实施例3粉针剂
[0111] 处方：
[0112] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0113] 冻干保护剂 200g
[0114] 注射用水 4000g
[0115] 所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3 : 1的重量份数比组成；
[0116] 制法：
[0117] a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；
[0118] b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1. 0580补加注射用水进 行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行预滤，然后 再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配罐中，得浓 配液，备用；
[0119] c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0560补加注射用水 进行稀配，得稀配液，备用；
[0120] d)向步骤c)得到的稀配液中添加10%的氢氧化钠溶液调节pH值至7.3,搅拌 lOmin至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；
[0121] e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均 匀，然后经0. 22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；所述除菌过滤器上、下 游压力的压差为〇· 〇6Mpa ;
[0122] f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin，得处理后的除 菌稀配液；
[0123] g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡 器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤e)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得 灌装稀配液；灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为4. 00ml/支；
[0124] h)冻干：将步骤f)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得冻干剂；冻干过 程中干燥设置如下：
[0125] 冷冻控制：设定导热油温度_50°C，持续时间90分钟；设定导热油温度-10°C持续 时间15分钟；设定导热油温度-50°C，持续时间180分钟；
[0126] 后箱预冷：设定后箱温度为-50°C ;
[0127] 预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0. 15mPa ;
[0128] 升华干燥：
[0129] 设定干燥箱真空度为0. 30mPa，导热油温度为-15°C，持续时间840分钟；
[0130] 设定干燥箱真空度为0. 30mPa，导热油温度为-10°C，持续时间180分钟；
[0131] 设定干燥箱真空度为0. 30mPa，导热油温度为_5°C，持续时间180分钟；
[0132] 设定干燥箱真空度为0. 30mPa，导热油温度为0°C，持续时间180分钟；
[0133] 解析干燥：
[0134] 设定干燥箱真空度为0. 30mPa，导热油温度为5°C，持续时间120分钟；
[0135] 设定干燥箱真空度为0. 30mPa，导热油温度为15°C，持续时间120分钟；
[0136] 设定干燥箱真空度为0. 05mPa，导热油温度为36°C，持续时间360分钟。
[0137] 对照实施例1粉针剂
[0138] 处方：
[0139] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0140] 注射用水 4000g
[0141] 制法：
[0142] 除步骤e)为"将步骤d)得到的澄明度合格的稀配液，经0. 22μπι筒式除菌过滤器 过滤至缓冲罐，得除菌稀配液"不同于实施例2中的步骤e)，其余步骤均与实施例2相同。
[0143] 对照实施例2粉针剂
[0144] 处方：
[0145] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0146] 冻干保护剂 200g
[0147] 注射用水 4000g
[0148] 所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3 : 1的重量份数比组成；
[0149] 制法：
[0150] 除不含有实施例2中的步骤f)，S卩"将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的 紫外线照射lmin，得处理后的除菌稀配液"，其余步骤均于实施例2相同。
[0151] 实施例4水针剂的制法
[0152] 粉针剂的制法，包括如下步骤：
[0153] a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；
[0154] b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1. 0260补加注射用水进 行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去蛋白提取 物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀配罐中，搅 拌lOmin至均匀，得浓配液，备用；
[0155] c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0242补加注射用水 进行稀配，得稀配液，备用；
[0156] d)向步骤c)得到的稀配液中添加 5%的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 7,搅拌 lOmin至均匀，取样检测，得合格的稀配液；
[0157] e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得 除菌稀配液；
[0158] f)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌 操作法连接安装到灌封机上，对步骤e)得到的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；
[0159] g)灭菌：用推板将步骤f)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转 盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，即得水针剂；灭菌条件为115°C、30分钟。
[0160] 实施例5水针剂的制法
[0161] 粉针剂的制法，包括如下步骤：
[0162] a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；
[0163] b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1. 0280补加注射用水进 行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去蛋白提取 物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀配罐中，搅 拌lOmin至均匀，得浓配液，备用；
[0164] c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260补加注射用水 进行稀配，得稀配液，备用；
[0165] d)向步骤c)得到的稀配液中添加5%的氢氧化钠溶液调节pH值至7.1，搅拌 lOmin至均匀，取样检测，得合格的稀配液；
[0166] e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得 除菌稀配液；
[0167] f)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌 操作法连接安装到灌封机上，对步骤e)得到的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；
[0168] g)灭菌：用推板将步骤f)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转 盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，即得水针剂；灭菌条件为115°C、30分钟。
[0169] 为说明这一情况，现通过试验例进一步说明本发明的效果如下：
[0170] 试验例1过敏试验
[0171] 1.试验对象：
[0172] 豚鼠，雄性18只，体重250_350g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
[0173] 随机平均分成三组，分别为给药组6只、生理盐水组6只、阳性对照组6只，按无菌 操作。
[0174] 2.试验方法：
[0175] 给药组：隔日腹腔注射本发明的小牛血去蛋白提取物0. 5ml/只；首次注射后的第 14天，随机选取其中的3只，静脉注射本发明的小牛血去蛋白提取物lml/只；首次注射后 的第21天，取剩余的3只，静脉注射本发明的小牛血去蛋白提取物lml/只；
[0176] 生理盐水组：隔日腹腔注射生理盐水0. 5ml/只；首次注射后的第14天，随机选取 其中的3只，静脉注射生理盐水lml/只；首次注射后的第21天，取剩余的3只，静脉注射生 理盐水lml/只；
[0177] 阳性对照组：隔日腹腔注射1%新鲜鸡蛋清溶液各0. 5ml/只；首次注射后的第14 天，随机选取其中的3只，静脉注射1 %新鲜鸡蛋清溶液；首次注射后的第21天，取剩余的3 只，静脉注射1 %新鲜鸡蛋清溶液lml/只；
[0178] 观察过敏反应现象，按表1进行过敏反应分级。
[0179] 表1豚鼠过敏反应级数
[0180]
【权利要求】
1. 一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤： a) 将小牛血在30-40°C缓化20min，得缓化后的小牛血； b) 向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至3. 5?4. 0， 得酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为36%?38%的盐酸按照1 : 1的 体积比配制的； c) 将步骤b)得到的酸化后的小牛血在-25°C下低温冷冻24h，然后再以1°C /min的升 温速度升温至60°C，并60°C恒温lh，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为15000转/ 分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用； d) 向步骤c)得到的上清液中加入质量分数为20%的NaOH溶液，调节pH值至8. 0? 8. 5,得碱化后的上清液； e) 将步骤d)得到的碱化后的上清液在-20°C下低温冷冻24h，然后再以1°C /min的升 温速度升温至40°C，并40°C恒温lh，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为13000转/ 分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用； f) 将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照上清液与乙 醇溶液的体积比为1 : 2的比例，缓慢加入质量分数为80%的乙醇溶液，在离心机转速为 13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用； g) 将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，所得超滤 液在真空度为-0. lMPa、60°C恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超滤液体积的1/15,得 浓缩超滤液； h) 将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，收集 超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min，即得小牛血去蛋白 提取物。
2. 由权利要求1所述的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，其特征在 于，所述注射剂包括粉针剂和水针剂。
3. 根据权利要求2所述的注射剂，其特征在于，所述注射剂为粉针剂，所述粉针剂包括 下列重量份的原料： 小牛血去蛋白提取物4000 冻干保护剂 200 注射用水 4000， 所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3 : 1的重量份数比组成。
4. 根据权利要求2所述的注射剂，其特征在于，所述注射剂为水针剂，所述水针剂包括 下列重量份的原料： 小牛血去蛋白提取物600 注射用水 400。
5. 根据权利要求3所述的注射剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步 骤： a) 准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用； b) 浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1. 0560补加注射用 水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行预滤， 然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配罐中， 得浓配液，备用； c) 稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1. 0260?1. 0560补加注射 用水进行稀配，得稀配液，备用； d) 向步骤c)得到的稀配液中添加10%的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 8?7. 3,搅拌 lOmin至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液； e) 向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均匀，然 后经0. 22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液； f) 将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin，得处理后的除菌稀 配液； g) 灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡器用 无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装 稀配液； h) 冻干：将步骤g)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得注射剂，即粉针剂。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤e)中，所述除菌过滤器上、 下游压力的压差不超过〇· 〇8Mpa。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤f)中，灌装过程每30分钟 抽检装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为3. 95?4. 05ml/支。
8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤g)中，所述冻干过程的干燥 设置如下： 冷冻控制：设定导热油温度_45°C?-50°C，持续时间90分钟；设定导热油温度-10°C 持续时间15分钟；设定导热油温度-45°C?-50°C，持续时间180分钟； 后箱预冷：设定后箱温度为_45°C?-50°C ; 预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为〇. 15mPa ; 升华干燥： 设定干燥箱真空度为〇. 10?〇. 30mPa，导热油温度为-15°C，持续时间840分钟； 设定干燥箱真空度为〇. 10?〇. 30mPa，导热油温度为-10°C，持续时间180分钟； 设定干燥箱真空度为〇. 10?〇. 30mPa，导热油温度为-5°C，持续时间180分钟； 设定干燥箱真空度为〇. 10?〇. 30mPa，导热油温度为0°C，持续时间180分钟； 解析干燥： 设定干燥箱真空度为〇. 10?〇. 30mPa，导热油温度为5°C，持续时间120分钟； 设定干燥箱真空度为〇. 10?〇. 30mPa，导热油温度为15°C，持续时间120分钟； 设定干燥箱真空度为〇. 〇5mPa，导热油温度为36°C，持续时间360分钟。
9. 根据权利要求4所述的注射剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步 骤： a) 准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用； b) 浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1. 0260补加注射用 水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去蛋白 提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀配罐 中，搅拌lOmin至均匀，得浓配液，备用； c) 稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1. 0242?1. 0260补加注射 用水进行稀配，得稀配液，备用； d) 向步骤c)得到的稀配液中添加5%的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 7?7. 1，搅拌 lOmin至均匀，取样检测，得合格的稀配液； e) 将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22 μ m筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌 稀配液； f) 将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0. 3的紫外线照射lmin，得处理后的除菌稀 配液； g) 灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌操作 法连接安装到灌封机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液； h) 灭菌：用推板将步骤g)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转盘整 齐装满灭菌车，进行灭菌，得注射剂，即水针剂。
10. -种权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤g)中，灭菌条件为115°C、 30分钟。
【文档编号】A61K9/19GK104147047SQ201410367957
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】姬彦峰 申请人:哈尔滨圣泰生物制药有限公司