抗Ⅱ型糖尿病长效纳米复合肽及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种抗Ⅱ型糖尿病长效纳米复合肽及其制备方法与应用。以纳米硒为载体，壳聚糖为连接，实现活性多肽与纳米硒粒子的共价结合。本发明所制得的纳米复合肽在生理环境中具有携带、保护和缓释治疗性多肽、有效延长治疗性多肽半衰期的作用，发挥治疗作用的有效剂量可显著低于单独使用治疗性多肽的用药量，且可发挥药物缓释、长效治疗的生物学作用；克服了单独使用治疗性多肽时，由于分子量小，在体内易被快速代谢清除的缺点，可有效提高小分子治疗性多肽的体内半衰期和生物利用度。本发明的纳米复合肽可应用于制备治疗如下疾病的药物：糖尿病，高血糖症。本发明的制备方法效率高、成本低，应用前景广阔。
【专利说明】抗II型糖尿病长效纳米复合肽及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米生物【技术领域】，特别涉及一种抗II型糖尿病长效纳米复合肽及其 制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP)是1990年被发现由脑垂体分泌的具有重要生 物学功能的神经多肽，是促胰液素/高血糖素 ΛΙΡ家族中的新成员。PACAP有两种存在形 式：PACAP38,由38个氨基酸组成；PACAP27,由PACAP38氮端的27个氨基酸组成。PACAP通 过激活其特异的G蛋白偶联受体，提高靶细胞cAMP等第二信使的浓度，从而发挥广泛而重 要的生物学功能。PACAP有三类G蛋白偶联受体：PAC1、VPAC1和VPAC2 ;三类受体在生物体 中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受体分布于胰岛等组织，与能量代谢密切 相关，从临床观点看，作为VPAC2型受体特异激动剂的特定PACAP衍生物可有效地降低血液 葡萄糖水平，保护β-细胞功能及阻止疾病发展的潜力，且无低血糖症风险，为公认的治疗 Π 型糖尿病的新型药物。
[0003] PACAP与VPAC2受体作用主要与腺苷酸环化酶（AC)藕联：通过cAMP信号传导通 路，激活AC，催化ATP转化为cAMP，cAMP随之激活其依赖性蛋白激酶A (PKA)，PKA可使细胞 内多种蛋白质磷酸化，产生生理效应，尤其是在促进相关基因转录有重要作用。PACAP通过 VPAC2受体介导的生物学功能主要有：神经递质/调质、促进激素分泌，调节内分泌平衡；调 节性腺功能和生殖细胞的产生；调节能量代谢平衡等。
[0004] 研究表明，VPAC2型受体特异激动剂可有效促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，提高机 体对高浓度血糖的应急能力有效降低血糖浓度，保护胰腺β细胞功能、增加 β细胞数量和 抑制β细胞凋亡。但PACAP及其许多衍生物，如DBAYL、ΒΑΥ55-9837等，由于分子量较小 (<6000Da.)，在体内由于肾小球的滤过作用，易被肾快速排泄和代谢，因此，其体内半衰期 较短、生物利用度受到影响。
[0005] 纳米硒（SeNPs)具有良好的生物相容性，在体内还具有清除自由基的功能，其逐 渐被探索和初步应用于药物传输与治疗体系。壳聚糖是由（l，4)-linked2-amino_2-deoxy -β -D-glucose组成一种无毒可生物降解的阳离子多聚糖。壳聚糖与纳米粒子作用后仍然 具有高分子聚合物的优良性能，如生物相容性、生物降解性、无毒性、成本低等。壳聚糖纳米 粒子用于药物运载和治疗，越来越受到科研工作者的关注。
[0006] VPAC2型受体特异激动剂类活性多肽具有良好的葡萄糖依赖性降血糖作用，但往 往分子量较小，其体内半衰期较短、生物利用度降低，若要长效发挥这些具有良好降血糖作 用的活性多肽的生物学作用，把这些活性多肽与壳聚糖修饰的纳米载体粒子偶联作为新型 药物体系，可有效改善多肽药物的水溶性和体内稳定性、控制药物的体内释放及革巴向选择 性，有效延长活性多肽药物的半衰期，具有重要的药用价值。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种抗II型糖尿病 长效纳米复合肽的制备方法。该制备方法生产效率高，生产成本低。
[0008] 本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的抗II型糖尿病长效纳米复 合肽。该纳米复合肽P印tide-CS-SeNPs具有协同作用，具有更高稳定性、更长半衰期， Peptide指DBAYL、BAY55-9837等VPAC2受体特异激动剂类活性多肽。以纳米硒为载体，壳 聚糖（Chitosan，CS)为连接linker,实现活性多肽与纳米硒粒子（SeNPs)的共价结合。
[0009] 本发明的再一目的在于提供所述的抗II型糖尿病长效纳米复合肽的应用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗II型糖尿病长效纳米复合肽的制备 方法，包括如下步骤：
[0011] (1)纳米硒粒子（SeNPs)制备
[0012] 常温常压下，吸取抗坏血酸（Vc)溶液，逐滴加入Na2Se03溶液，边加边摇匀，待颜色 不再加深，转移到低温反应，得到纳米硒粒子溶液；
[0013] ⑵多肽和壳聚糖偶联
[0014] 称取多肽，用双蒸水溶解，再加入0. 8mg/mL的壳聚糖（Chitosan，CS)溶液，搅拌反 应，得到多肽-壳聚糖偶联物溶液；
[0015] (3)纳米复合肽 Peptide-CS-SeNPs 的制备
[0016] 将步骤（1)制备的纳米硒粒子溶液和步骤（2)制备的多肽-壳聚糖偶联物溶液混 合后，搅拌反应，反应完成后，于双蒸水中透析过夜，得到高纯度的抗II型糖尿病长效纳米 复合肤 Peptide-CS-SeNPs。
[0017] 步骤⑴中所述的Vc溶液的浓度优选为20?60mM ;更优选为20mM ;
[0018] 步骤⑴中所述的Na2Se03溶液的浓度优选为5?15mM ;更优选为5mM ;
[0019] 步骤⑴中所述的纳米硒粒子溶液，其中Vc与Na2Se03的终浓度比优选为4:1 ;
[0020] 步骤⑴中所述的低温优选为0?4°C ;
[0021] 步骤（1)中所述的反应的时间优选为3?5h，更优选为4h ;
[0022] 步骤（2)中所述的多肽优选为DBAYL、BAY55-9837、RMBAY或RMR0M等VPAC2受体 特异激动剂类活性多肽；更优选为DBAYL或BAY55-9837 ;
[0023] 步骤⑵中所述的反应的时间优选为10?16h ;更优选为12h ;
[0024] 步骤（2)中所述的多肽-壳聚糖偶联物溶液，其中多肽的终浓度优选为lmg/mL ; 多聚糖的终浓度优选为〇. 〇8mg/mL ;
[0025] 步骤（3)所述的混合优选为步骤（1)制备的纳米硒粒子溶液与步骤（2)制备的多 肽-壳聚糖偶联物溶液按体积比2: (0. 5?3)进行混合；更优选为2:1 ;
[0026] 步骤（3)中所述的反应的时间优选为10?16h ;更优选为12h ;
[0027] -种抗II型糖尿病长效纳米复合肽，通过上述制备方法制得。
[0028] 所述的抗II型糖尿病长效纳米复合肽应用于制备治疗如下疾病的药物：糖尿病， 1?血糖症。
[0029] 所述的抗II型糖尿病长效纳米复合肽应用于制备治疗II型糖尿病相关疾病的药 物，有如下作用：长效促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，提高机体对高浓度血糖的应急能力， 长效降低血糖浓度，保护胰腺β细胞功能、增加 β细胞数量和抑制β细胞凋亡及调节免 疫系统功能等作用。
[0030] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0031] (1)本发明所制备的纳米复合肽P印tide-CS-SeNPs药物体系中，共价偶联的 P印tide-CS-SeNPs在生物体内借助天然酶或生理环境（如PH等理化性质变化），可缓慢 释放P印tide(DBAYL、BAY55-9837等活性多肽），在纳米复合肽中，壳聚糖（Chitosan，CS) 修饰的纳米硒粒子（SeNPs)具有对治疗性多肽P印tide的载体携带、保护和缓释作用， 且释放Peptide后的SeNPs仍具有保护和修复β -细胞功能等作用；Peptide对复合肽 Peptide-CS-SeNPs具有靶向引导作用，且可通过VPAC2受体介导发挥治疗II型糖尿病的生 物学作用。
[0032] (2)纳米复合肽P印tide-CS-SeNPs克服了单独使用治疗性多肽P印tide (DBAYL、 BAY55-9837等活性多肽）时，由于分子量小（小于6000Da.)，在体内易被快速代谢清除的 缺点，可有效提高小分子治疗性多肽的体内半衰期和生物利用度。
[0033] 这些区别使得纳米复合肽P印tide-CS-SeNPs在生理环境中具有携带、保护和缓 释治疗性多肽、有效延长治疗性多肽半衰期的作用，纳米复合肽发挥治疗作用的有效剂量 可显著低于单独使用治疗性多肽的用药量，且可发挥药物缓释、长效治疗的生物学作用。生 理条件下释放的释治疗性多肽可与VPAC2受体特异结合后，促进胰岛素的产生和分泌，保 护胰腺β细胞功能、增加 β细胞数量和抑制β细胞凋亡，并激活胰岛素受体信号通路，从 而发挥治疗II型糖尿病的功效。而SeNPs具有保护和修复β-细胞功能的作用。
[0034] (3)本发明所制备的纳米复合肽Ρ印tide-CS-SeNPs在治疗糖尿病及其并发症，高 血糖症及肥胖症疾病中有显著的疗效。
[0035] (4)利用本发明所述的制备方法得到的纳米复合肽P印tide-CS-SeNPs使得治疗 性多肽P印tide (DBAYL、BAY55-9837等活性多肽）的消除半衰期延长25倍以上。本发明的 制备方法效率高、成本低，应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1是纳米复合肽Peptide-CS-SeNPs的结构示意图。
[0037] 图 2 是制备的纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs (图 2A)和 BAY55-9837-CS-SeNPs (图 2B)的透射电镜（TEM)分析的结果图。
[0038] 图 3 是制备的纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS_SeNPs 的 Zeta 电位 分析的结果图。
[0039] 图 4 是制备的纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 在 db/db 小 鼠体内的半衰期的结果图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0041] 实施例1
[0042] 纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 的制备
[0043] DBAYL的氨基酸序列为：
[0044] MHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY ；
[0045] BAY55-9837的氨基酸序列为：
[0046] HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY ；
[0047] 常温常压下，称取8. 7mg Na2Se03溶解于双蒸水中，定容到10mL，即得到5mM Na2Se0 3溶液；称取35. 2mg抗坏血酸（Vc)，溶解于双蒸水中，定容到10mL，即得到20mM的Vc 溶液；称取8mg壳聚糖，溶解于双蒸水中，定容到10mL，即得到0. 8mg/mL的壳聚糖溶液。吸 取lmL配制好的Vc溶液于小烧杯中，逐滴加入lmL Na2Se03溶液，边加边摇勻，待颜色不再 加深，转移到低温（〇?4°C )反应4小时，即得到粗制的纳米硒粒子溶液。
[0048] 称取lmg多肽P印tide (指DBAYL或BAY55-9837)于小烧杯中，加入900 μ L双蒸 水溶解，再加入100 μ L 0. 8mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌反应12小时。然后将反应液加入到 粗制的纳米砸粒子溶液中，定各到5mL，再揽祥反应12小时。反应完成后，于双蒸水中透析 过夜，即得到纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs 或 BAY55-9837-CS-SeNPs。
[0049] 制备的纳米复合肽P印tide-CS-SeNPs的结构如图1所示。
[0050] 实施例2
[0051] 制备的纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 的透射电镜（TEM) 检测
[0052] 用TECNAI-10型透射电子显微镜（Philips)观察纳米复合肽DBAYL-CS-SeNPs和 BAY55-9837-CS-SeNPs的形貌：将纳米复合肽分散均匀，用铜网蘸取样品，以确定所得样品 微粒的大小、形貌和均匀性，并拍摄有代表性的电镜照片。
[0053] 实验结果如图2，制备的纳米复合肽DBAYL-CS-SeNPs (图2A)和 BAY55-9837-CS-SeNPs (图2B)，具有良好的分散性，其粒径大小约lOOnm，微粒形如球状，均 匀性好。
[0054] 实施例3
[0055] 制备的纳米复合肽DBAYL-CS-SeNPs和BAY55-9837-CS_SeNPs的Zeta电位及傅里 叶变换红外光谱（FT-IR)检测
[0056] 用 Nano-ZS (Malvern Insruments Limited)测定 SeNPs、SeNPs-CS 和两种纳米 复合肽DBAYL-CS-SeNPs和BAY55-9837-CS-SeNPs的Zeta电位，比较它们之间的差别。 实验结果如图3所示，SeNPs的zeta电位为-8. 5mV，SeNPs-CS的zeta电位为47. 5mV， DBAYL-CS-SeNPs 的 Zeta 电位为 34. 9mV，BAY55-9837-CS-SeNPs 的 Zeta 电位为 29. 8mV。
[0057] 实施例4
[0058] 制备的纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 在 db/db 小鼠体内 的半衰期检测
[0059] 实验分为四组，每组6只db/db小鼠，分别静脉注射500 μ g/kg纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs、BAY55-9837-CS-SeNPs、DBAYL 或 BAY55-9837,注射药物 1 ?20 小时后 的小鼠血液样本从尾静脉被收集，各时间点血样收集在含有抗凝剂柠檬酸钠的离心管中。 样品离心后，利用LC/MS/MS技术进行检测。高效液相色谱分析条件为：流动相A(100% 的纯水，含有1 %的甲酸），流动相B (100 %的乙腈，含有1 %的甲酸），梯度变化为：0. 0? 0· 流动相 A ;0· 4 ?0· 8min，从 90%流动相 A to 10%流动相 A ;0· 8 ?1. 8min, 10 %流动相A ;1· 8?2. Omin,从10 %流动相A to 90 %流动相Α ;2· 0?3. Omin, 90 %流 动相A ;上样体积为10 μ L。DBAYL或BAY55-9837的各时间点浓度利用建立的标准曲线和 Win-Nonlin version 3. 1软件（Pharsight Inc.公司产品，美国）计算平均值所得。
[0060] 实验结果如图4所示，纳米复合肽DBAYL-CS-SeNPs和BAY55-9837-CS-SeNPs在 db/db小鼠体内的消除半衰期分别为19. 7小时和17. 3小时；多肽DBAYL和BAY55-9837在 db/db小鼠体内的消除半衰期分别为0. 77小时和0. 35小时；实验结果表明，治疗性多肽与 壳聚糖修饰的纳米硒粒子复合后的纳米复合肽的体内的消除半衰期，显著长于单独的治疗 性多肽。
[0061] 实施例5
[0062] 制备的纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 对 db/db 小鼠血糖 的影响
[0063] 40只10周龄的II型糖尿病模型db/db小鼠，根据体重被随机分成5组，每组 8只。每组小鼠在药物注射前测定血糖浓度，然后分别静脉注射500 μ g/kg纳米复合肽 DBAYL-CS-SeNPs、BAY55-9837-CS-SeNPs、DBAYL、BAY55-9837 或生理盐水，在药物或生理盐 水注射后的2、4、6、8、10、12小时从尾静脉取血，用OneTouch Ultra Meter血糖仪（Johnson 公司产品，美国）测定血糖值血糖浓度。
[0064] 表1注射纳米复合肽或多肽的db/db小鼠的血糖水平检测（mmol/L)
[0065]
【权利要求】
1. 一种抗II型糖尿病长效纳米复合肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：以纳米 硒为载体，壳聚糖为连接，实现VPAC2受体特异激动剂类活性多肽与纳米硒粒子的共价结 合。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括如下具体步骤： (1) 纳米硒粒子制备 常温常压下，吸取Vc溶液，逐滴加入Na2Se03溶液，边加边摇匀，待颜色不再加深，转移 到低温反应，得到纳米硒粒子溶液； (2) 多肽和壳聚糖偶联 称取多肽，用双蒸水溶解，再加入〇. 8mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌反应，得到多肽-壳聚 糖偶联物溶液； (3) 纳米复合肽Peptide-CS-SeNPs的制备 将步骤（1)制备的纳米硒粒子溶液和步骤（2)制备的多肽-壳聚糖偶联物溶液混合 后，搅拌反应，反应完成后，于双蒸水中透析过夜，得到高纯度的抗II型糖尿病长效纳米复 合肤 Peptide-CS-SeNPs。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)中所述的多肽为DBAYL、 BAY55-9837、RMBAY 或 RMROM。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤⑴中所述的Vc溶液的浓度为 20 ?60mM ; 步骤⑴中所述的Na2Se03溶液的浓度为5?15mM ; 步骤（1)中所述的纳米硒粒子溶液，其中Vc与Na2Se03的终浓度比为4:1。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)中所述的多肽-壳聚糖偶 联物溶液，其中多肽的终浓度为lmg/mL ;多聚糖的终浓度为0. 08mg/mL。
6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3)所述的混合为步骤（1)制 备的纳米硒粒子溶液与步骤（2)制备的多肽-壳聚糖偶联物溶液按体积比2: (0. 5?3)进 行混合。
7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)中所述的反应的时间为3? 5h ； 步骤（2)中所述的反应的时间为10?16h ; 步骤（3)中所述的反应的时间为10?16h。
8. -种抗II型糖尿病长效纳米复合肽，通过权利要求1?7任一项所述的制备方法制 得。
9. 根据权利要求8所述的抗II型糖尿病长效纳米复合肽的应用，其特征在于：所述的 抗II型糖尿病长效纳米复合肽用于制备治疗如下疾病的药物：糖尿病，高血糖症。
10. 根据权利要求8所述的抗II型糖尿病长效纳米复合肽的应用，其特征在于：所述的 抗II型糖尿病长效纳米复合肽应用于制备治疗II型糖尿病相关疾病的药物。
【文档编号】A61P3/10GK104138602SQ201410367708
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】马义, 洪岸, 陈填烽 申请人:暨南大学