小牛脾提取物及在原发免疫性血小板减少症治疗中的用途
【专利摘要】本发明提供了一种小牛脾提取物在原发免疫性血小板减少症治疗中的用途。所述小牛脾提取物的制备工艺为包括匀浆液的制备，冻融，组合酶协同作用，pH调节和膜过滤，以及无菌过滤和灌装。该校牛脾提取物中多肽和核糖提取率大大增加并且糖肽比固定在80-87之间。小牛脾提取物能够治疗ITP的活性经过血小板计数以及各个免疫器官中CD4+CD25+T比例进行验证，结果显示本发明能够显著提高血小板水平达到原工艺的50%，并改善造血功能，无毒副作用。
【专利说明】小牛脾提取物及在原发免疫性血小板减少症治疗中的用途
[0001]
【技术领域】： 本发明涉及一种新工艺提取的小牛脾提取物，同时还提供了其在原发免疫性血小板减 少症（ITP)治疗中的用途，属于生物医药领域。
[0002] 技术背景： 目前小牛脾提取物已广泛应用于肿瘤的辅助治疗以及免疫系统紊乱所引起的相关疾 病如白癜风、荨麻疹和过敏反应等。除此之外，临床上小牛脾提取物还作为原发免疫性血小 板减少症（ITP)治疗及辅助治疗剂。
[0003] 从生物组织中提取多肽、核糖和转移因子等一般采用物理提取法即冻融法、匀浆 法和膜过滤法等，如中国发明专利（CN201010257796. 0)所公开的方法。现有小牛脾提取物 生产工艺提取率低，直接影响产品的收率，而且产品质量难以控制。
[0004] 本发明采用物理方法结合组合酶协同酶解法提取小牛脾中小分子量的核糖及多 肽，并将核糖和多肽比值固定在80-87( μ g/mg)，在该糖肽比下产品治疗ITP的活性较原工 艺提升了近50%，能够在减少病患负担的同时减轻其痛苦。
[0005]
【发明内容】
： 本发明提供一种新工艺提取的小牛脾提取物，提取物的多肽及核糖含量大大提高。
[0006] 本发明进一步提供了上述小牛脾提取物在制备治疗原发免疫性血小板减少症方 面药物中的用途。
[0007] 本发明所述的一种小牛脾提取物，是由如下方法制备的； 取乳牛的脾脏，用〇. 9%氯化钠溶液清洗，加入1-1. 2倍量的生理盐水进行匀浆1~5 次，胶体磨粒度为2?8 μ m ;将匀浆液深度冷冻后40°C解冻，反复5-10次；按物料重量的 0. 3-1. 4%加入组合酶，搅拌均匀；将匀浆液取出放入90°C以下水浴中升温至75°C ~80°C;将 匀浆液在75°C?80°C保温2-2. 5h后迅速降温至KTC?20°C ;将上述溶液离心，离心速度 为3000-4000转/分，温度0?KTC以下，离心15-30分钟，收集上清液；调节提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道尔顿的膜超滤，即得小牛脾提取物； 其中，所述的组合蛋白酶为木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B和5'-磷酸二酯酶混合物，所述 组合酶的质量比为：木瓜蛋白酶〇. 5?1. 2份，组织蛋白酶BI. 5?2. 5份，5' -磷酸二酯酶 2. 5?4份。
[0008] 所述的小牛脾提取物在制备升高血小板的药物中的应用。
[0009] 所述的小牛脾提取物在制备改善造血功能的药物中的应用。
[0010] 本发明经过实验证明：小牛脾提取物可以治疗原发免疫性血小板减少症并且其 活性较专利（CN201010257796. 0)所公开的方法增加了近50%，并且进过小牛脾提取物治 疗，各个淋巴器官中⑶4+⑶25+T细胞所占比例与正常组相近。
[0011] 血小板计数、T淋巴细胞亚群测定（⑶4，⑶8，⑶4/⑶8)是评价原发免疫性血小 板减少症（ITP)的常规手段，因此发明采用血小板计数以及T淋巴细胞亚群的测定来评价 小牛脾提取物对ITP的疗效。
[0012] 发明的有益效果在于： 利用复合酶的协同作用对小牛脾提取物中间品处理，能够大大增加小牛脾提取物中多 肽和核糖的收率，提取物中多肽占有10-20重量份、核糖占有0. 8-1. 7重量份；与此同时在 本发明提供的工艺参数下得到的提取物其糖肽比固定在80-87 ( μ g/mg)，在该糖肽比下小 牛脾提取物治疗原发性血小板减少症的活性增加了近50%。
【具体实施方式】
[0013] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。其中对照例1再现专利CN201010257796. 0 的制备方法。
[0014] 实施例1 : 取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，用0.9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小 时以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1倍量的生理盐水进行匀浆1次，胶体磨粒度 为2?8μπι ;将匀浆液深度冷冻后40°C解冻，反复5次；加入0. 17g木瓜蛋白酶，0. 5g 组织蛋白酶B，0. 83g 5'-磷酸二酯酶，搅拌均匀；将匀浆液取出放入90°C以下水浴中升温 至75°C °C ;将匀浆液在75°C保温2. 5h后迅速降温至20°C ;将上述溶液离心，离心速度为 3000-4000转/分，温度0?KTC以下，离心15分钟，收集上清液；调节提取物pH至 7. 0-7. 2 ;用5000道尔顿的膜超滤；0. 20 μ m滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
[0015] 实施例2: 取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，用0.9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小时 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1.2倍量的生理盐水进行匀浆5次，胶体磨粒 度为2?8μπι ;将匀浆液深度冷冻后40°C解冻，反复10次；I. 17g木瓜蛋白酶，2.43g 组织蛋白酶B，3. Sg 5'-磷酸二酯酶，搅拌均匀；将匀浆液取出放入90°C以下水浴中升 温至75°C ;将匀浆液在75°C保温2h后迅速降温至20°C ;将上述溶液离心，离心速度为 3000-4000转/分，温度0?KTC以下，离心15-30分钟，收集上清液；调节提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道尔顿的膜超滤；0. 20 μ m滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
[0016] 实施例3: 取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，用0.9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小时 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1-1.2倍量的生理盐水进行匀浆3次，胶体磨粒 度为2?8μπι ;将匀浆液深度冷冻后40°C解冻，反复10次；0. 78g木瓜蛋白酶，2. 34g 组织蛋白酶B，3. 9g 5'-磷酸二酯酶，搅拌均匀；将匀浆液取出放入90°C以下水浴中升温 至80°C ;将匀浆液在80°C保温2. 5h后迅速降温至HTC ;将上述溶液离心，离心速度为 3000-4000转/分，温度0?KTC以下，离心15-30分钟，收集上清液；调节提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道尔顿的膜超滤；0. 20 μ m滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
[0017] 对照例1 : 领取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，除去掉结缔组织和脂肪，用0.9%氯化 钠溶液清洗，加入3倍量的生理盐水进行匀浆，一般进行3次，胶体磨粒度为4μπι ;将 匀浆液放入冰库-20°C深冻，达到完全冻结后，取出放入30°C以下水浴中解冻，完全融化 后继续放入冰库，如此反复进行三次；将冻融后的药液70°C保温35分钟，速降温至15°C ; 将上述溶液离心，离心速度为3500转/分，温度5°C以下，离心20分钟，收集上清液； 分别用80000道尔顿、10000道尔顿、7000道尔顿的膜超滤；0.20 μ m滤芯无菌过滤分 装，即得注射液。
[0018] 对照例2 : 领取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，除去掉结缔组织和脂肪，用0.9%氯化 钠溶液清洗，加入4倍量的生理盐水进行匀浆，一般进行5次，胶体磨粒度为3μπι ;将匀 浆液放入冰库30°C深冻，达到完全冻结后，取出放入40°C以下水浴中解冻，完全融化后继 续放入冰库，如此反复进行三次；将冻融后的药液80°C保温40分钟，速降温至20°C ;将上 述溶液离心，离心速度为3000转/分，温度4°C以下，离心30分钟，收集上清液；分别 用60000道尔顿、9000道尔顿、6000道尔顿的膜超滤；0.20 μ m滤芯无菌过滤分装，即 得提取物。以上实施例得到的提取物中各成分含量以及核酸纯度(核酸纯度由OD26tZOD 28tl表 示)由表5体现。实验结果证明木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B和5' -磷酸二酯酶组合酶较优的 条件占匀浆液的质量比为：木瓜蛋白酶0.5?1.2份，组织蛋白酶BI. 5?2. 5份，5'-磷 酸二酯酶2. 5?4份。
[0019] 表5不同解法各种提取方法的提取结果
【权利要求】
1. 一种小牛脾提取物，是由如下方法制备的； 取乳牛的脾脏，用0.9%氯化钠溶液清洗，加入1-1. 2倍量的生理盐水进行匀浆1~5 次，胶体磨粒度为2?8 y m ;将匀浆液深度冷冻后40°C解冻，反复5-10次；按物料重量的 0. 3-1. 4%加入组合酶，搅拌均匀；将匀浆液取出放入90°C以下水浴中升温至75°C ~80°C;将 匀浆液在75°C?80°C保温2-2. 5h后迅速降温至10°C?20°C ;将上述溶液离心，离心速度 为3000-4000转/分，温度0?10°C以下，离心15-30分钟，收集上清液；调节提取物pH 至7. 0-7. 2 ;用5000道尔顿的膜超滤，即得小牛脾提取物； 其中所述的组合蛋白酶为木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B和5'-磷酸二酯酶混合物，所述 组合酶的质量比为：木瓜蛋白酶〇. 5?1. 2份，组织蛋白酶B1. 5?2. 5份，5'-磷酸二酯酶 2. 5?4份。
2. 如权利要求1所述的小牛脾提取物在制备升高血小板的药物中的用途。
3. 如权利要求1所述的小牛脾提取物在制备改善造血功能的药物中的用途。
【文档编号】A61P7/06GK104352520SQ201410614630
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】滕利荣, 王迪, 贾东旭, 孟庆繁, 逯家辉, 周毓麟, 滕乐生, 谢晶, 程瑛琨, 王贞佐, 蔡广胜, 卢文倩 申请人:吉林大学