一种注射用益气复脉冻干粉提取物的甲酯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种注射用益气复脉冻干粉提取物的甲酯化方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1，注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分的制备；步骤2，将步骤1所述注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分制备成注射用益气复脉冻干粉提取物；步骤3，将步骤2所述注射用益气复脉冻干粉提取物和甲醇在酸性或碱性条件下进行甲酯化反应。
【专利说明】一种注射用益气复脉冻干粉提取物的甲酯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药与化学领域，特别涉及一种注射用益气复脉冻干粉提取物的甲酯化方法。
【背景技术】
[0002]注射用益气复脉冻干粉是由红参、麦冬、五味子制成的用于静脉滴注的中药复方制剂，具有益气复脉，养阴生津的疗效。主要用于冠心病劳累性心绞痛气阴两虚证，症见胸痹心痛，心悸气短、倦怠懒言、头晕目眩、面色少华、舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代；冠心病所致慢性左心功能不全I1、III级气阴两虚证，症见心悸、气短甚则气急喘促，胸闷隐痛，时作时止，倦怠乏力，面色苍白，动则汗出，舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代。
[0003]注射用益气复脉冻干粉的性状为浅黄色的疏松块状物；有引湿性。取I瓶内容物，加水2?3ml溶解后,为棕红色澄明液体。
[0004]注射用益气复脉冻干粉中化学成分正不断深入研究，注射用益气复脉冻干粉经过大孔吸附树脂吸附，用碱醇洗脱得到的洗脱液中，含有脂肪酸类物质，对这些物质进行化学分析可以获得注射用益气复脉冻干粉中的有效成分的信息。但由于脂肪酸类物质的沸点较高，不宜直接采用气相色谱法(GC)进行分析。一般都是将其进行甲酯化衍生化降低沸点后，再通过GC分离测定所含有的脂肪酸信息。
[0005]常用的甲酯化方法分为酸催化、碱催化两大类。每种方法各有其优缺点，且使用范围各不相同。而许多文献和参考资料中使用的酸碱浓度、萃取溶剂等也有较大差异。因此，选择方便、快捷的、稳定、反应完全的甲酯化方法对注射用益气复脉冻干粉中的脂肪酸进行GC法分析至关重要。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种注射用益气复脉冻干粉提取物的甲酯化方法，包括以下步骤:
[0007]步骤1，注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分的制备；
[0008]步骤2，将步骤I所述注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分制备成注射用益气复脉冻干粉提取物；
[0009]步骤3，将步骤2所述注射用益气复脉冻干粉提取物和甲醇在酸性或碱性条件下进行甲酯化反应。
[0010]根据本发明实施方式之一，步骤I所述注射用益气复脉冻干粉碱醇部分的制备方法如下:
[0011]取注射用益气复脉冻干粉上大孔树脂柱，先用水洗脱，再用碱醇溶液洗脱，收集该碱醇洗脱液，浓缩干燥即得注射用益气复脉冻干粉碱醇部分。
[0012]所述碱醇溶液为0.1-lmol/L NaOH的乙醇溶液，乙醇浓度为15%_35%。优选的碱醇溶液为0.5mol/L NaOH 25%乙醇溶液。
[0013]根据本发明另一实施方式，步骤2所述注射用益气复脉冻干粉提取物制备方法如下:
[0014]取步骤I所述注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分，加氯仿，在20-40°C下超声提取，提取液浓缩即得注射用益气复脉冻干粉提取物。
[0015]根据本发明再一实施方式，步骤3所述甲酯化反应，方法如下:
[0016]取注射用益气复脉冻干粉提取物，加入甲醇，酸或碱，混合后进行反应，反应完毕，用有机溶剂萃取。
[0017]所述酸为1%_25%硫酸，所述碱为1-10%氢氧化钠或氢氧化钾。优选的酸为10%硫酸。
[0018]实验证明:酸性或碱性条件下均可生成甲酯化产物，但10%硫酸-甲醇加热回流酯
化法酯化效率最高。
[0019]所述有机溶剂包括正己烷、氯仿、乙酸乙酯，优选的有机溶剂为乙酸乙酯。
[0020]实验证明:萃取溶剂为正己烷时得到的成分极少，且含量较低；而乙酸乙酯萃取物检测成分较多，且亚油酸、棕榈酸等脂肪酸含量较高。
[0021]本发明最优选的制备方法见实施例。
[0022]本发明的目的在于通过上述制备方法得到所需的脂肪酸甲酯类物质。进一步对这些物质进行检测，检测方法包括气相色谱法，气相色谱-质谱联用法。经过检测可以判断本发明方法中甲酯化的程度和反应进程，进一步分析所测样品中脂肪酸的种类以及含量。
[0023]本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下:
[0024]I 材料
[0025]1.1 仪器
[0026]Agilent 5890-5971气相色谱-质谱联用仪，Agilent 6890N气相色谱配7683B自动进样器；AE240型十万分之一电子分析天平(瑞士 METTLER公司);KQ_250DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Mill1-Q超纯水处理系统。
[0027]1.2 试剂
[0028]正己烷，氯仿，乙酸乙酯，氢氧化钾，氯化钠，无水甲醇，浓硫酸，均为分析纯(天津化学试剂有限公司)，三氟化硼乙醚(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水。
[0029]1.3样品的制备
[0030]取注射用益气复脉冻干粉上已处理好的AB-8大孔树脂柱。水冲洗后用0.5mol/LNaOH 25%乙醇溶液冲洗树脂柱，收集该碱醇洗脱液，浓缩干燥即为注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分。精密称定Ig该物质，加50ml氯仿30°C超声提取lh，减压浓缩，得到氯仿提取物70mg，将此提取物平行制备6份。
[0031]2方法与结果
[0032]2.1甲酯化方法
[0033]2.1.1 10%硫酸-甲醇加热回流酯化法(萃取溶剂为正己烷)
[0034]精密称取上述氯仿提取物70mg，置以反应烧瓶内，加入5.0ml无水甲醇使之溶解，再慢慢加入0.5ml浓硫酸,在70°C下加热回流30min。取下冷却移入分液漏斗,加入15ml水，20ml正己烷振摇，进行萃取。静置，待液面分层后放去水相。用无水硫酸钠除水减压浓缩定容至5ml，备用。用于测定不同萃取溶剂对该部分物质甲酯化效果的影响。
[0035]2.1.2 10%硫酸-甲醇加热回流酯化法(萃取溶剂为乙酸乙酯)[0036]精密称取上述氯仿提取物70mg，置以反应烧瓶内，加入5.0ml无水甲醇使之溶解，再慢慢加入0.5ml浓硫酸,在70°C下加热回流30min。取下冷却移入分液漏斗,加入15ml水，20ml乙酸乙酯振摇，进行萃取。静置，待液面分层后放去水相。用无水硫酸钠除水减压浓缩后用乙酸乙酯定容至5ml容量瓶中，备用。用于测定不同酸法甲酯化效果的影响。
[0037]2.1.3 1%硫酸-甲醇加热回流酯化法(萃取溶剂为乙酸乙酯)
[0038]精密称取上述氯仿提取物70mg，置以反应西林瓶(盖上插一充满氮气的气球，防止溶剂挥发)内，加1%硫酸-甲醇4ml于70°C水浴加热60min,加入4ml乙酸乙酯,再加蒸馏水至瓶颈，取出上清，再用2ml乙酸乙酯洗一次，合并上清液，所得上清夜减压浓缩，定容至5ml，即可用于气相分析色谱。用于测定不同酸法甲酯化效果的影响。[0039]2.1.4 25%硫酸-甲醇加热回流酯化法(萃取溶剂为乙酸乙酯)
[0040]精密称取上述氯仿提取物70mg，置以反应西林瓶(盖上插一充满氮气的气球，防止溶剂挥发)内，加入3.0ml无水甲醇使之溶解，再慢慢加入1.0ml浓硫酸，在70°C水浴中下加热回流60min，加入5ml水混匀，再每次用IOml乙酸乙酯共萃取两次，合并萃取液，放入小瓶中，放入适量无水硫酸钠过夜除水，减压浓缩定容至5ml，待测。用于测定不同酸法甲酯化效果的影响。
[0041]2.1.5 2%氢氧化钾-甲醇加热回流酯化法(萃取溶剂为正己烷)
[0042]精密称取70mg上述的氯仿提取物，加入2%的氢氧化钾-甲醇溶液20mL，于电热套上加热回流30min,再加入5mL三氟化硼乙醚溶液反应5min。精密加入5mL正己烧,再保持5min。反应液冷却至室温后，加入饱和氯化钠溶液适量，振摇15min，静置分层，精密吸取正己烷层定容于5mL量瓶中，摇匀，备用。用于测定不同萃取溶剂对该部分物质甲酯化效果的影响。
[0043]2.1.6 2%氢氧化钾-甲醇加热回流酯化法(萃取溶剂为乙酸乙酯)
[0044]精密称取70mg上述的氯仿提取物，加入2%的氢氧化钾-甲醇溶液20mL，于电热套上加热回流30min,再加入5mL三氟化硼乙醚溶液反应5min。精密加入5mL乙酸乙酯,再保持5min。反应液冷却至室温后，加入饱和氯化钠溶液适量，振摇15min，静置分层，精密吸取乙酸乙酯层定容于5mL量瓶中，摇匀，备用。用于测定碱法甲酯化效果的影响。
[0045]2.2气相色谱-质谱分析条件
[0046]2.2.1气相色谱
[0047]色谱柱:Agilent HP-5MS玻璃毛细管色谱柱(30mX0.25mm，膜厚0.25μπι);柱温:60°C保持2min，以10°C.mirT1的速度升温至200°C，保持lOmin，再以的速度升温至210°C，保持5min ；10°C*min^的速度升温至280°C，保持10分钟；检测器温度:280°C;进样口温度:250°C ;进样量:lyL (分流进样，分流比为10:1);氦气流速:lmL.mirT1 (模式:恒流)。
[0048]2.2.2质谱条件
[0049]离子源温度:230°C ；MS四极杆温度:150°C ；EM电压:1000V。
[0050]2.2.3检测方法将样品中主要成分甲酯化后，利用GC-MS进行定性分析，得到样品的总离子流图。通过数据库软件给出的MS标准谱图检索对照结果，并结合质谱碎片峰的人工分析，确定每一个成分的化学结构，采用峰面积归一化法确定各组成在样品中的百分含量。[0051]2.3 结果
[0052]2.3.1通过比较10%硫酸-甲醇加热回流酯化法、2%氢氧化钾-甲醇加热回流酯化法分别用正己烷、乙酸乙酯萃取时的总离子图，对萃取溶剂的影响进行考察。萃取溶剂为正己烷时得到的成分极少，且含量较低；而乙酸乙酯萃取物检测成分较多，且亚油酸、棕榈
酸等脂肪酸含量较高。
[0053]2.3.2三种酸法甲酯化方法产物中，1%硫酸-甲醇加热回流酯化法亚油酸甲酯等主要成分含量较低；25%硫酸-甲醇加热回流酯化法次之；10%硫酸-甲醇加热回流酯化法所得主要成分含量最高，较为理想。而与2%氢氧化钾-甲醇加热回流酯化法相比，10%硫酸-甲醇加热回流酯化法产物中主峰含量较高。因此推断10%硫酸-甲醇加热回流酯化法酷化效率最闻。
[0054]2.3.3注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分的氯仿提取物甲酯化样品的总离子流色谱图见图1-1，经NIST2005标准谱库检索，共识别了 10个化合物，分别为9个脂肪族类化合物、I个芳香族类化合物。其中亚油酸含量最高(占30.43%)，其次为棕榈酸(占15.75%)，检索结果见表1-1。
[0055]表1-1注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分的氯仿提取物甲酯化产物有机酸GC-MS检索结果表
[0056]
【权利要求】
1.一种注射用益气复脉冻干粉提取物的甲酯化方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤1，注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分的制备； 步骤2，将步骤I所述注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分制备成注射用益气复脉冻干粉提取物； 步骤3，将步骤2所述注射用益气复脉冻干粉提取物和甲醇在酸性或碱性条件下进行甲酯化反应。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤I所述注射用益气复脉冻干粉碱醇部分的制备方法如下: 取注射用益气复脉冻干粉上大孔树脂柱，先用水洗脱，再用碱醇溶液洗脱，收集该碱醇洗脱液，浓缩干燥即得注射用益气复脉冻干粉碱醇部分。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述碱醇溶液为0.1-lmol/L NaOH的乙醇溶液，乙醇浓度为15%-35%。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述碱醇溶液为0.5mol/L Na0H25%乙醇溶液。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2所述注射用益气复脉冻干粉提取物制备方法如下: 取步骤I所述注射用益气复脉冻干粉碱醇洗脱部分，加氯仿，在20-4(TC下超声提取，提取液浓缩即得注射用益气复脉冻干粉提取物。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤3所述甲酯化反应，方法如下: 取注射用益气复脉冻干粉提取物，加入甲醇，酸或碱，混合后进行反应，反应完毕，用有机溶剂萃取。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，步骤3所述酸为1%_25%硫酸，所述碱为1-10%氢氧化钠或氢氧化钾。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述酸为10%硫酸。
9.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括正己烷、氯仿、乙酸乙酯。
10.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
【文档编号】G01N30/06GK103575577SQ201210258916
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月24日 优先权日:2012年7月24日
【发明者】叶正良, 逄小倩, 李德坤, 周大铮 申请人:天津天士力之骄药业有限公司