专利名称：牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药用植物新的医疗用途，尤其是牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物中 的新用途，属于中药、天然药物领域。
背景技术：
牛角瓜[Ca/ofra; "'g7'ga"fra (L.) Dryand ex Ait. f.]为萝摩禾斗(Asclepiadaceae)牛角瓜属 (Cfl/Wra/^)植物。别名五狗卧花、羊浸树、断胲草。牛角瓜属植物全世界共有6个种，分 布于东南亚。我国产牛角瓜和白花牛角瓜2种，分布于海南、云南、广东和广西等地，生长 于低海拔向阳山坡、旷野和海边。牛角瓜根、茎、叶、果各部及白色汁液均有大毒和强烈的 刺激性，食少量能引起呕吐和下泻，食大量则会发生严重的腹痛及肠炎，以致死亡，妊娠的 人畜中毒引起流产。牛角瓜入药可用作发汗剂、除痰剂、驱虫剂、驱风剂和强心剂，用于治 疗湿疹、麻疯病、梅毒、象皮病、哮喘等病症。
目前，已从牛角瓜植物中分离出50余种化合物，其中强心苷类化合物为主要的化学成分 (《现代本草纲目》(上巻)，2001年版)。至今文献报道多为牛角瓜强心苷类化合物在抗肿瘤 等方面的研究和应用(《Journal of Natural Product》，2006， 69: 1249;《Chemical Pharmaceutical Bulletin》，1998， 46: 528)，公开专利"PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING USCHARIDIN OR ITS ANALOGUES"(US 6342490 Bl)涉及强心苷抗肿瘤活性的研究，"一 种治疗癌症的强心苷类化合物及其制备方法"(专利CNI414010A)涉及强心苷类化合物提取 新工艺等。
癌症是一组可影响身体任何部位的100多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和 肿瘤。癌症是全世界一个主要死亡原因。在2005年全世界5800万死亡总数中，癌症占所有 死亡的760万(或13%)。导致癌症总死亡率的主要癌症种类为肺(130万死亡/年)，胃(约 100万死亡/年)，肝(662 000死亡/年)，结肠(655 000死亡/年)，乳腺(502 000死亡/年)。 目前的治疗手段为临床用药从单一药物治疗过渡到多药联合化疗，但是，绝大多数的治疗仅 能延长生命而不能根除病症，伴随治疗产生的许多毒副作用如肝功能衰竭和糖尿病等，使得 患者的免疫系统受到损害。目前从天然药物中寻找抗肿瘤药物是研究的热门课题。 一些中草 药的提取物如延命素(《云南植物研究》，2006， 28: 95)、牡荆苷(《热带亚热带植物学报》， 2008， 16: 51)、亚油酸(《上海医学》，1994， 17: 635)等具有抗肿瘤的活性，其化学结构 包括二萜、黄酮苷、有机酸等。大蒜、蘑菇、灵芝和人参等已被许多国家用于癌症治疗。
本发明所述的牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物中的新用途，至今尚未见文献报道和 专利公开。
发明内容
本发明的目的是提供牛角瓜新的医疗用途，即牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物中的 用途。
本发明的内容是牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述用途特征在于1、 牛角瓜提取物可通过下述步骤获得牛角瓜干燥根，适当粉碎后用8-11倍量95%乙醇室温浸 泡提取3次，也可渗漉提取，将提取液减压回收乙醇，减压回收乙醇至无醇味。将乙醇提取 物分散于水中成悬浊液，经石油醚萃取得到石油醚浸膏A，剩下的水液经过滤后上大孔吸附 树脂(D-101)柱层析，先后用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，经浓縮得到甲醇浸膏B。浸膏 A、 B干燥即得牛角瓜提取物A、牛角瓜提取物B; 2、牛角瓜提取物B和/或牛角瓜95。/。乙醇 提取物，添加适当的药用辅料，按常规的制剂工艺，即可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸 剂、口服液等口服药物制剂和注射药物制剂。
牛角瓜提取物B经薄层层析，用强心苷显色剂显色，显示牛角瓜提取物B含有强心苷类 化合物。
本发明的牛角瓜提取物B，经体外活性筛选，统计处理结果显示有较好的抗肿瘤活性。 为了进一步验证牛角瓜及其提取物在治疗肿瘤方面的功效，对牛角瓜提取物B进行了 100例 病人初步的临床疗效观察，结果表明牛角瓜提取物B是有效的。由牛角瓜提取物B的体外活 性筛选和病人初步临床疗效观察结果，可以合理推导牛角瓜及其提取物可用于制备抗肿瘤药 物，即牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物方面的用途。
本发明的有益效果是提供了牛角瓜在民间通常用于制备治疗湿疹、麻疯病等药物以外的 新的医疗用途，即牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物方面的用途，并采用不同的溶媒萃取 得到牛角瓜提取物B，牛角瓜提取物B添加适当的药用辅料，按常规的制剂工艺，即可制成 口服和注射药物制剂。
下面是牛角瓜提取物B的体外活性筛选和病人初步临床疗效观察试验及其结果。
一、体外活性筛选 试验方法
采用MTT法测试了牛角瓜提取物B对人体的胃癌细胞SGC-7901、慢性骨髓性白血病细 胞K562、人口腔表皮癌细胞KB、骨纤维肉瘤HT-1080、骨肉瘤(G-292、 KHOS/NP)、前列腺癌LNCap、胃腺癌(KKLS、 MKN-28、 MKN-45)等细胞株的体外抑瘤活性(结果见附表1)。活 性测试方法如下实验设阴性对照组(水)、DMSO溶剂对照组、阳性对照组(丝裂霉素C)和 8个不同浓度(0.8， 1.6， 3.2, 6.3, 12.5， 25， 50， 100 )的待测样品，每个浓度设2个平行。收集对数 生长期细胞，血球计数板计数，按每孔4500个癌细胞量接种于96孔平底细胞培养板中，置 于5%(:02、湿度90%以上、37'C培养箱中培养。24h后取出加入一定量的待测样品，继续 培养3 d后取出置于显微镜下观察每孔细胞形态，记录细胞形态变化情况，接着每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(溶于平衡盐溶液PBS) 50 ^L， 37 'C反应4 h后，将细胞培养液吸出， 每孔加入100 pL DMSQ将Formazane充分溶解，将细胞培养板置于MK3酶标仪上，用570 nm 波长测各孔的吸光度(A)，按下列公式求生长抑制率。
用药组平均A值
生长抑制率(％) =(1
-)xl00%
阴性对照组平均A值
以样品浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，作图并求出抑制率为50%时样品的浓度(1<:5())，
样品活性结果即以半数抑制浓度(IC50)表示。
实验结果.-
附表1样品对SGC-7901、 K562等肿瘤细胞株的毒性作用
Cell line
Human origin
IC50(//g/ml)
牛角瓜提取物B
SGC-7卯1Gastric cancer7.0
K562Chronic myelogenous leukemia3.3
KBOral epidermoid carcinoma0.16
HT-1080Fibrosarcoma0.20
G-292Osteosarcoma0.29
KHOS/NPOsteosarcoma0.033
LNCapProstate adenocarcinoma0.70
KKLSGastric adenocarcinoma0.14
MKN-28Gastric adenocarcinoma0.23
MKN-45Gastric adenocarcinoma0.43
注毒性值IC5fl,即药物对细胞杀灭50%时的浓度值。IC50值越大则毒性越小。
二、初步临床疗效观察
研究对象肿瘤患者，其中男63例，女37例，年龄最小者35岁，最大者73岁。
诊断标准1、无其他任何不良症状；2、没有服用过任何其他抗肿瘤药物。
研究方法该试验以100名肿瘤患者为研究对象，受试物为本发明成药(约含0.15g牛
角瓜提取物B的O号胶囊)服用， 一日三次，每次二粒，开水冲服。每40天为一个疗程， 连续两个疗程后停药休息一周，详细观察病情变化进行检査。然后进行第三个疗程治疗，在 服药期间停服其它药品。
临床治愈症状及客观检査阳性征象消失，连续半年无复发者。
临床显著症状基本消失，癌灶縮小一半以上，其它客观检查有明显好转，观察半年以 上不再发展者。
临床有效症状有所改善，病灶基本稳定，观察在一个月以上者。 临床无效症状及客观检査无改善，或仅有短期改善，而又迅速恶化者。 疗效结果:_
疗效_总例数_百分比_备注
临床治愈 58 58%
临床显著 16 16%
临床有效 17 17%
临床无效_^_^_扩散转移
本发明的优点是
1、 本发明选用的天然药物为原料，低毒，副作用小。
2、 本发明无须煎煮，治疗方便，有效率达91%。
3、 本发明能够控制癌细胞增生，防止癌细胞扩散，使癌细胞枯萎脱落消失。
4、 本发明提供低剂量(0.5~2mg/kg)即可产生抗肿瘤活性，因此长期低剂量(如0.6 1.25 mg/kg)比高剂量(5~10mg/kg)的抗肿瘤作用更强。
具体实施方式
实施例1
取牛角瓜干燥品2.0kg，用10倍量95%乙醇分3次(5、 3、 3天)浸提，减压回收乙醇， 浓縮干燥得到浸膏粉，浸膏粉加入淀粉适量，混均、制粒、干燥、整粒，装入胶囊，制成1000 粒即可。
实施例2
取牛角瓜干燥品10.0kg，用9倍量90%乙醇渗漉，减压浓缩渗漉液至无醇味得浓縮液， 浓縮液分散于水中成悬浊液，经石油醚萃取得到石油醚浸膏A，剩下的水液经过滤后上大孔 吸附树脂(D-101)柱层析，先后用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，经浓縮得到甲醇浸膏B， 浸膏B干燥即得牛角瓜提取物B。取牛角瓜提取物B 100 g，加入淀粉等适量辅料，混均、制
粒、干燥，压制成1000片即可。 实施例3
取牛角瓜干燥品5.0 kg，用8倍量80%乙醇渗漉，减压浓縮渗漉液至无醇味得浓縮液， 浓縮液分散于水中成悬浊液，经石油醚萃取得到石油醚浸膏，剩下的水液经过滤后上大孔吸 附树脂(D-101)柱层析，先后用水和甲醇洗脱，.收集甲醇洗脱液，经浓縮得到甲醇浸膏，甲醇 浸膏干燥即得牛角瓜提取物B;取牛角瓜提取物B 25g,加适量注射用水溶解，按常规的水针 剂工艺，调PH值、过滤、灌封、灭菌制成1000ml即可；或者添加适量附加剂如甘露醇，溶 解搅匀，过滤、冻干、分装制成500瓶即可。
权利要求
1、牛角瓜在制备抗肿瘤药物中的新用途，其特征在于所述牛角瓜为萝藦科(Asclepiadaceae)牛角瓜属(Calotropis)植物牛角瓜(Calotropis gigantea)，药用全株。
2、 牛角瓜提取物在制备抗肿瘤药物中的新用途，其特征在于牛角瓜提取物可通过下述步 骤获得牛角瓜干燥根，适当粉碎后用8-11倍量^5%乙醇室温浸泡提取3次，也可渗漉提取，将 提取液减压回收乙醇，减压回收乙醇至无醇味。将乙醇提取物分散于水中成悬浊液，经石油 醚萃取得到石油醚浸膏A，剩下的水液经过滤后上大孔吸附树脂(D-101)柱层析，先后用水和 甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，经浓缩得到甲醇浸膏B。浸膏A、 B干燥即得牛角瓜提取物A、 牛角瓜提取物B。
3、 根据权利要求2所述牛角瓜提取物，其特征在于所述牛角瓜提取物B含有强心苷类 化合物。
4、 根据权利要求l、 2所述用途，其特征在于将牛角瓜提取物B和/或牛角瓜95。/。乙醇 提取物，添加适当的药用辅料，按常规的制剂工艺，即可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸 剂、口服液等口服药物制剂和冻干粉针、水针等注射药物制剂。
全文摘要
本发明公开了牛角瓜及其提取物在制备抗肿瘤药物中的新用途，属于中药、天然药物领域。牛角瓜通过乙醇提取，用石油醚进行萃取，剩下的水液经过滤后上大孔吸附树脂(D101)柱层析，先后用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，经浓缩得到甲醇部位，经实验证明，提取所得到的甲醇部位具有抗肿瘤细胞的作用。
文档编号A61K9/10GK101352468SQ20081013764
公开日2009年1月28日 申请日期2008年7月2日 优先权日2008年7月2日
发明者娇 吴, 戴好富, 曾艳波, 梅文莉, 王祝年, 王茂媛 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所