专利名称：一种培育超氧化物歧化酶黄瓜的方法及其专用生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培育超氧化物歧化酶黄瓜的方法及其专用生物制剂。
背景技术：
黄瓜含多种维生素和蛋白质等，有补血开胃、增进食欲的作用。它可以腌渍、酱制、鲜食，是常年供应的蔬菜。黄瓜原产印度，已有4千年的种植历史。黄瓜属葫芦科一年生植物。雌雄同株而异花，花色鲜黄，花冠钟形朝开夕闭，雌花能单性结实。果实棒状或圆筒形，但易弯曲畸形，表面有刺毛。公元前138年，张骞通西域时，带回瓜种，当时中亚一带泛称“胡”，所以又叫胡瓜。黄瓜含有可抑制糖类转化成脂肪的物质，有肥胖倾向并爱吃糖类食品的人，最好同时吃些黄瓜，可抑制糖类的转化和脂肪的积累，达到减肥的目的。用鲜黄瓜汁涂搽皮肤，有惊人的润肤去皱美容效果，所以黄瓜有美容菜之称，现已制成系列化妆品，如黄瓜营养霜、黄酶香波、黄瓜护发素等，主要是黄瓜中含有丰富的生物活性酶，能促进肌体代谢。黄瓜还可当无毒驱蟑螂药使用。
SOD酶(超氧化物歧化酶)是生物重要保护酶之一，能增强机体抗逆能力，防衰老。专利号为93103774.3、发明名称为“一种产生超氧化物歧化酶的芽孢杆菌及其生产方法”的中国发明专利中公开了一株芽孢杆菌，菌株保藏号为CGMCC No.0175，该菌株具有较强的产生超氧化物歧化酶的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育超氧化物歧化酶黄瓜的方法及其专用生物制剂。
本发明提供的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂(黄瓜专用SOD制剂)，包括活性成分和吸附剂，所述活性成分是2.5-3.5×1010cfu/g生物制剂的芽孢杆菌CGMCC No.0175。
所述吸附剂可为轻质碳酸钙、草炭或腐植酸。
所述轻质碳酸钙、草炭或腐植酸的重量为所述芽孢杆菌菌体重量的5-7倍。
所述轻质碳酸钙、草炭或腐植酸的细度可为0.08-0.1mm，优选为0.09mm。
本发明提供的培育超氧化物歧化酶黄瓜的方法，是用上述培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂浸种，再在黄瓜生长期向黄瓜植株喷施上述培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂。
在实际应用中，所述用培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂浸种的方法可为用上述培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂300-500倍液浸种30分钟，晾干后播种；所述在黄瓜生长期向黄瓜植株喷施上述培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂的方法可为在黄瓜出苗后15天，利用上述培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂800-1200倍液开始向植株喷雾，每隔15-20天喷一次，共喷3-5次。
用本发明的培育超氧化物歧化酶黄瓜的方法培育得到的超氧化物歧化酶黄瓜(SOD黄瓜)也在本发明的保护范围之内。
SOD黄瓜是将培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂应用在黄瓜的生产过程中，结合黄瓜的栽培管理，获得的高含SOD酶的黄瓜。SOD黄瓜除了保持原有黄瓜的优良性状，SOD含量明显提高，具有增强人体免疫力和延缓衰老的功效。因此，SOD黄瓜市场前景看好，符合绿色食品和功能食品的发展方向。
本发明的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂通过植物有益内生芽孢杆菌在黄瓜植株体内繁殖、转移，提高黄瓜体内的SOD活性和含量。使用黄瓜专用SOD制剂后，黄瓜产生的SOD酶有较强的耐温抗热性和抗逆能力，在70℃条件下处理1小时，酶活为原酶活的80％以上；100℃条件下处理20分钟，酶活为原酶活的70％以上；对臭氧、高温高酸的耐性强；黄瓜专用SOD制剂是由植物体内有益内生共生芽孢杆菌中制备而成，具有高度的安全性。因此，利用黄瓜专用SOD制剂培育的黄瓜保持了较高的SOD酶活，而且在深加工过程中仍可保持较高的SOD酶活。
图1为SOD黄瓜的栽培生产流程图。
具体实施例方式
下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、SOD黄瓜的培育一、黄瓜专用SOD制剂的制备1、菌株的发酵生产1)制备条件灭菌条件温度121-125℃，压力0.11-0.14Mpa，时间30min；培养条件温度28-34℃，压力0.05Mpa，通气值1∶1，pH值7-7.5；放罐指标含菌量≥70亿cfu/ml，芽孢形成≥70％，杂菌率≤0.3％。
2)菌种生产从芽孢杆菌CGMCC No.0175原菌种斜面上挑取少许在备用斜面试管内划线，置于28-30℃温箱中培养24h，取出检查，确认无杂菌污染，菌体生长整齐时，再继续培养24-48h，然后涂片、染色，并在油镜下观察，无杂菌污染，孢子整齐时，作为发酵生产的菌种。
3)发酵生产发酵生产分种子罐培养和发酵罐培养两部分进行，发酵液达到规定指标时及时放罐。其中，种子罐培养和发酵罐培养按照专利号为93103774.3的发明专利描述的方法进行。
2、制备生物制剂1)添加吸附剂向得到的发酵液中投入重量为发酵液1/10的细度为0.09mm的轻质碳酸钙或草炭或腐植酸，然后机械搅拌3-6小时，使芽孢杆菌充分被载体吸附。
2)压滤采用明流式或暗流式板扛压滤机滤去多余水份。
3)干燥低温干燥(不超过70℃)，使含水率≤5％。
4)粉碎用超细度粉碎机粉碎，细度要求为100％通过0.09mm孔径筛，控制细度的目的是为防止使用时堵塞喷头。
5)包装得到SOD制剂为白色或灰色粉末，芽孢杆菌含量为3.0×1010cfu/g，含水率≤5％，细度为100％通过0.09mm筛。
二、SOD黄瓜的培育SOD黄瓜的培育步骤流程图如图1所示，具体步骤如下黄瓜种子用黄瓜专用SOD制剂300-500倍液浸种30分钟，晾干后播种，常规方法种植，在黄瓜出苗后15天，再利用黄瓜专用SOD制剂800-1200倍液开始喷雾，每隔15-20天喷一次，共喷3-5次；喷洒应达到稀释液均匀附着整个植株。黄瓜专用SOD制剂在喷施过程中可与其他栽培管理结合，不发生矛盾。
黄瓜专用SOD制剂可与杀虫剂、杀菌剂(杀细菌剂除外)、植物生长调节剂、叶面肥等混和使用；在SOD黄瓜生产过程中，除去黄瓜专用SOD制剂的处理外，其他栽培措施仍可按照当地常年积累总结形成的操作规程执行。
实施例2、SOD黄瓜的SOD酶活测定以清水代替黄瓜专用SOD制剂、其他栽培管理措施与实施例1中培育SOD黄瓜的栽培管理措施一致的条件培养的黄瓜为对照；测定SOD黄瓜和对照黄瓜的SOD酶活，SOD的测定方法采用NBT光化学法，具体如下1)设备752型分光光度计；台式离心机；光照培养箱；冰箱；10ml小烧杯等。
2)试剂氯化硝基氮蓝四唑(NBT)——上海前进制剂厂生产
L-甲硫氨酸(L-Met)————上海康达氨基酸厂生产乙二胺四乙酸(EDTA)———北京化工厂生产核黄素(VB2)—————— 北京西中化工厂生产3)反应液的配制NBT反应液的制备配制pH7.8，50mmol/L的磷酸缓冲液1000ml，加入1.933mg的L-Met(L-甲硫氨酸)，待完全溶解后，放入45.8mg NBT(氯化硝基氮蓝四唑)，0.47mg核黄素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mgEDTA，溶液终浓度Met为13mmol/L；NBT为6.3×10-3mmol/L；核黄素为1.3×10-3mmol/L；EDTA为0.1mmol/L，置于棕色试剂瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1个月。
4)材料的预处理黄瓜果肉用研钵研碎，按照果肉∶50mM磷酸缓冲液＝1∶2的比例加入缓冲液，10000rpm离心10分钟，取上清液进行SOD酶活测定。
5)测定方法吸取30μl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3mlNBT反应液，混匀，在28℃SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20分钟(光照为4000勒克司)，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设3次重复，整个测定过程除光化反应外，均在避光或弱光条件下进行。同时测试过程中以美国″Sigma″公司、上海宝安公司的标准酶和贵州老来福药业公司生产的SOD口服液作为测试对照。
6)计算SOD酶活(IU/g)＝(OD对照-OD样品)/(1/2OD对照)×稀释倍数黄瓜中SOD酶活测定结果如表1所示，结果表明，SOD黄瓜中SOD酶活显著高于普通黄瓜，且在a＝0.05水平差异显著，酶活提高70.2％。说明通过该项技术可以生产出具有高SOD酶活的SOD保健黄瓜。
表1.SOD黄瓜的SOD活性测定
注A和B是方差分析差异的表示方法，表示SOD黄瓜与对照普通黄瓜的SOD酶活差异显著。
实施例3、SOD黄瓜中SOD的耐热性测定以清水代替SOD制剂、其他栽培管理措施与实施例1中制备SOD黄瓜的栽培管理措施一致的条件培养的黄瓜为对照；用实施例2的SOD酶活性测定方法，测定在100℃中保持20分钟的实施例1制备的SOD黄瓜和对照黄瓜的SOD酶活性，结果见表2。
由表2可知，经过热处理后，SOD黄瓜中仍保持较高的SOD酶活，但对照含有的SOD酶活极低。说明通过该项技术生产的SOD黄瓜，适于在常温下保存和进行深加工，仍能保持较高的SOD活性。
表2.SOD黄瓜中SOD的抗热性测定
注A和B是方差分析差异的表示方法，表示SOD黄瓜与对照普通黄瓜的SOD酶活差异显著。
权利要求
1.一种培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂，包括活性成分和吸附剂，所述活性成分是2.5-3.5×1010cfu/g生物制剂的芽孢杆菌CGMCC No.0175。
2.根据权利要求1所述的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂，其特征在于所述吸附剂是轻质碳酸钙、草炭或腐植酸。
3.根据权利要求2所述的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂，其特征在于所述轻质碳酸钙、草炭或腐植酸的颗粒细度为0.08-0.1mm。
4.根据权利要求3所述的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂，其特征在于所述轻质碳酸钙、草炭或腐植酸的颗粒细度为0.09mm。
5.一种培育超氧化物歧化酶黄瓜的方法，是用权利要求1-4中任一所述的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂浸种，再在黄瓜生长期向黄瓜植株喷施权利要求1-4中任一所述的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述用权利要求1-4中任一所述的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂浸种的方法为用所述培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂的300-500倍稀释液浸种30分钟，晾干后播种。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述在黄瓜生长期向黄瓜植株喷施权利要求1-4中任一所述的培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂的方法是在黄瓜出苗后15天，利用所述培育超氧化物歧化酶黄瓜的专用生物制剂的800-1200倍稀释液开始喷雾，每隔15-20天喷一次，共喷3-5次。
8.用权利要求5或6或7所述的方法培育得到的黄瓜果实。
全文摘要
本发明公开了一种培育超氧化物歧化酶黄瓜的方法及其专用生物制剂。该培育黄瓜专用SOD制剂，包括活性成分和吸附剂，所述活性成分是2.5－3.5×10
文档编号A01G7/06GK1807589SQ20061000011
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月4日 优先权日2006年1月4日
发明者王 琦, 赵国防, 姜立强, 马连安, 梅汝鸿 申请人:中国农业大学