一种绿脓杆菌疫苗及其制备方法

专利名称：一种绿脓杆菌疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗及其制备方法。
背景技术：
绿脓肝菌是一种条件致病菌，对外界环境适应能力很强，在潮湿环境下可 长期存活。人正常皮肤尤其是潮湿部位(如腋下、会阴部、耳道、呼吸道和肠 道等处)均有绿脓肝菌的存在，而完整的皮肤和粘膜作为屏障能够有效的抵御 绿脓肝菌的入侵，但人体的正常防御机制下降或受到损伤(如皮肤粘膜损伤、 粒细胞缺乏、低蛋白血症、肿瘤的放化疗、长期应用激素和抗生素、烧伤、婴 幼儿皮肤、脐带、肠道，老年人泌尿系统)则容易引发绿脓肝菌感染。
据报道绿脓杆菌引起的院内感染占10% 31.5%，居病原菌之首，国内外 烧伤中心对细菌感染的临床调査中发现绿脓杆菌感染占50%以上。目前对绿脓 杆菌感染的治疗有抗菌素和免疫两种治疗方法。长期使用抗菌素治疗绿脓杆菌 导致大量耐药菌株的产生，并破坏人体中正常菌群，引起继发感染，致使治疗 失败；而且绿脓杆菌的耐药机理十分复杂，其中绿脓杆菌细胞外膜通透性低(仅 为大肠杆菌的0.2%~1.0%)和外排各种物质的复杂主动排出系统(目前研究已 发现绿脓杆菌细胞膜内存在着由3种蛋白质构成的"外排泵"，可以排出对自 身有害的物质)在多重耐药中起着致关重要的作用。因此绿脓杆菌感染已到了 无抗菌素可用的地步，目前患者一旦感染很难治愈，特别是败血症，死亡率极 高。目前己检测出11型(分为1 XI型)绿脓杆菌，因此单一价态的绿脓杆菌 疫苗不能满足临床免疫的需求。

发明内容
本发明的目的是为了解决目前抗菌素难以治愈绿脓杆菌感染，以及单一价 态的绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求的问题，而提供的一种绿脓杆菌疫 苗及其制备方法。
本发明绿脓杆菌疫苗由置于生理盐水中的绿脓杆菌Pi的内毒素、绿脓杆 菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌Pn)3的类毒素组成；绿脓杆菌疫苗中绿脓杆菌Pi的内毒素的浓度以蛋白质质量计为l/6~l/3mg/mL、绿脓 杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为l/6~l/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒 素的浓度以蛋白质质量计为l/6~l/3mg/mL、绿脓杆菌P朋的类毒素的浓度以 蛋白质质量计为0.5~lmg/mL;其中绿脓杆菌&保藏于中国医学微生物菌种保 藏管理中心，保藏号为10115;绿脓杆菌P2保藏于中国医学微生物菌种保藏管 理中心，保藏号为10116;绿脓杆菌P6保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中 心，保藏号为10120;绿脓杆菌Pu)3保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心， 保藏号为10103。
上述绿脓杆菌疫苗按以下步骤制备 一、将绿脓杆菌Pi、 P2和P6分别接
种于牛肉膏蛋白胨培养基在37 42'C条件下培养18 24h，然后用内毒素液体 合成培养基将绿脓杆菌冲洗入摇瓶再在37 42°C、 175 200r/min的条件下振 荡培养24 30h，之后调节内毒素液体合成培养基pH值至6.5 8.5，再加入 甲苯放于37 42。C到环境中静置48 72h，然后用1000K 3000K的滤板进行 超滤，收集滤液；二、分别向滤液中加入浓度为30 50g/mL的ZnCl2溶液， 然后搅拌、沉淀，再在4。C、 4000r/min的条件下离心20min，弃去上清液，按 饱和Na2HP04溶液与沉淀物5 : 1的体积比向沉淀物中加入饱和的Na2HP04 溶液，再在37 42'C的条件下电磁搅拌2h，然后置于0 4'C环境8 10h，再 在4°C、 4000r/min的条件下离心20min，取上清液分别得到绿脓杆菌P,、 P2 和P6的粗制内毒素；三、分别调节绿脓杆菌Pi、 P2和P6的粗制内毒素pH值 至7.2，然后流水透析72 120h，再用电风扇浓縮透析袋内液体体积，之后将 透析袋冰浴并按透析袋内液体与丙酮1 :2的体积比加入丙酮，再在4°C、 4000r/min的条件下离心20min，取沉淀物置于37'C环境中干燥，得到绿脓杆 菌P,、 P2和P6内毒素；四、将绿脓杆菌PuB接种于产毒培养基在32 4(TC、 120 150r/min条件下振荡培养22 28h，然后按1% (体积)的接种量接种于 新鲜的产毒培养基中在32 4(TC、 12(M50r/min条件下振荡培养22 28h，再 在4匸、7000r/min条件下离心30min，收集上清液并加入硫柳汞，硫柳汞终浓 度为0.2 0.8mL/L，再在4"C环境中放置24 28h得到无菌粗毒素；五、将粗 毒素流水透析24 72h，再加入浓度为lmol/L、透析液l/2体积乙酸，然后在 4°C、 8000r/min条件下离心30min，再将离心沉淀物溶解于浓度为0.1 0.5mol/L
6的柠檬酸钠溶液中，再用浓度为0.01mol/L、 pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液透 析过夜，之后加入固体硫酸铵至饱和，再在4"C、 7000r/min条件下离心30min， 离心沉淀物用浓度为O.01mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，再在4。C条件下用浓 度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后加入DE-52纤维素搅拌 30min，再放入4。C环境中静置lh，将去除上清液的纤维素装柱，并依次用pH 值为8.0、 NaCl浓度为0.05mol/L、 0.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl缓冲液 进行阶段洗脱，收集NaCl浓度为0.13mol/L阶段的洗脱液并加入固体硫酸铵 至硫酸铵30%饱和度，再在4。C、 7000r/min条件下离心30min，取离心上清液 加入固体硫酸铵至硫酸铵70饱和度，再4'C静止30 min后在4'C、 7000r/min 条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为O.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度 为O.05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解；六、用浓度为O.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤DE-52纤维素柱，再把步骤五 溶解了离心沉淀物的Tris-HCl缓冲液加入DE-52纤维素柱，然后用浓度为 O.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度为0.05 0.30mol/L的Tris-HCl缓冲液梯度 洗脱，收集洗脱液用聚乙二醇-6000浓縮，得到绿脓杆菌P^的类毒素；七、
将绿脓杆菌Pi的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓
杆菌P1Q3的类毒素置于生理盐水中，其中绿脓杆菌P,的内毒素的浓度以蛋白 质质量计为l/6~l/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为 1/6 1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6 1/3mg/mL、 绿脓杆菌PuB的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5~lmg/mL，即得到绿脓杆 菌疫苗；步骤一中甲苯纯度为分析纯，甲苯与内毒素液体合成培养的体积比为 0.21 0.52 : 1;步骤一内毒素液体合成培养基中含有2.0% (质量)的谷氨酸 钠、0.75% (质量)的葡萄糖、0.2% (质量)WMgS04.7H20、 0.001% (质量) 的Ca(N03) 2、 0.000005% (质量)的FeS04'7H20、 0.0252% (质量)的KH2P04 和0.563% (质量)的Na2HP04'12H20， pH值为7.6;步骤二中每lOOmL滤 液中加入ZnCl2溶液3.2mL;步骤三中丙酮纯度为分析纯；步骤五Tris-HCl缓 冲液中的三羟甲基氨基甲烷为分析纯。
本发明绿脓杆菌P,、 P2 、 P6和Pu)3保藏于中国医学微生物菌种保藏管理
中心(CMCC)，中国医学微生物菌种保藏管理中心负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应。本发明菌种(绿脓杆菌Pi、 P2 、 P6 和P朋)从中国医学微生物菌种保藏管理中心购买得到。
本发明绿脓杆菌疫苗属于多价态疫苗，因采用了绿脓杆菌P,、 P2和Pe的 内毒素，所以可以免疫己知的11型(分为I XI型)绿脓杆菌，而且由于加入 了绿脓杆菌P1Q3的类毒素，增强了疫苗对绿脓杆菌的免疫效果。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式绿脓杆菌疫苗由置于生理盐水中的绿脓杆菌 Pj的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌Pu)3的
类毒素组成；绿脓杆菌疫苗中绿脓杆菌P,的内毒素的浓度以蛋白质质量计为 1/6 1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6 1/3mg/mL、 绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为l/6~l/3mg/mL、绿脓杆菌P103 的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5~lmg/mL;其中绿脓杆菌P,保藏于中国 医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10115;绿脓杆菌P2保藏于中国医学 微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10116;绿脓杆菌P6保藏于中国医学微生 物菌种保藏管理中心，保藏号为10120;绿脓杆菌PuB保藏于中国医学微生物 菌种保藏管理中心，保藏号为10103。
本实施方式中所选用的绿脓杆菌P^ P2 、 P6和Pu)3菌株为La型菌株。
具体实施方式
二本实施方式绿脓杆菌疫苗按以下步骤制备 一、将绿脓
杆菌Pi、P2和P6分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基在37 42"C条件下培养18 24h，然后用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗入摇瓶再在37 42°C、 175 200r/min的条件下振荡培养24 30h，之后调节内毒素液体合成培养基 pH值至6.5 8.5，再加入甲苯放于37 42。C到环境中静置48 72h，然后用 1000K 3000K的滤板进行超滤，收集滤液；二、分别向滤液中加入浓度为30 50g/mL的ZnCl2溶液，然后搅拌、沉淀，再在4"C、 4000r/min的条件下离心 20min，弃去上清液，按饱和Na2HP04溶液与沉淀物5 : 1的体积比向沉淀物 中加入饱和的Na2HP04溶液，再在37 42"C的条件下电磁搅拌2h，然后置于 0 4。C环境8 10h，再在4°C、 4000r/min的条件下离心20min，取上清液分别得到绿脓杆菌Pi、 P2和P6的粗制内毒素；三、分别调节绿脓杆菌P,、 P2和
P6的粗制内毒素pH值至7.2，然后流水透析72 120h，再用电风扇浓縮透析 袋内液体体积，之后将透析袋冰浴并按透析袋内液体与丙酮1 : 2的体积比加 入丙酮，再在4t、 4000r/min的条件下离心20min，取沉淀物置于37"C环境
中干燥，得到绿脓杆菌P" P2和P6内毒素；四、将绿脓杆菌P,03接种于产毒
培养基在32 4(TC、 120 150r/min条件下振荡培养22 28h，然后按1% (体 积)的接种量接种于新鲜的产毒培养基中在32 40°C、 120~150r/min条件下 振荡培养22 28h，再在4。C、 7000r/min条件下离心30min，收集上清液并加 入硫柳汞，硫柳汞终浓度为0.2~0.8mL/L，再在4'C环境中放置24 28h得到 无菌粗毒素；五、将粗毒素流水透析24 72h，再加入浓度为lmol/L、透析液 1/2体积乙酸，然后在4"、 8000r/min条件下离心30min，再将离心沉淀物溶 解于浓度为0.1 0.5mol/L的柠檬酸钠溶液中，再用浓度为0.01mol/L、 pH值为 8.0的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后加入固体硫酸铵至饱和，再在4°C、 7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为O.01mol/L的Tris-HCl缓冲 液溶解，再在4'C条件下用浓度为O.01mol/L的Tris-HCl缓冲液透析过夜(去 除甲醛)，然后加入DE-52纤维素搅拌30min，再放入4"C环境中静置lh，将 去除上清液的纤维素装柱，并依次用pH值为8.0、 NaCl浓度为O.05mol/L、 O.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱，收集NaCl浓度为 O.13mol/L阶段的洗脱液并加入固体硫酸铵至硫酸铵30%饱和度，再在4°C、 7000r/min条件下离心30min，取离心上清液加入固体硫酸铵至硫酸铵70饱和 度，再4。C静止30min后在4。C、 7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用 浓度为O.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度为O.05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶 解；六、用浓度为O.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度为O.05mol/L的Tris-HCl 缓冲液洗涤DE-52纤维素柱，再把步骤五溶解了离心沉淀物的Tris-HCl缓冲 液加入DE-52纤维素柱，然后用浓度为O.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度为 O.05 0.30mol/L的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集洗脱液用聚乙二醇-6000浓
縮，得到绿脓杆菌Pu)3的类毒素；七、将绿脓杆菌P,的内毒素、绿脓杆菌P2 的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P1Q3的类毒素置于生理盐水中， 其中绿脓杆菌Pi的内毒素的浓度以蛋白质质量计为l/6~l/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6 1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的 浓度以蛋白质质量计为1/6 1/3mg/mL、绿脓杆菌Pub的类毒素的浓度以蛋白 质质量计为0.5 lmg/mL，即得到绿脓杆菌疫苗；步骤一中甲苯纯度为分析纯， 甲苯与内毒素液体合成培养的体积比为0.21 0.52: 1;步骤一内毒素液体合 成培养基中含有2.0% (质量)的谷氨酸钠、0.75% (质量)的葡萄糖、0.2% (质 量)的MgS04'7H20、 0.001% (质量)的Ca(N03) 2、 0.000005% (质量)的FeSO 4'7H20、 0.0252% (质量)的KH2P04和0.563% (质量)的Na2HP04'12H20， pH值为7.6;步骤二中每100mL滤液中加入ZnCl2溶液3.2mL;步骤三中丙酮 纯度为分析纯；步骤五Tris-HCl缓冲液中的三羟甲基氨基甲垸为分析纯。
本实施方式设施与生产质量管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实 施。本实施方式原料及辅料符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅 材料质控标准》的要求，未纳入上述标准的化学试剂，纯度应不低于分析纯。 本实施方式生产用水源水符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水应符合现行 《中国药典》标准。本实施方式直接用于生产的器具均为不锈钢或玻璃器具， 都经过严格清洗、去热原质处理及无菌化处理。
本实施方式中采用硫柳汞对绿脓杆菌P1Q3的外毒素进行类毒化。本实施方 式制备的绿脓杆菌疫苗中硫柳汞含量不高于0.1g/L。
本实施方式绿脓杆菌疫苗可用于防治绿脓杆菌感染，如烧伤、手术、截瘫 等所致的急、慢性及耐药性绿脓杆菌感染性疾病。
本实施方式绿脓杆菌疫苗用于预防绿脓杆菌感染受伤后或术后6天内第 一次注射绿脓杆菌疫苗(效果最好)，第一次免疫后第一周内进行第2 3次免 疫注射，之后每周免疫注射1次，共10次。
本实施方式绿脓杆菌疫苗用于治疗绿脓杆菌感染隔日免疫注射l次，7 次为1疗程，间隔1周，可进行第二疗程，直至痊愈为止。
本实施方式绿脓杆菌疫苗采用肌肉注射，成人每次注射0.5m L，小儿可 酌减。本实施方式绿脓杆菌疫苗可以有效的预防和治疗已知的11型绿脓杆菌。
本实施方式绿脓杆菌疫苗使用时个别人(不到0.1 1.0%)可能产生疫苗 反应即局部红肿、压痛或全身不舒服等症状，若红肿面积超过7cm,或发烧 38。C以上，应立即停药。若发生休克要立即注射0.1%肾上腺素进行急救。本实施方式绿脓杆菌疫苗使用前应摇匀后使用。
有药物过敏史者，有活动性肺结核及高血压、冠心病者及孕妇慎用。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤三中电 风扇的风温为25 50'C。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤一中将
经过牛肉膏蛋白胨培养基培养的绿脓杆菌Pp P2和P6分别置于37 42'C的环 境中扩大培养18h，然后再用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗。其它步
骤及参数与实施方式二相同。 本实施方式中采用震荡扩大培养。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤五中纤 维素装柱的尺寸为2.6cmX60cm。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤三中透
析袋内液体体积浓縮至50%。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤四中产
毒培养基按以下步骤制备先将45.0g胰蛋白酶大豆肉汤干粉(TSB)溶于 131.0mL水中，再置于4。C、体积为1500mL的水透析8 10h，然后向透析液 内加入15mL甘油和9.36g谷氨酸钠并定容至1500.0mL，即得到产毒培养基。 其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤七中绿 脓杆菌Pt的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素 的浓度以蛋白质质量计为1/6mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质 量计为1/6mg/mL、绿脓杆菌PK)3的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5mg/mL。 其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤七中绿
脓杆菌P,的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素 的浓度以蛋白质质量计为1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质 量计为1/3mg/mL、绿脓杆菌P1C3的类毒素的浓度以蛋白质质量计为lmg/mL。 其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤七中绿脓杆菌Pi的内毒素的浓度以蛋白质质量计为0.25mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒 素的浓度以蛋白质质量计为0.25mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白 质质量计为0.25mg/mL、绿脓杆菌P1Q3的类毒素的浓度以蛋白质质量计为 0.8mg/mL。其它步骤及参数与实施方式二相同。
对具体实施方式
八、九和十中制备得到的绿脓杆菌疫苗进行检测
绿脓杆菌疫苗为无色或淡黄色澄明液体，澄明度符合药典要求；绿脓杆菌 疫苗的pH值为6.0 7.5。
绿脓杆菌疫苗的效价均高于1 : 64。用具体实施方式
八、九和十中制备得 到的绿脓杆菌疫苗免疫体重为1.7 2.0Kg的家兔(自然抗体效价为1 : 10)， 每隔3天免疫一次，共免疫3次(每次注射绿脓杆菌疫苗0.75 1.25mg)，末 次免疫后第7天耳静脉采血，接受免疫的家兔效价均高于1 : 64。
按《生物制品异常毒性试验规程》进行测试，实验小鼠随机分成3组，第 一组每只小鼠注射具体实施方式
八制备得到的绿脓杆菌疫苗0.5mL，第二组每 只小鼠注射具体实施方式
九制备得到的绿脓杆菌疫苗0.5mL，第三组每只小鼠 注射具体实施方式
十制备得到的绿脓杆菌疫苗0.5mL。免疫注射7天后实验小 鼠全部存活，说明本发明绿脓杆菌疫苗无异常毒性。
具体实施方式
八、九和十中制备得到的绿脓杆菌疫苗于2 8t:避光保存 或运输有效期达2年。
选用体重为14 16g昆明种小鼠60只，随机分成6组(第1组每只小鼠 注射具体实施方式
八制备得到的绿脓杆菌疫苗，第2组每只小鼠注射具体实施 方式九制备得到的绿脓杆菌疫苗，第3组每只小鼠注射具体实施方式
十制备得 到的绿脓杆菌疫苗)，第1至第3组每只小鼠皮下注射0.5mL绿脓杆菌疫苗， 共免疫注射2次(间隔为7天)，末次免疫后第9 11天进行绿脓杆菌攻击。 第1至第3组小鼠每只腹腔注射1MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)，第4 组小鼠每只腹腔注射2MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)，第5组小鼠每只 腹腔注射1MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)，第6组小鼠每只腹腔注射 0.5MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)。观察3天，第4及第5组小鼠全部 死亡，第6组小鼠部分死亡，第l、第2及第3组中存活的小鼠数量均大于7 只(存活率〉70°/0)。同样采用MLD(最小致死量)攻击法，攻击用菌为已知的11型绿脓杆菌，
分别进行攻击；分别接种具体实施方式
八、九和十中制备的绿脓杆菌疫苗的小 鼠存活率都高于70%。
权利要求
1、一种绿脓杆菌疫苗，其特征在于绿脓杆菌疫苗由置于生理盐水中的绿脓杆菌P1的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P103的类毒素组成；绿脓杆菌疫苗中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5～1mg/mL；其中绿脓杆菌P1保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10115；绿脓杆菌P2保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10116；绿脓杆菌P6保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10120；绿脓杆菌P103保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10103。
2、 如权利要求1所述的绿脓杆菌疫苗的制备方法，其特征在于绿脓杆菌疫苗按以下步骤制备 一、将绿脓杆菌P,、 P2和P6分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基在37 42t条件下培养18 24h，然后用内毒素液体合成培养基将绿脓 杆菌冲洗入摇瓶再在37 42°C、 175 200r/min的条件下振荡培养24 30h， 之后调节内毒素液体合成培养基pH值至6.5 8.5，再加入甲苯放于37 42"C 到环境中静置48 72h，然后用1000K 3000K的滤板进行超滤，收集滤液；二、 分别向滤液中加入浓度为30 50g/mL的ZnCl2溶液，然后搅拌、沉淀， 再在4X:、 4000r/min的条件下离心20min，弃去上清液，按饱和Na2HP04溶 液与沉淀物5 : 1的体积比向沉淀物中加入饱和的Na2HP04溶液，再在37 42 ""C的条件下电磁搅拌2h，然后置于0 4'C环境8 10h，再在4。C、 4000r/min 的条件下离心20min，取上清液分别得到绿脓杆菌P,、 P2和P6的粗制内毒素；三、 分别调节绿脓杆菌Ph P2和P6的粗制内毒素pH值至7.2，然后流水透析 72 120h，再用电风扇浓縮透析袋内液体体积，之后将透析袋冰浴并按透析袋 内液体与丙酮1 : 2的体积比加入丙酮，再在4°C、 4000r/min的条件下离心 20min，取沉淀物置于37t:环境中干燥，得到绿脓杆菌P!、 P2和P6内毒素；四、 将绿脓杆菌Pu)3接种于产毒培养基在32 4(rC、 120 150r/min条件下振 荡培养22 28h，然后按1% (体积)的接种量接种于新鲜的产毒培养基中在 32 40°C、 120 150r/min条件下振荡培养22 28h，再在4。C、 7000r/min条件下离心30min，收集上清液并加入硫柳汞，硫柳汞终浓度为0.2 0.8mL/L，再 在4'C环境中放置24 28h得到无菌粗毒素；五、将粗毒素流水透析24 72h， 再加入浓度为lmol/L、透析液l/2体积乙酸，然后在4。C、 8000r/min条件下 离心30min，再将离心沉淀物溶解于浓度为0.1 0.5mol/L的柠檬酸钠溶液中， 再用浓度为0.01mol/L、 pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后加入固 体硫酸铵至饱和，再在4。C、 7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度 为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，再在4匸条件下用浓度为0.01mol/L的 Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后加入DE-52纤维素搅拌30min，再放入4'C环 境中静置1 5h，将去除上清液的纤维素装柱，并依次用pH值为8.0、 NaCl 浓度为0.05mol/L、 0.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱， 收集NaCl浓度为0.13mol/L阶段的洗脱液并加入固体硫酸铵至硫酸铵30%饱 和度，再在4。C、 7000r/min条件下离心30min，取离心上清液加入固体硫酸铵 至硫酸铵70饱和度，再4"C静止30 min后在4°C 、7000r/min条件下离心30min， 离心沉淀物用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl 缓冲液溶解；六、用浓度为0.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度为0.05mol/L 的Tris-HCl缓冲液洗涤DE-52纤维素柱，再把步骤五溶解了离心沉淀物的 Tris-HCl缓冲液加入DE-52纤维素柱，然后用浓度为0.01mol/L、 pH值为8.0、 NaCl浓度为0.05 0.3Omol/L的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集洗脱液用聚乙二醇-6000浓縮，得到绿脓杆菌Pu)3的类毒素；七、将绿脓杆菌Pi的内毒素、 绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌Pu)3的类毒素置于生理盐水中，其中绿脓杆菌Pi的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6 1/3mg/mL、 绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6 1/3mg/mL、绿脓杆菌P6 的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6 1/3mg/mL、绿脓杆菌P1()3的类毒素的 浓度以蛋白质质量计为0.5~lmg/mL，即得到绿脓杆菌疫苗；步骤一中甲苯纯 度为分析纯，甲苯与内毒素液体合成培养的体积比为0.21 0.52: 1;步骤一 内毒素液体合成培养基中含有2.0% (质量)的谷氨酸钠、0.75% (质量)的葡 萄糖、0.2% (质量)的MgS04'7H20、 0.001% (质量)的Ca(N03)2、 0.000005% (质量)的FeS0 4'7H20、 0.0252% (质量)的KH2PO^n 0.563% (质量) 的Na2HP04'12H20， pH值为7.6;步骤二中每lOOmL滤液中加入ZnCl2溶液3.2mL;步骤三中丙酮纯度为分析纯；步骤五Tris-HCl缓冲液中的三羟甲基氨 基甲烷为分析纯。
3、 根据权利要求2所述的绿脓杆菌疫苗的制备方法，其特征在于步骤三 中电风扇的风温为25 50°C，透析袋内液体体积浓縮至50%。
4、 根据权利要求2所述的绿脓杆菌疫苗的制备方法，其特征在于步骤一 中将经过牛肉膏蛋白胨培养基培养的绿脓杆菌Pi、 &和P6分别置于37 42°C 的环境中扩大培养18h，然后再用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗。
5、 根据权利要求2所述的绿脓杆菌疫苗的制备方法，其特征在于步骤五 中纤维素装柱的尺寸为2.6cmX60cm。
全文摘要
一种绿脓杆菌疫苗及其制备方法，它涉及一种疫苗及其制备方法。它解决了目前抗菌素难以治愈绿脓杆菌感染，以及单一价态的绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求的问题。疫苗由置于生理盐水中的绿脓杆菌P₁的内毒素、绿脓杆菌P₂的内毒素、绿脓杆菌P₆的内毒素和绿脓杆菌P₁₀₃的类毒素组成。制备方法制备绿脓杆菌内毒素，制备绿脓杆菌类毒素，混合，即得到绿脓杆菌疫苗。本发明绿脓杆菌疫苗属于多价态疫苗，因采用了绿脓杆菌P₁、P₂和P₆的内毒素，所以可以免疫已知的11型绿脓杆菌，而且由于加入了绿脓杆菌P₁₀₃的类毒素，增强了疫苗对绿脓杆菌的免疫效果。
文档编号A61K39/07GK101406697SQ20081013759
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月21日 优先权日2008年11月21日
发明者冲 于, 于丽萍, 刘宇峰, 夏海华, 奚新伟, 孙建华, 张云湖, 曲晓军, 沙长青, 王金英, 王雪娇 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所