专利名称：一种脾提取物、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脾提取物、其制备方法及其用途，具体地说，涉及一种由从除人以外的哺乳动物脾脏组织中经提取分离制备的脾提取物、其制备方法及用途，属于药物制剂领域。
背景技术：
众所周知，哺乳动物体内有不少人体所需的各种营养成分及活性成分，进而有不少针对从哺乳动物的心脏、肝脏及肌肉组织中提取活性多肽的报道。
而脾脏是哺乳动物的外周免疫器官，也是动物体内代谢最为旺盛的器官之一，由于其中含有丰富的细胞基本营养成分及细胞因子，特别是促进细胞代谢的活性成分如多肽类物质、游离氨基酸、核酸、各种糖类，因而受到研究者的广泛关注。国外对脾提取物的研究工作较早，目前已有用于化妆品的商品，如crydermine及增强免疫功能的保健品，如spleenP.M.G、IM-Encap、Gold-speen 500等。
申请号03133572.1，发明名称为复合生物活性胶囊及其制备方法，公开了一种复合生物活性胶囊，选用新生牛为初生十四小时之内的小牛，取其脑、胸腺、肝、脾；选用怀孕二个月左右的绵羊，取其胚胎及胎盘，采用现代生物工程技术，从其中提取脑蛋白水解物、胸腺肽、转移因子、胎盘肽、促肝细胞生成素等有效成份进行科学配伍。该发明采用多种原料分别提取的生物活性成份，可根据不同对象按不同配料比例复合成胶囊或片剂；发明所述的复合生物活性胶囊，能调解人体生理机能，提高免疫力，延缓衰老，提高记忆力，抗疲劳，美容养颜，又能治疗和预防肝、脾、肾及心脏血管疾病的发生。
《肉类工业》2002年2期的“猪脾多肽的制备工艺研究”公开了猪脾脏的制备工艺，工艺流程为脾脏--＞去脂肪--＞匀浆--＞脱脂--＞酶解--＞终止反应--＞过滤--＞吸附脱色--＞凝胶层析--＞真空干燥--＞成品。具体工艺为取一定量的新鲜猪脾脏，去掉大块的外表脂肪、表皮及皮下筋膜，加1∶1的10℃蒸溜水，用组织捣碎机匀浆，按4∶1的比例加正已烷或乙醚在常温下密闭抽提2h脱脂，分离得到脱脂的脾脏匀浆；将400ml脾匀浆液，置于恒温水浴锅中，调节温度至(50±2)℃，以Ca(OH)2乳液调节溶液至酶最适pH值，加入30g酶，反应一段时间后，以1∶1HCl调pH至中性，同时升温至80℃保持15min，使酶钝化中止反应，沙布过滤，滤液加5％的活性炭吸附脱色，抽滤，过G-15萄聚糖凝胶柱，收集范围的溶液，50℃真空浓缩干燥，得脾脏多肽成品。该工艺采用的是酶解法，通过酶解脾脏中蛋白质来获得多肽，所得多肽成分组成易变动，且并非原来天然存在的多肽。
目前，困扰人类健康的疾病多是由于机体免疫机能下降造成的，所以应不断研究和开发一些能提高人体免疫能力的药物；以提高和改善机体免疫功能，激活和增强机体非特异性免疫功能，提高人体的抗疾病能力。
发明内容本发明的目的在于提供一种脾提取物，所述脾提取物是由除人以外的哺乳动物脾脏组织中提取制备的。
本发明的另一目的在于提供上述脾提取物的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述脾提取物在制备治疗原发性和继发性细胞免疫缺陷病(如湿疹、血小板减少、多次感染综合症等)、呼吸道及肺部感染、习惯性感冒、慢性乙型肝炎、流行性腮腺炎、复发性口疮等疾病治疗药物方面的用途，以及在制备治疗放化疗引起的白细胞减少症，自血病、再生性障碍贫血、淋巴瘤及其他恶性肿瘤、改善肿瘤患者恶变质、病毒感染、改善术后或重症患者身体虚弱时辅助使用药物方面的用途。
本发明所述的脾提取物，为从除人以外的哺乳动物脾脏组织中提取而成，如下重量份比的组分多肽10～100份、游离氨基酸20～80份、核酸1～30份、总糖0～4份，所有组分分子量均小于10000道尔；该提取物与磺基水杨酸反应，混匀，不发生混浊；与双缩脲反应，显蓝紫色至紫红色；与茚三酮反应，显蓝紫色；在260～270nm波长处有吸收；苯酚—硫酸试剂反应为阳性。
本发明所述的脾提取物优选含有如下重量份比的组分多肽20～80份、游离氨基酸30～60份、核酸5～20份、总糖1～4份，所有组分分子量均小于8000道尔顿；最优选含有多肽32～48份、游离氨基酸40～60份、核酸8～12份、总糖1～3份，所有组分分子量均小于6000道尔顿。
本发明所述的脾提取物中游离氨基酸经测定有下述氨基酸门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸等。
本发明所述的哺乳动物可为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔等。
从猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔等新鲜健康脾脏组织中均可提取本发明所述的脾提取物。
从生产成本、生产工艺、产品质量稳定性、临床疗效等因素考虑，上述哺乳动物脑组织优选小牛脾脏组织作为脾提取物的生产原料。
本发明所述的脾提取物为从除人以外的哺乳动物脾脏组织通过去脂肪、匀浆、冻融破碎、沉淀、超滤等步骤制得脾提取物，其分子量可通过选用截留分子量为10000或10000以下不同截留分子量的超滤膜来控制。
本发明所述的脾提取物的制备方法，包括如下步骤A)取经过预处理的哺乳动物脾脏，加水或生理盐水匀浆，调节pH值，反复冻融后经1-3次离心，取上清液过滤得清液I；B)清液I调节pH值；或者清液I调节pH值后加热；然后进行离心，取上清液过滤，得清液II；C)清液II冷冻融化后再过滤，取清夜超滤得脾提取物。
其中，所述的预处理是将新鲜的健康脾脏的杂质、脂肪、表皮及皮下筋膜预先处理掉。
匀浆后调pH值至3.0～5.0，冻融次数为1～9次，通过反复冻融使细胞破碎，使细胞内活性多肽、游离氨基酸、核酸、总糖等充分释放。
本发明的制备方法中采用冻融方法，快速简便地从脑组织中提取多肽、氨基酸、核酸，该方法具有收率高，操作时间短，成本低的特点。
离心条件为3000～4000转/分，离心时间为15～30分钟。
离心过滤后，调pH值为6.0～7.5。
为了达到更好的离心效果，在一次离心过滤后，还可进行一次加热冷却，再离心过滤。
具体地说，本发明所述的脾提取物的制备方法，包括如下步骤A)取新鲜健康脾脏，剔除杂质及脂肪组织，加0.5～2.5倍脾脏重量的注射用水或生理盐水，匀浆，调节pH值3.0～5.0，反复冻融1～9次，最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为15～30分钟，取上清液过滤，得清液I；B)清液I调节pH值6.0～7.5后离心；或者调节pH值6.0～7.5并加热，然后冷却至常温后离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为15～30分钟，取上清液过滤，得清液II；C)清液II冷冻后融化，过滤，清液用超滤膜超滤1～2次，超滤液为脾提取物。所述的冻融为在-15℃以下冷冻，冻实后在10～40℃下融化。
上述B)步骤中，离心过滤后，加热至50℃～90℃，加热时间为15～30分钟；冷却至10～40℃。
更为优选的，本发明所述的脾提取物的制备方法，包括如下步骤
A)取新鲜健康脾脏，剔除杂质及脂肪组织，加1～2倍脾脏重量注射用水或生理盐水，匀浆，调节pH值3.8～4.2，在-15℃～-25℃冷冻，冻实后在10～40℃下融化，重复冻融2～4次；最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为3500～4000转/分，离心时间为15～20分钟，取上清液过滤，得清液I；B)清液I调节pH值6.5～7.0后离心或调节pH值6.0～7.5并加热，加热60℃～80℃，加热时间为15～20分钟，冷却至常温后离心，离心条件为3500～4000转/分，离心时间为15～20分钟，取上清液过滤，得清液II；C)清液II-15℃～25℃冷冻，冻实后在10～40℃下融化，过滤，清液用截留分子量10000以下超滤膜超滤1～2次，得超滤液，即为脾提取物。
上述步骤中的离心时的温度可以设定为常温，也可以是0～4℃下进行；所述的过滤为现有技术中通用的纸浆过滤或澄清板过滤；上述过程调pH值使用盐酸和/或氢氧化钠；对清液进行超滤时，可采用截留分子量为6000～10000道尔顿的超滤膜或6000道尔顿以下的超滤膜超滤，为脾多肽提取物中的活性多肽分子量的控制步骤。比如，使用截留分子量1000、3000、5000、6000、8000或10000道尔顿的超滤膜，优选使用截留分子量为6000道尔顿的超滤膜超滤。使用的超滤膜为市售产品，其生产商应为行业认可的生产单位，使用的滤膜型号与尺寸可根据具体的生产量、选用的超滤器尺寸来确定。
当然，为了进一步获取所需分子量段的脾提取物，可以用不同的超滤膜进行截取，取超滤液或截留液，这样即可获得分子量为1000-10000，1000-8000，1000-6000，1000-5000或3000-8000道尔顿等等所需的脾提取物。
为使本发明生产工艺、产品质量稳定，匀浆后采取调节pH值3.8～4.2后，再冻融，制备步骤B)中第一次离心后再调节pH值6.5～7.0，并加热离心再冷冻除杂。
本发明所述的脾提取物可经后处理，制成药剂学上可接受的不同剂型，比如片剂、胶囊剂、口服液、小容量注射剂、大容量注射剂或冻干粉针剂等，优选为小容量注射剂、冻干粉针剂，最优选为小容量注射剂。所述的剂型可按照制备药剂学上可接受的剂型的常规方法进行。
本发明最优选小容量注射剂的规格为，2ml；5ml；10ml，每ml含多肽为3.2～4.8mg、游离氨基酸为4.0～6.0mg、核酸为0.8～1.2mg、总糖100～300μg。。
肌内注射一次2～8ml，一日1次或遵医嘱。
静脉滴注一次10ml，溶于500ml的0.9％氯化钠注射液或5％～10％葡萄糖注射液中，一日1次或遵医嘱。
本发明的研究人员经过大量的实验及药效学研究发现，本发明所述的脾提取物药物为免疫调节药和肿瘤辅助治疗药。本品对机体免疫机能有双向调节作用，能够纠正机体免疫功能紊乱，具有激活和增强机体非特异性免疫功能的作用，能够促进T淋巴细胞成熟并可使未致敏淋巴细胞激活成为致敏淋巴细胞，从而提高了淋巴细胞免疫功能，触发和增强机体对感染的抵抗力；还可诱生干扰素，直接阻止病毒蛋白质的合成与复制，并能增强细胞表面抗原表达，促进NK细胞的细胞毒活性，调节淋巴细胞和巨噬细胞功能，可明显改善机体细胞免疫功能；本品能刺激骨髓细胞增殖，产生大量白细胞，使造血功能得到提高；本品能提高机体对病毒和肿瘤的免疫能力，能够抑制癌细胞的增殖，具有一定抗肿瘤作用；本品能促进受损肝细胞的修复和白细胞的生成。
本发明所述的脾提取物的制备工艺稳定成熟，通过冻融、离心、超滤等手段来提取脾脏中天然存在且具有特定比例组成的活性多肽、游离氨基酸、核酸、多种糖等活性成分，分子量可在10000道尔顿以下进行控制，与目前主要的免疫调节药物比较，本发明具有疗效确切、可预见毒副作用小或无、成本低廉的优点。本发明所述脾提取物可用于原发性和继发性细胞免疫缺陷病(如湿疹、血小板减少、多次感染综合症等)、呼吸道及肺部感染、习惯性感冒、慢性乙型肝炎、流行性腮腺炎、复发性口疮等疾病治疗药物方面的用途，以及在作为治疗放化疗引起的白细胞减少症，白血病、再生性障碍贫血、淋巴瘤及其他恶性肿瘤、改善肿瘤患者恶变质、病毒感染、改善术后或重症患者身体虚弱时辅助使用药物方面的用途。
具体实施方式下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1本实施例提供每ml含多肽为8.0mg、游离氨基酸为10.2mg、核酸为2.2mg、总糖260μg的分子量小于6000道尔顿的脾提取物。其制备步骤如下A)取新鲜健康小牛脾脏10kg，除去筋膜及脂肪组织等杂质，用注射用水洗涤，加10L注射用水，匀浆，调节pH值3.8，-20℃冷冻，冻实后取出在15℃水浴中融化，重复冻融2次，最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为4000转/分，离心时间为15分钟，取上清液过滤得到清液I。
B)将清液I调pH值6.5后，加热80℃，加热时间为15分钟，冷却至35℃后离心，离心条件为4000转/分，离心时间为20分钟，取上清液过滤，得清液II；
C)将清液II在-20℃冷冻，冻实后取出在12℃水浴中融化，过滤得的清液用截留分子量为6000的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，超滤液即为脾提取物，分子量小于6000道尔顿，经测定每ml含多肽为8.0mg、游离氨基酸为10.2mg、核酸为2.2mg、含总糖260μg。
同时提供含上述脾提取物的小容量注射液取上述脾提取物1000ml，加注射用水至2L，无菌过滤后灌装，制成2ml/支的小容量注射剂，100℃灭菌15分钟，包装入库，每ml含多肽为4.0mg、游离氨基酸为5.1mg、核酸为1.1mg、总糖130μg。
实施例2本实施例提供每ml含多肽为5.0mg、游离氨基酸为7.0mg、核酸为1.6mg、总糖180μg的分子量小于8000道尔顿的脾提取物。其制备步骤如下A)取新鲜健康猪脾脏10kg，除去筋膜及脂肪组织等杂质，用注射用水洗涤，加20L注射用水，匀浆，调节pH值4.2，-18℃冷冻，冻实后取出在10℃水浴中融化，重复冻融一次，最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为3000转/分，离心时间为30分钟，取上清液过滤得到清液I；B)将清液I滤液调pH值7.0后，离心，离心条件为4000转/分，离心时间为30分钟，取上清液过滤，得清液II；C)清液II在-18℃冷冻，冻实后取出在25℃水浴中融化，过滤，上清液先用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，取超滤液，再用截留分子量为8000道尔顿的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，取超滤液，超滤液即为脾提取物，分子量小于8000道尔顿，经测定每ml含多肽为5.0mg、游离氨基酸为7.0mg、核酸为1.6mg、总糖200μg。
同时提供含上述脾提取物的小容量注射液取上述脾提取物1000ml，加注射用水至2L，无菌过滤后灌装，制成5ml/支的小容量注射剂，100℃灭菌15分钟，包装入库，每ml含多肽为2.5mg、游离氨基酸为3.5mg、核酸为0.8mg、总糖100μg。
实施例3本实施例提供每ml含多肽为7.0mg、游离氨基酸为8.0mg、核酸为3.0mg、总糖360μg的分子量小于5000道尔顿的脾提取物。其制备步骤如下A)取新鲜健康羊脾脏10kg，除去筋膜及脂肪组织等杂质，用注射用水洗涤，加15L注射用水，匀浆，调节pH值3.0，-15℃冷冻，冻实后取出在28℃水浴中融化，重复冻融4次，最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为3500转/分，离心时间为25分钟，取上清液过滤得到清液I；B)将清液I滤液调pH值6.0后，加热75℃，加热时间为15分钟，冷却至25℃后离心，离心条件为3500转/分，离心时间为30分钟，取上清液过滤，得清液II；C)清液II在-15℃冷冻，冻实后取出在15℃水浴中融化，过滤，上清液先用截留分子量为8000道尔顿的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，取超滤液，再用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，取超滤液，超滤液即为脾提取物，分子量小于5000道尔顿，经测定每ml含多肽为7.0mg、游离氨基酸为8.0mg、核酸为3.0mg、总糖360μg。
同时提供含上述脾提取物的小容量注射液取上述脾提取物1000ml，加注射用水至2L，无菌过滤后灌装，制成10ml/支的小容量注射剂，100℃灭菌15分钟，包装入库，每ml含多肽为3.5mg、游离氨基酸为4.0mg、核酸为1.5mg、总糖180μg。
实施例4本实施例提供每ml含多肽为5.0mg、游离氨基酸为5.3mg、核酸为1.5mg、总糖160μg的分子量小于1000-10000道尔顿的脾提取物。其制备步骤如下A)取新鲜健康猪脾脏10kg，除去筋膜及脂肪组织等杂质，用生理盐水洗涤，加25L生理盐水，匀浆，调节pH值5.0，-25℃冷冻，冻实后取出在40℃水浴中融化，重复冻融一次，最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为3000转/分，离心时间为30分钟，取上清液过滤得到清液I；B)将清液I滤液调pH值7.5后，加热65℃，加热时间为20分钟，冷却至20℃后离心，离心条件为4000转/分，离心时间为30分钟，取上清液过滤，得清液II；C)清液II在-18℃冷冻，冻实后取出在35℃水浴中融化，过滤，上清液先用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，取超滤液，再用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，取截留液，截留液即为脾提取物，分子量为1000-10000道尔顿，经测定每ml含多肽为5.0mg、游离氨基酸为5.3mg、核酸为1.5mg、总糖160μg。
同时提供含上述脾提取物的小容量注射液取上述脾提取物1000ml，加注射用水至2L，无菌过滤后灌装，制成5ml/支的小容量注射剂，100℃灭菌15分钟，包装入库，每ml含有多肽2.5mg，每ml含游离氨基酸为2.65mg，每ml含核酸为0.75mg，每ml含总糖80μg。
实施例5本实施例提供每ml含多肽为8.0mg、游离氨基酸为10.0mg、核酸为2.0mg、总糖300μg的分子量小于6000道尔顿的脾提取物。其制备步骤如下A)取新鲜健康小牛脾脏10kg，除去筋膜及脂肪组织等杂质，用注射用水洗涤，加10L注射用水，匀浆，调节pH值4.0，-20℃冷冻，冻实后取出在20℃水浴中融化，重复冻融2次，最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为4000转/分，离心温度设定为4℃，离心时间为15分钟，取上清液过滤得到清液I。
B)将清液I调pH值6.5后，加热80℃，加热时间为20分钟，冷却至25℃后离心，离心条件为4000转/分，离心温度设定为4℃，离心时间为20分钟，取上清液过滤，得清液II；C)将清液II在-20℃冷冻，冻实后取出在15℃水浴中融化，过滤，清液用截留分子量为6000道尔顿的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤一次，超滤液即为脾提取物，分子量小于6000，经测定每ml含多肽为8.0mg、游离氨基酸为10.0mg、核酸为2.0mg、含总糖300μg。
同时提供含上述脾提取物的小容量注射液取上述脾提取物1000ml，加注射用水至2L，无菌过滤后灌装，制成2ml/支的小容量注射剂，100℃灭菌15分钟，包装入库，每ml含多肽为4.0mg、游离氨基酸为5.0mg、核酸为1.0mg、总糖150μg。
实施例6参照实施例1～3，脾提取物制备后，按公知的方法，先将提取物适当浓缩后，加适量干燥淀粉混匀后制成软材，过16目筛制成颗粒，干燥后加润滑剂混匀，用10mm冲模压制成片，即得药物片剂。
实施例7参照实施例4～5，脾提取物制备后，加入适宜的赋型剂(如右旋糖酐40、甘露醇等)，进行除菌灌装，按公知的方法，冷冻干燥制成冻干粉针产品。
实施例8参照实施例1～3，将脾提取物投入到稀配罐中；在浓配罐中投入0.9％最终配制总体积的氯化钠，加入0.4‰活性炭煮沸脱炭过滤，冷却后，将药液过滤至稀配罐中，在稀配罐中补加注射用水至配液量，调PH为6.8～7.0，过滤。灌封于输液瓶中，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，即得输液产品。
实施例9参照实施例4～5，脾提取物制备后，按公知的方法，先将提取物适当浓缩后，加适量干燥淀粉混匀后制成软材，过16目筛制成颗粒，浓缩干燥后，整粒，装袋，得颗粒剂。
实施例10参照实施例1～3，脾提取物制备后，按公知的方法，将脾提取物加适量注射用水，过滤，再加入单糖浆、苯甲酸钠，再加水至1000毫升，冷藏，过滤。灌封于10ml口服液瓶中，以100℃流通蒸汽灭菌30分钟，即得口服液。
实施例11参照实施例4～5，脾提取物制备后，按公知的方法，先将提取物适当浓缩后，加适量干燥淀粉混匀后制成软材，过16目筛制成颗粒，于60℃烘干干燥后整粒，装胶囊，得胶囊剂。
实验例1本实验例为本发明实施例1所述的每ml含多肽为8.0mg、游离氨基酸为10.2mg、核酸为2.2mg、总糖260μg的分子量小于6000道尔顿的脾提取物的蛋白质、高分子量物质及其它项目的检测。
性 状 本品为淡黄色澄明液体。
pH 值 6.5。
蛋白质 取本品2ml，加20％磺基水杨酸溶液2ml，混匀，不发生混浊。
取本品1ml，加茚三酮试液数滴，加热，显蓝紫色。
取本品2ml，加双缩脲溶液(取硫酸铜1.50g和酒石酸钾钠6.0g，加水500ml使溶解，边搅边加入10％氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀)4ml，混匀，室温放置15分钟，溶液显蓝紫色至紫红色。
取本品，加水制成每ml中含多肽50μg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年附录IV A)测定，在265±2nm的波长处有最大吸收。
高分子量物质照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用凝胶色谱柱(如TSK GEL 2000SW 7.8mm×300mm，5μm)；流动相为三氟醋酸-乙腈-水(0.05∶10∶90)检测波长为214nm。理论板数按胰岛素峰计算应不得低于3000。
对照品溶液的制备 取胰岛素(分子量5800)适量，用流动相制成每1ml中含1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 取本品，加流动相稀释成每1ml中含多肽1mg的溶液，作为供试品溶液。
测定法 取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算，小于胰岛素峰保留时间的峰面积之和不得过4.0％。
实验例2本实验例为本发明实施例1所述的规格2ml注射剂(分子量小于6000道尔顿，每ml含多肽为4.0mg、游离氨基酸为5.1mg、核酸为1.1mg、总糖130μg)的外观性状、pH值、蛋白质、高分子量物质及其它规定的注射剂检查项目的检测及定性分析。
性 状本品为淡黄色澄明液体。
pH 值应为5.5～7.5(中国药典2000年版二部附录VI H)。
蛋白质取本品2ml，加20％磺基水杨酸溶液2ml，混匀，不发生混浊。
取本品1ml，加茚三酮试液数滴，加热，显蓝紫色。
取本品2ml，加双缩脲溶液(取硫酸铜1.50g和酒石酸钾钠6.0g，加水500ml使溶解，边搅边加入10％氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀)4ml，混匀，室温放置15分钟，溶液显蓝紫色至紫红色。
取本品，加水制成每ml中含多肽50μg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年附录IV A)测定，在265±2nm的波长处有最大吸收。
高分子量物质照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用凝胶色谱柱(如TSK GEL 2000SW 7.8mm×300mm，5μm)；流动相为三氟醋酸-乙腈-水(0.05∶10∶90)检测波长为214nm。理论板数按胰岛素峰计算应不得低于3000。
对照品溶液的制备 取胰岛素(分子量5800)适量，用流动相制成每1ml中含1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 取本品，加流动相稀释成每1ml中含多肽1mg的溶液，作为供试品溶液。
测定法 取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算，小于胰岛素峰保留时间的峰面积之和不得过4.0％。
其他 应符合注射剂项下有关各项规定(中国药典2000版二部附录I B)。
实验例3本实验例为本发明实施例3提供的每ml含多肽为7.0mg、游离氨基酸为8.0mg、核酸为3.0mg、总糖360μg的分子量小于5000道尔顿的脾提取物中多肽定量测定测定。多肽含量测定取本品适量，加水制成每1ml中约含0.15mg的多肽的溶液，作为供试品溶液，精密量取1.0ml，照福林酚测定法测定。
试剂碱性铜溶液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使其溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使其溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，合并甲、乙两液，并加水至500ml。
操作法 对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备。
标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液(取福林试液中的贮备液1→16)4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴10分钟，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VI B)在650nm的波长处测定吸收度；以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与相应吸收度计算回归方程。
测定法 精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，“自加入碱性铜试液”起，依法测定，从回归方程计算多肽的含量，并乘以稀释倍数，即得。
实验例4本实验例为实施例4提供的每ml含多肽为5.0mg、游离氨基酸为5.3mg、核酸为1.5mg、总糖160μg的分子量小于5000道尔顿的脾提取物小容量注射液所含游离氨基酸定量测定。游离氨基酸测定取本品及标准氨基酸适量，用氨基酸分析仪或HPLC进行氨基酸分析，其游离氨基酸含量应为每1ml中含4.0～6.0mg。
每1ml含游离氨基酸为5.3mg/ml，其中门冬氨酸0.28mg/ml谷氨酸0.63mg/ml 丝氨酸0.19mg/ml组氨酸0.24mg/ml 甘酸0.29mg/ml苏氨酸0.25mg/ml丙氨酸0.34mg/ml 精氨酸0.32mg/ml 缬氨酸0.29mg/ml蛋氨酸0.16mg/ml 异亮氨酸0.23mg/ml苯丙氨酸0.34mg/ml亮氨酸0.85mg/ml 赖氨酸0.52mg/ml 脯氨酸0.18mg/ml色氨酸0.09mg/ml 酪氨酸0.10mg/ml
实验例5本实验例为本发明实施例5所述每ml含多肽为8.0mg、游离氨基酸为10.0mg、核酸为2.0mg、总糖300μg的分子量小于6000道尔顿的脾提取物所含核酸定量测定。核酸测定取本品1.0ml，加水稀释至50ml，作为供试品溶液。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)丁260nm波长下测定吸收值，按E1cm1％200计算核酸含量。
实施例5所述脾提取物含核酸为2.0mg。
实验例6本实验例为本发明实施例5所述每ml含多肽为8.0mg、游离氨基酸为10.0mg、核酸为2.0mg、总糖300μg的分子量小于6000道尔顿的脾提取物所含总糖定量测定。
总糖测定对照品溶液的制备称取干燥至恒重的葡萄糖约50mg，置50ml量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，混匀。取此溶液5.0ml，加水定容至50ml，混匀，即得。
供试品溶液的制备取本品10ml，加水定容至50ml，作为供试品溶液。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别置具塞试管中，各加入水至1.0ml，各加入5％苯酚溶液1.0ml，摇匀，加5ml硫酸，置37℃水浴中准确加热10分钟，迅速冷却至室温，以0号管为空白，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在487nm的波长处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归，其相关系数应大于0.99。
测定法精密量取供试品溶液1ml，照标准曲线的制备方法，自“各加入5％苯酚溶液1.0ml”起，依法测定。从回归方程中求出总糖含量。
实施例5所述脾提取物所含总糖为300μg。
实验例7本实验例为本发明实施例5所述脾提取物小容量注射液(每ml含多肽为4.0mg、游离氨基酸为5.0mg、核酸为1.0mg、总糖150μg)的毒性实验√异常素性 取本品，依法检查(中国药典2000年版二部附录XI C)，按静脉注射法给药，应符合规定。
√过敏试验 取本品，依法检查(附)，应符合规定。供试动物健康豚鼠，雌雄均可，体重250～350g，试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养，做过本试验的动物不得重复使用。
检查法 取上述豚鼠6只，间日腹腔注射本品0.5ml，3次，然后分成两组，每组3只，分别在第一次注射后第14日及第21日静脉注射1.0ml，
结果判断 静脉注射后15分钟内均不得出现过敏性反应，如竖毛，呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种以上者或罗音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者应判为阳性。
√细菌内毒素 取本品，依法检查(中国药典2000年版二部附录XI E)每1ml中含细菌内菌素的应小于2EU。
结论本发明药物组合物注射液符合注射液要求，无任何毒性作用，应用人体安全。
实验例8本实验例为本发明实施例5所述脾提取物小容量注射液(每ml含多肽为4.0mg、游离氨基酸为5.0mg、核酸为1.0mg、总糖150μg)在治疗反复呼吸道感染临床效果，说明本发明注射液的良好疗效。
临床背景反复呼吸道感染患者50例，其中男性为28例，女性为22例。年龄8-15岁，平均11.3岁。所有病例均为反复呼吸道感染患者(有咳嗽、发热、扁桃体肿大和肺内罗音等症状)，患者免疫指标的测定符合下列标准①IgA≤2s；②CD3和CD4均≤2s；③CD3≤2s及CD3/CD8＜1.5，至少符合上述3条中的1条。
治疗方法患者均肌内注射一次4ml本发明实施例5所述小容量注射剂，前两周每周3次，以后每周2次.3个月为一疗程。
疗效判定免疫指标的测定用药前及疗程结束后各检验免疫指标1次，治疗前后进行临床观察和记录，每月随访1次。(1)显效3个月未发病或仅发病1次，免疫指标基本恢复正常。(2)有效发病次数减少或未减少，但病情较前轻，病程缩短，免疫指标转为正常或同前。(3)无效发病次数，病程均末改变，免疫指标无变化或更低。
治疗结果3个月治疗后1、患者疗效显效31例，占62％，有效14例，占28％，无效5例，占10％，总有效率为90％。2、治疗前后免疫指标变化情况IgA(g/L)、CD3(％)、CD4(％)均显著改善，均P＜0.01；IgG(g/L)、IgM(g/L)、CD8(％)、BC均有所改善但不明显，均P＞0.05。3、治疗前后症状体征变化治疗后咳嗽、发热、扁桃体肿大和肺内罗音均明显减轻，经统计学处理.治疗前后差异有非常显著意义(P均＜0.01)。
结论本发明所述小容量注射剂对机体免疫机能有双向调节作用，能够纠正机体免疫功能紊乱，具有激活和增强机体非特异性免疫功能的作用，能够促进T淋巴细胞成熟并可使未致敏淋巴细胞激活成为致敏淋巴细胞，从而提高了淋巴细胞免疫功能，触发和增强机体对感染的抵抗力。反复呼吸道感染患者IgG、IgA、CD3、CD4/CD8明显降低，表明其细胞免疫低下，免疫功能紊乱，这是反复呼吸道感染产生的重要原因。使用本发明所述小容量注射剂治疗后7项免疫指标均提高。随着免疫指标的提高，发病次数减少，且缩短了病程，临床症状和体征均有减轻。说明本发明小容量注射剂对患者机体免疫功能有恢复和增强作用。
实验例9本实验例为本发明实施例5所述脾提取物小容量注射液(每m1含多肽为4.0mg、游离氨基酸为5.0mg、核酸为1.0mg、总糖150μg)在治疗慢性乙型肝炎临床疗效，说明本发明注射液具有良好疗效。
1、临床背景慢性乙型肝炎患者60例，分为治疗组和对照组，各男15例、女15例，年龄均为25-40岁，两组病程均为1-2年，平均1.5年，所有患者均符合病毒性肝炎标准。
2、治疗方法治疗组应用本发明注射液和常规保肝药物治疗，一次肌肉注射本发明注射液5ml，每周三次，一个月为一疗程，对照组只应用常规保肝药物治疗。用药前后检查肝功能及乙肝病毒五项指标。
3、疗效判定治愈HBsAg.HBeAg转阴，肝功能恢复正常；基本治愈HBeAg转阳，肝功能恢复正常；好转；以上三项有一项转为正常；无效治疗前后各项指标无变化。
4、治疗效果治疗组治愈15例，好转10例，总有效率为83.3％；对照组治愈8例，基本治愈1例，好转3例，总有效率4％。
实验例10白细胞减少症是肿瘤患者放射治疗、化学药物治疗中最常见的不良反应之一。本例说明了本发明研究人员在3年时间内，应用实施例1产品，治疗放、化疗白细胞减少症124例，疗效理想，其他实施例产品在应用中，也具有相应的效果。具体内容如下对象癌患者124例，其中鼻咽癌15例，肺癌18例，食管癌24例，乳房癌32例，胃癌24例，大肠癌8例，口腔癌3例。
男66例，女58例。
年龄30-40岁为24例，41-50岁为46例，51-60岁为35例，61岁以上为19例。
放疗68例，化疗56例。
白细胞数低于1.0*109/L为2例，(1.1-2.0)*109/L为25例，(2.1-3.0)*109/L为48例，(3.1-4.0)*109/L为49例。
治疗方法静脉滴注，10mL/次，溶于500mL 0.9％氯化钠注射液中，1次/日。两周为一个疗程。
疗效标准经1个疗程，白细胞数达到4.0*109/L以上者为显效；比治疗前升高50％以上而未达正常值为有效；未升高10％为无效。
治疗结果显效72例(占58％)；有效39例(占31％)；无效13例(占11％)。总有效率在89％以上。
权利要求
1.一种脾提取物，其特征在于，所述的脾提取物为从除人以外的哺乳动物脾脏组织中提取而成，含有如下重量份比的组分多肽10～100份、游离氨基酸20～80份、核酸1～30份、总糖0～4份，所有组分分子量均小于10000道尔顿。
2.根据权利要求1所述的脾提取物，其特征在于，所述的脾提取物含有如下重量份比的组分多肽20～80份、游离氨基酸30～60份、核酸5～20份、总糖1～4份，所有组分分子量均小于8000道尔顿；所述的脾提取物优选含有如下组分多肽32～48份、游离氨基酸40～60份、核酸8～12份、总糖1～3份，所有组分分子量均小于6000道尔顿。
3.根据权利要求1或2所述的脾提取物，其特征在于，所述的脾提取物为从除人以外的哺乳动物脾脏组织通过去脂肪、匀浆、冻融破碎、沉淀、超滤等步骤提取而成。
4.根据权利要求1或2所述的脾提取物，其特征在于，所述的哺乳动物为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔中任意一种。
5.权利要求1～4所述的脾提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤A)取经过预处理的哺乳动物脾脏，加水或生理盐水匀浆，调节pH值，反复冻融后经1-3次离心，取上清液过滤得清液I；B)清液I调节pH值离心，取上清液过滤得清液II；或者清液I调节pH值后加热，离心，取上清液过滤得清液II；C)清液II冷冻融化后再过滤，取清液超滤得脾提取物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法中A步骤的匀浆后调pH值至3.0～5.0，冻融次数为1～9次，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为15～30分钟；B步骤的调pH值为6.0～7.5，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为15～30分钟；C步骤中用截留分子量10000以下的超滤膜超滤。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤A)取新鲜健康脾脏，剔除杂质及脂肪组织，加0.5～2.5倍脾脏重量的注射用水或生理盐水，匀浆，调节pH值3.0～5.0，反复冻融1～9次；最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为3000～4000转/分，离心时间为15～30分钟，取上清液过滤，得清液I；B)清液I调节pH值6.0～7.5后离心；或者清液I调节pH值6.0～7.5并加热，然后冷却至常温后进行离心；离心条件为3000～4000转/分，离心时间为15～30分钟，离心后取上清液过滤，得上清液II；C)清液II冷冻后融化，过滤，清液用截留分子量10000道尔顿以下的超滤膜超滤1～2次，超滤液为脾提取物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤A)取新鲜健康脾脏，剔除杂质及脂肪组织，加1～2倍脾脏重量注射用水或生理盐水，匀浆，调节pH值3.8～4.2，-15℃～-25℃冷冻，在10～40℃下融化，重复冻融2～5次；最后一次融化后的匀浆液离心，离心条件为3500～4000转/分，离心时间为15～20分钟，取上清液过滤，得清液I；B)清液I调节pH值6.5～7.0后离心或调节pH值6.0～7.5，加热60℃～80℃，加热时间为15～20分钟，冷却至常温后离心；离心条件为3500～4000转/分，离心时间为15～20分钟，取上清液过滤，得清液II；C)清液II在-15℃～-25℃冷冻，冻实后在10～40℃下融化，过滤，清液用截留分子量8000道尔顿以下的超滤膜超滤1～2次，得超滤液，即为脾提取物。
9.根据权利要求7～8所述的制备方法，其特征在于，所述的脾提取物经后处理制成药剂学上可接受的不同剂型，如口服液、小容量注射剂、大容量注射剂、片剂、胶囊剂或冻干粉针剂。
10.权利要求1～4所述的脾提取物在制备治疗原发性和继发性细胞免疫缺陷病，如湿疹、血小板减少、多次感染综合症、呼吸道及肺部感染、习惯性感冒、慢性乙型肝炎、流行性腮腺炎、复发性口疮疾病药物；在制备治疗放化疗引起的白细胞减少症、白血病、再生性障碍贫血、淋巴瘤及其他恶性肿瘤、改善肿瘤患者恶变质、病毒感染、改善术后或重症患者身体虚弱时药物方面的用途。
全文摘要
本发明公开了一种从除人以外的哺乳动物脾脏组织中提取制备的脾提取物，将哺乳动物脾脏组织经去脂肪、匀浆、冻融破碎、沉淀、超滤等步骤制得脾提取物，含有如下组分多肽、游离氨基酸、核酸、总糖，所有组分分子量均小于10000道尔顿；所述脾提取物在制备治疗原发性和继发性细胞免疫缺陷病(如湿疹、血小板减少、多次感染综合症等)、呼吸道及肺部感染、习惯性感冒、慢性乙型肝炎、流行性腮腺炎、复发性口疮等疾病，在制备治疗放化疗引起的白细胞减少症，白血病、再生性障碍贫血、淋巴瘤及其他恶性肿瘤、改善肿瘤患者恶变质、病毒感染、改善术后或重症患者身体虚弱时辅助用药等药物中的应用。
文档编号A61P37/02GK1765371SQ20051010277
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月15日 优先权日2005年2月2日
发明者郭智华 申请人:郭智华