专利名称：一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及牛冷冻精液精子质量评定技术，尤其涉及ー种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法。
背景技术：
家畜精液的冷冻保存是20世纪以来随着人工授精技术的广泛应用而产生，通过超低温降低或抑制精子新陈代谢的速度，使精子生命在相对静止的状态下保存起来，以延长体外存活的时间。精液冷冻保存技术的应用不仅解决了精液长期保存的问题、便于开展国内外合作与交流，降低人工授精的成本，而且有利于高效利用优秀种公畜的遗传资源，加快遗传进展，加速品种改良，提高家畜的繁殖效率。人工授精技术作为养牛业应用最为广泛的技术之一，虽然目前已经取得了良好效果，但一般的研究仅仅涉及不同稀释液对精液冷冻质量的影响，探求适宜的冷冻稀释液配方。关于稀释液中不同成分提高精子活力的机理，影响精子冻后活力的相关基因、蛋白及其相互作用和表达的信号途径等相对研究较少，由于对其作用机理不甚清楚，从而影响精液品质的进ー步提高。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于建立一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法。该提取方法探索最优精液细管数与裂解液搭配比例，从而提高精子蛋白的浓度。实现上述发明目 的的技术方案是，一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法，包括下列步骤:
1)将冷冻精液解冻后转移到离心管中，在4で、1000Xg条件下离心5 min，弃上清液；
2)加入Iml预冷到4°C的PBS洗涤，在4で、1000 X g条件下离心5 min，重复3次；
3)向上述沉淀中加200W蛋白裂解液(solarbio，RIPA组织/细胞裂解液)，用涡旋仪(2800 r/min)涡旋混匀，使样品充分溶解；
4)静置5min后，在4で、12000 Xg条件下离心30 min，上清即为精子蛋白溶液。本发明从牛冷冻精子中提取蛋白的提取主要由三个步骤组成，分别是精子的洗涤、精子蛋白的提取和SDS-PAGE精子蛋白的分离，并以HSP90蛋白表达量与牛精子抗冻性关系为例说明精子蛋白浓度达到后续试验要求的水平。假阴道法采集9头牛的精液，測定新鮮精液指标(活力、形态、活率和密度)。精液样品经过冷冻-解冻后检测其品质，并按照冻后精子活力和质膜完整性进行分组，提取精子蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，经Western blot分析，以验证HSP90含量与精子抗冻性的关系。SDS-PAGE电泳显示，不同质量精子蛋白样品中，90 kDa蛋白表达量差异显著(P < 0.05)。Western blot分析验证该蛋白为HSP90，HSP90蛋白的表达量与冷冻-解冻后的牛精子品质具有明显的相关性。此结果表明:通过HSP90的Western blot可以预测不同精子的抗冻性,冷冻-解冻后,精子中HSP90表达量越高精子冻后活力越高，而HSP90表达量越低，其精子冻后活力越低。本发明为将来从分子手段研究精子冷冻保护机理奠定了基础，可以进ー步提升精子冷冻后的活力。
图1为精子蛋白SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色图谱。图2为HSP90蛋白的表达图谱。下面结合发明人给的具体试验数据和使用方法，进步ー步说明本发明的显著效果。实施例1
1)将冷冻精液解冻后转移到离心管中，在4で、1000Xg条件下离心5 min，弃上清液；
2)加入Iml预冷到4 0C的PBS洗涤，在4 V、1000 X g条件下离心5 min,重复3次； 3)向上述沉淀中加200W蛋白裂解液(solarbio，RIPA组织/细胞裂解液)，用涡旋仪(2800 r/min)涡旋混匀，使样品充分溶解；
4)静置5min后，在4で、12000 Xg条件下离心30 min，上清即为精子蛋白溶液。试验例I以HSP90蛋白表达量与牛精子抗冻性关系进行说明
1.SDS-PAGE精子蛋白的分离
蛋白与SDS-PAGE上样缓冲液混匀后，在95で煮5 min，取20 W蛋白样品进行电泳。电泳结束后利用考马斯亮蓝染色，最后用BIO-RAD凝胶成像分析仪对凝胶进行拍照，并用Image Lab软件对蛋白图谱进行分析。本发明探索了不同冷冻精液细管数与蛋白裂解液之间的搭配比例，实验结果表明本搭配可以较为彻底地裂解精子细胞，并使精子蛋白浓度达到较高的水平，可以进行后续的试验和分析。图1.精子蛋白SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色图谱:a 2只细管裂解于200 W裂解液中，b 3只细管裂解于200 W裂解液中，c 4只细管裂解于200 W裂解液中，d 4只细管裂解于150 W裂解液中。可以看出，4只细管裂解于200 W裂解液时，蛋白浓度最高。2.精液的采集与冷冻
用假阴道法采集种公牛精液，測定射精量后立即保存在37で水浴锅中。同时在光学显微镜下进行精液常规品质检查，光密度法測定精子密度。将新鲜精液经过品质评定后，对于合格精液用商用冷冻稀释液进行稀释，井分装到聚氯こ烯(PVC)管(0.25 ml)中。冷冻时，首先使用程序冷冻仪，经过1.5 h，将细管精液从37で冷却到4で，接着在4で条件下平衡2.5 h，然后将细管冷冻架置于装有液氮的冷冻箱内，并将细管置于距液氮面2 3 cm处，熏蒸8 10 min，最后浸入液氮中保存。3.精液解冻
将冷冻细管从液氮罐中迅速取出后，立即投入37で水浴锅中解冻40 S。所有用于精液品质鉴定或蛋白表达检测的精子均在同一时间进行解冻，以保持样本处理的一致性。4.精液品质检测
I)精子活率评定对于每ー个样品，毎次解冻3支细管冻精，以检测精液品质。采用主观目测法评定精子活率。细管精液溶解后立即取10沿精液滴到干净载玻片上，盖上盖玻片后在400 X光学显微镜下评定直线运动精子的百分率。毎次至少检查300个精子，重复3次。2)精子质膜完整性測定将50 W精液稀释于I ml果糖柠檬酸钠低渗液中，在37で条件下孵育60 min。取15 W混合均匀的精液悬滴于载玻片上，在400X光学显微镜上观察，统计尾巴弯曲的精子的百分率。每次至少检查300个精子，重复3次。3)精子顶体完整性检测细管精液解冻后，转移至离心管中，800Xg离心3 min，弃掉上清液。用37で缓冲液调整密度，然后吸取30沿精子悬液涂片，干燥后，用甲醇固定，接着加入30 W FITC-PNA染液，37°C避光潮湿环境下，用缓冲液冲洗，干燥后封片，400 X荧光显微镜下观察，并至少计数300个精子中顶体完整的精子数量，统计顶体完整精子的百分率。每个样品重复3次。5.试验设计
将9头牛的精液按照完全相同的方式进行冷冻处理，解冻后检测精子活率、质膜完整性和顶体完整性，根据精子活率和质膜完整性统计分析结果，将其分为两组:HFR (Highfreezing resistance teams,冷冻-解冻后精子活率高于 40%)和 LFR (Low freezingresistance teams,冷冻-解冻后精子活率低于40%),并且两组之间统计分析结果达到差异显著的水平(P<0.05)。另外，在分组时舍掉活力居中的ー种精液，每组各包含4个不同牛个体的精液样品，以保持两组精液样品量的一致性。根据分组结果，从剩余的8种精液样品中提取精子蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析。整个试验重复3次。6.Western blot 分析
SDS-PAGE结束后，采用半干 法(18 v,45 min)将蛋白转移至NC膜，并将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭30 min，与HSP90或P-action—抗4で孵育过夜，然后用辣根过氧化物标记的ニ抗继续孵育I h。最后与ECL试剂反应5 min。7.评定结果
I) Western blot 结果，见图 2。2)冷冻-解冻牛精子活率、质膜完整性和顶体完整率
冷冻-解冻牛精子活率、质膜完整性和顶体完整率见表I。从表I可以看出，不同牛个体间冻后精液品质相差较大，其中精液样品1、2、3、6组冻后精子活率偏低，低于40%，而精液样品5、7、8、9组冻后精子活率较高，最高达到52.7%，精液样品4的精子活率居两者之间，为41.5%。据此，将9种精液样品根据冻后平均精子活率和质膜完整性分为两组，精液样品
5、7、8和9分为HFR (High freezing resistance teams)组,其平均冻后精子活率和质膜完整性大于40% ;精液样品1、2、3和6分为LFR (Low freezing resistance teams)组,平均冻后精子活率和质膜完整性均小于40%。为了平衡两组精液样品数量，保持后续测定精子蛋白时两组精液样品量的一致性，将精液样品4略棹。统计分析表明，HFR组精子各项指标显著高于LFR组精子(P < 0.05)，达到后续试验分析的要求，见表2。表I冷冻-解冻后牛精子活率、质膜完整性和顶体完整率
幕W品I精子活率(%) I质膜完整性(%) I顶体完整性
135.1±0.2° 37.3±0.9° 33.7±4.1°
2[39- 8±0.1b [41.3 + 2.1ab [40.3 + 2.1bc
权利要求
1.ー种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤:1)将冷冻精液解冻后转移到离心管中，在4で、1000Xg条件下离心5 min，弃上清液；2)加入Iml预冷到4 0C的PBS洗涤，在4 V、1000 X g条件下离心5 min,重复3次； 3)向上述沉淀中加200 W蛋白裂解液，涡旋混匀，使样品充分溶解；4)静置5 min后，在4で、12000 Xg条件下离心30 min，上清即为精子蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的从牛冷冻精子中提取蛋白的方法，其特征在于，所述的蛋白裂解液是solarbio RIPA组织/细胞裂解液。
3.根据权利要求1所述的从 牛冷冻精子中提取蛋白的方法，其特征在于，所述的涡旋的转速是2800 r/min。
全文摘要
本发明公开了一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法，包括以下步骤将冷冻精液解冻后转移到离心管中，在4℃、1000×g条件下离心5min，弃上清液；2)加入1ml预冷到4℃的PBS洗涤，在4℃、1000×g条件下离心5min，重复3次；3)向上述沉淀中加200μl蛋白裂解液，涡旋，使样品充分溶解；4)静置5min后，在4℃、12000×g条件下离心30min，上清即为精子蛋白溶液。本发明从牛冷冻精子中提取蛋白的方法操作简单，为将来从分子手段研究精子冷冻保护机理奠定了基础，可以进一步提升精子冷冻后的活力。
文档编号C07K1/14GK103113454SQ20131002902
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月25日 优先权日2012年4月12日
发明者胡建宏, 王红, 李青旺, 王鹏, 洪洁赟, 王艳风, 侯放亮, 马国际, 贾永宏 申请人:西北农林科技大学