专利名称：一种红凤菜蛋白提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及一种红凤菜蛋白提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
红凤菜bicolor DC.)为菊科三七草属多年生草本植物,主要分布于我国南方各地。红凤菜别名血皮菜、观音菜、观音苋、紫背天葵等，可作蔬菜食用，具有一定的降血糖作用，部分地区有少量栽培。目前对于红凤菜降血糖作用的研究还不完善，从红凤菜中分离得到的主要化学成分为黄酮类成分，这些黄酮类成分又以山柰酚、槲皮素、芦丁、异槲皮素及其苷类为主，均为常见的黄酮类化学成分，无特别显著的降血糖效果。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种具有显著抑制α -葡萄糖苷酶活性、从而达到降血糖效果的红凤菜蛋白提取物及其制备方法以及在保健品或药物制备方面的应用。为了达到上述目的，本发明提供了一种红凤菜蛋白提取物，以红凤菜植物的新鲜叶片为原料，通过蛋白提取方法制备得到。上述蛋白提取方法为采用Tris-HCl缓冲液提取、硫酸铵盐析法沉淀。Tris-HCl缓冲液浓度为20-100 mmol/L, pH值为7. 50-8. 80 ;提取缓冲液中含有苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、二硫苏糖醇(DTT)、维生素C (Vc)和氯化钠(NaCl)5PMSF的浓度为O. 01-1 mmol/L, PVP的质量百分浓度为O. 1-1%, EDTA-Na2的浓度为O. 2-2 mmol/L, DTT的浓度为2-50 mmol/L, Vc的浓度为l-lOmmol/L，NaCl的质量百分浓度为0. 5-1% ;缓冲液的加入量为每克红凤菜新鲜叶片加入5-10毫升缓冲液。硫酸铵盐析法沉淀为依次在硫酸铵的饱和度为20%、50%和80%下进行分级沉淀，分别得到0-20%饱和度的蛋白提取物、20-50%饱和度的蛋白提取物以及50-80%饱和度的蛋白提取物；0-20%饱和度的蛋白提取物或50-80%饱和度的蛋白提取物为得到的红凤菜蛋白提取物。本发明还提供了该红凤菜蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤
(1)提取取红凤菜的新鲜叶片，加入预冷的提取缓冲液，匀浆，在4°c提取20min，过滤，取滤液，离心，得到的上清液即为提取液；提取缓冲液是浓度为20-100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH值为7. 50-8. 80 ;提取缓冲液中含有苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2X二硫苏糖醇(DTT)、维生素C (Vc)和氯化钠(NaCl)5PMSF的浓度为0. 01-1 mmol/L, PVP的质量百分浓度为0. 1-1%, EDTA-Na2的浓度为
0.2-2 mmol/L, DTT的浓度为2-50 mmol/L, Vc的浓度为l-10mmol/L，NaCl的质量百分浓度为0. 5-1% ;缓冲液的加入量为每克红凤菜新鲜叶片加入5-10毫升缓冲液；
(2)盐析法沉淀将步骤(I)中得到的提取液，加入硫酸铵，使饱和度达20-80%，在4°C沉淀10-30min后，离心；
(3)透析取步骤(2)中离心得到的沉淀,加入溶解缓冲液(10-50mmol/L Tris-HCl,pH7. 50-8. 80，含2-50 mmol/L DTT)，使沉淀完全溶解，将溶液装入透析袋中进行透析，得到蛋白质溶液；
(4)冷冻干燥将步骤(3)制得的蛋白质溶液进行冷冻干燥，所得干燥粉末即为红凤菜蛋白提取物。步骤(2)中所述的硫酸铵的饱和度为20%,沉淀IOmin,离心15min,取沉淀，即得0-20%饱和度的蛋白提取物；所述离心的转速为lOOOOrpm，温度为4°C。或该盐析法为分级沉淀法，具体步骤如下在提取液中加入硫酸铵使饱和度达20%，4°C放置IOmin后，离心15min ;取上清液，加入硫酸铵使饱和度达50%，4°C放置IOmin后，离心15min ;取上清液，继续加入硫酸铵使饱和度达80%，4°C放置IOmin后，离心15min，取沉淀，得到50-80%饱和度的蛋白提取物；离心的速度为10，000 rpm，温度为4°C。本发明还提供了该红凤菜蛋白提取物在制备抑制α-葡萄糖苷酶抑制剂类的保健品或药物上的应用。本发明相比现有技术具有以下优点利用缓冲液提取一盐析法沉淀，有效地得到具有显著抑制α-葡萄糖苷酶的蛋白提取物；在提取缓冲液中加入苯甲基磺酰氟抑制蛋白酶活性，防止蛋白质降解，利用乙二胺四乙酸二钠络合金属离子，采用聚乙烯吡咯烷酮增加蛋白质溶出率并保护蛋白，用二硫苏糖醇保护蛋白质的巯基；本发明制备的0-20%饱和度以及50-80%饱和度的红凤菜蛋白提取物对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果。α-葡萄糖苷酶专一性地催化含α -葡萄糖苷的蔗糖或麦芽糖水解，本发明红凤菜蛋白提取物作为α -葡萄糖苷酶抑制剂可抑制α -葡萄糖苷酶的活性，阻断碳水化合物分解成单个葡萄糖，可作为辅助治疗糖尿病的保健品或药物而进一步研究开发。
图I为本发明实施例三中制备的红凤菜0-20%饱和度的蛋白提取物对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用效果 图2为本发明实施例三中制备的红凤菜20-50%饱和度的蛋白提取物对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用效果 图3为本发明实施例三中制备的红凤菜50-80%饱和度的蛋白提取物对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用效果 图4为阳性对照药阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用效果图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明红凤菜蛋白提取物进行详细说明。各实施例中使用的仪器设备、化学试剂以及检测方法如下
仪器设备冷冻离心机(Eppendorf 5804R)，真空冷冻干燥机(西安波意尔精密仪器有限公司 LGJ-12)，酶标仪(TECAN，Infinite F50)；
化学试剂Tris MDBio Inc, Lot 403089 ；DTT MDBio Inc, Lot 527079 ；PVP K-30 Fluca ；PMSF :进口分装；Vc :国药集团化学试剂有限公司，批号20080716 ； (NH4)2SO4 :上海久亿化学试剂有限公司；NaCl :上海久亿化学试剂有限公司；EDTA-Na2 :江苏昆山金诚试剂厂；透析袋北京经科宏达生物技术有限公司，截留分子量3500 ;阳性对照药阿卡、波糖(拜糖平，拜耳医药保健有限公司出品)；α-葡萄糖苷酶oriental yeast co. ltd,lot :22003903 ；4-nitropheny-a -D-glucopyranose (pNPG) sigma, lot BCBB2652 ;服素Amresco 0378 ;硫服BioSharp ；CHAPS Amresco 0465 ;两性电介质载体缓冲液 AmpholinpH 3. 0-9. 5 =BioSharp ;三氯乙酸(TCA) (AR):上海凌峰化学试剂有限公司，批号070423 ；采用凯氏定氮法测定蛋白提取物中的蛋白质含量。实施例一
TCA/丙酮法提取红凤菜蛋白
称取红凤菜植株倒数第3-4片鲜叶10 g，先用自来水冲洗2遍，再用蒸馏水冲洗I遍，加液氮研磨成细粉，倒入50 ml离心管中，加30 ml在_20°C冰冷过的丙酮，再加入3ml三氯乙酸(TCA)，旋涡振荡混匀，混合物在-20 °C放置90分钟，4 °C离心(10,000 rpmX 20min),弃去上清液,所得沉淀用30 ml冷丙酮洗漆2次,离心,取沉淀物在室温晾干,加入6ml提取缓冲液(8 mol/L脲素，2 mol/L硫脲，4% (ff/V) CHAPS, 0. 4% (V/V)两性电介质载 体缓冲液Ampholin pH 3. 0-9.5,50 mmol/L DTT)，振荡混匀，放置5分钟，在18°C离心(10,000 rpmX 20 min)，取上清液，加入8 ml 10% TCA/冷丙酮(含20 mmol/L DTT),-20 °C放置90分钟，4 °C离心(10，000 rpmX15 min)，弃去上清液，沉淀物用I ml冷丙酮(含20mmol/L DTT)洗2次，沉淀物在空气中晾干，加入适量50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0，含20mmol/L DTT)，待完全溶解后，将蛋白溶液冷冻干燥，制成白子菜蛋白提取物冻干粉。用该法制得红凤菜蛋白提取物冻干粉0.36 g，采用凯氏定氮法测得蛋白含量为52. 3%。经测定该蛋白提取物对α -葡萄糖苷酶的活性有一定抑制作用，IC50为2. 94 mg/ml ο实施例二
Tris-HCl缓冲液提取/(NH4)2SO4沉淀法提取红凤菜蛋白
取红凤菜植株倒数第3-4片鲜叶20 g，加预冷的提取缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH
8.5,0. I mmol/L PMSF, 1% NaCl) 200 ml，匀浆，在 4°C提取 20min，离心(10，000 rpmX15min)，取上清液，加入(NH4)2SO4使饱和度达80%，4 °C放置20 min后，离心(10，000rpmX 15 min),所得沉淀即为红凤菜0-80%饱和度的蛋白。在沉淀中加入适量50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，待完全溶解后，将蛋白溶液装入透析袋进行透析，去除残留的(NH4)2SO4，最后将蛋白溶液冷冻干燥，制成红凤菜蛋白提取物冻干粉。用该法得到I. 55 g样品，采用凯氏定氮法测得蛋白含量为49. 4%。经测定该蛋白提取物对α -葡萄糖苷酶的活性有一定的抑制作用，当样品浓度为8. 63 mg/ml时，抑制百分率为41.6% ο实施例三
Tris-HCl缓冲液提取/(NH4)2SO4分级沉淀法提取红凤菜蛋白
取红凤菜植株倒数第3-4片鲜叶20g，加预冷的提取缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.5，0.1 mmol/L PMSF,1% PVP,2 mmol/L EDTA-Na2,20 mmol/L DTT,10 mmol/L Vc,1%NaCl) 200ml，勻衆，在4°C提取20min, 2层纱布过滤,取滤液离心(10, 000 rpmX 15min),得上清液，在上清液中加入(NH4)2SO4使饱和度达20%，4°C放置IOmin后离心(4°C，10，000rpmX 15min)，所得沉淀即为提取的白子菜0-20%饱和度的蛋白；取上清液，加入(NH4) 2S04使饱和度达50%，4°C放置10 min后离心(4°C，10，000 rpmX15 min)，所得沉淀即为提取的白子菜20-50%饱和度的蛋白；取上清液，继续加入(NH4)2SO4使饱和度达80%，4°C放置IOmin后，离心(4°C，10，000 rpmX15 min)，所得沉淀即为提取的白子菜50-80%饱和度的蛋白。在各部分的沉淀中加入适量50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0，含20 mmol/L DTT)，待完全溶解后，将蛋白溶液装入透析袋进行透析，去除残留的(NH4)2SO4，最后将蛋白溶液冷冻干燥，制成白子菜蛋白提取物冻干粉，采用凯氏定氮法测定蛋白提取物冻干粉中的蛋白质含量。用该法制得0-20%饱和度的蛋白提取物冻干粉O. 15 g，其中蛋白含量为58. 2% ;制得20-50%饱和度的蛋白提取物冻干粉I. 47 g，其中蛋白含量为44. 1% ;制得50-80%饱和度的蛋白提取物冻干粉O. 45 g，其中蛋白含量为57.9%。实施例四 Tris-HCl缓冲液提取/(NH4)2SO4分级沉淀法提取红凤菜蛋白
制备方法如实施例三，提取缓冲液采用浓度为20mmol的Tris-HCl缓冲液，pH7. 5，含有 O. 01 mmol/L PMSF,O. 1% PVP,O. 2 mmol/L EDTA-Na2, 2 mmol/L DTT,I mmol/L Vc,0. 5%NaCl，加入量为100ml。用该法制得0-20%饱和度的蛋白提取物冻干粉0. 13 g，其中蛋白含量为57. 2%，对α -葡萄糖苷酶的IC5tl为0. 57 mg/ml ;制得20-50%饱和度的蛋白提取物冻干粉I. 24g，其中蛋白含量为42. 7%，对α -葡萄糖苷酶的IC5tl为2. 71mg/ml ;制得50-80%饱和度的蛋白提取物冻干粉0. 32 g，其中蛋白含量为56. 5%，对于α -葡萄糖苷酶的IC5tl为0. 69 mg/ml。
实施例五
红凤菜蛋白提取物对的α-葡萄糖苷酶抑制效果实施例
分别称取实施例三中制备的红凤菜0-20%、20-50%和50-80%饱和度的蛋白提取物冻干粉约20mg,加入0. 5ml磷酸盐缓冲液(67 mmol/L ρΗ6· 8),配制成浓度约40 mg/ml的蛋白溶液，再稀释成系列浓度，作为供试样品，用96孔板测定不同浓度蛋白样品对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。酶活测定在反应孔中依次加入1μ I酶液、60μ I磷酸盐缓冲液(67 mmol/L,pH6. 8，下同)，在37°C反应lOmin，加入10μ I反应底物(0.1 mmol/L pNPG，磷酸盐缓冲液配制，下同)，反应IOmin后,测定405 nm处的吸光度(AliisX酶空白测定在反应孔中依次加入1μ I酶液、60 μ I磷酸盐缓冲液，在37°C反应10分钟，加入10 μ I磷酸盐缓冲液，反应IOmin后，测定405 nm处的吸光度(A11空自)。样品测定在反应孔中依次加入I μ I酶液、50 μ I磷酸盐缓冲液、10 μ I样品，在37°C反应10分钟，加入10 μ I反应底物，反应IOmin后，测定405 nm处的吸光度(A#iJ)。样品空白测定在反应孔中加入61μ I磷酸盐缓冲液，在37°C反应lOmin，加入10 μ I反应底物，反应IOmin后，测定405 nm处的吸光度(A#s空白)。以上所有样品及空白反应均重复3次，取平均值作为实验数据。计算供试样品对α _甸甸糖昔酶的抑制百分率=[(Α酶活-A酶空白)-(Α样品-A样品空白)]/(Ailis-Aiis;自)X 100%;半数抑制浓度(IC5tl):以蛋白浓度为横坐标，其对α-葡萄糖苷酶的抑制百分率为纵坐标，作图，得到样品剂量效应曲线，当抑制百分率为50%时所对应的蛋白浓度即为样品对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC5(I)。同时以阿卡波糖为阳性对照药，测定其对α -葡萄糖苷酶的抑制百分率及IC5(I。
图I显示了红凤菜0-20%饱和度的蛋白对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。由图I可见，当蛋白浓度由O. 07 mg/ml增加到I. 13mg/ml，抑制百分率从7. 3%增加到65. 1%，蛋白浓度高于I. 13mg/ml，抑制百分率增加的幅度减小，当蛋白浓度为4. 25 mg/ml时，抑制百分率可达92. 8%，当蛋白浓度继续增加，抑制百分率不再显著提高。由图I得出，当抑制百分率为50%时，蛋白浓度为O. 59 mg/ml，即红凤菜0-20%饱和度的蛋白对于α-葡萄糖苷酶的IC50 为 O. 59 mg/ml。图2显示了红凤菜20-50%饱和度的蛋白对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。当蛋白浓度由I. 55 mg/ml增加到6. 21 mg/ml，抑制百分率从33. 27%增加到70. 7%，以后随蛋白浓度增加，抑制百分率增加的幅度减小，当蛋白浓度增加到8. 63 mg/ml时，抑制百分率仅达到76. 7%。由图2得出红凤菜20-50%饱和度的蛋白对于α -葡萄糖苷酶的IC5tl为2. 70 mg/ml。图3显示了红凤菜50-80%饱和度的蛋白对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。由图3可见，当蛋白浓度由O. 14 mg/ml增加到I. 15 mg/ml时,抑制百分率由8. 4%增加到66. 7%，两者几近线性关系，当蛋白浓度高于I. 15 mg/ml时，抑制百分率增加幅度减慢，蛋白浓度增加到2. 89 mg/ml时，抑制百分率可达90%以上，此后，随着蛋白浓度增加，抑制百分率不再显著提高。根据图3，红凤菜50-80%饱和度的蛋白对于α-葡萄糖苷酶的IC5tl为
O.67 mg/ml。图4表示阳性对照药阿卡波糖对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。当阿卡波糖浓度由O. 22 mg/ml增加到O. 88mg/ml，抑制百分率从22. 6%增加到64. 8%，阿卡波糖浓度高于
O.88mg/ml，抑制百分率增加的幅度减小，当阿卡波糖浓度为7. 04 mg/ml时，抑制百分率为94. 5%。由图2得出，阿卡波糖对于α -葡萄糖苷酶的IC5tl为O. 56 mg/ml。实验结果表明，红凤菜0-20%饱和度的蛋白及50-80%饱和度的蛋白对α -葡萄糖苷酶有显著的抑制作用，效果均与阳性对照药阿卡波糖相当。红凤菜20-50%饱和度的蛋白对α -葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，但效果明显低于阳性对照药阿卡波糖。
权利要求
1.一种红凤菜蛋白提取物，以红凤菜植物的新鲜叶片为原料，通过蛋白提取方法制备得到。
2.根据权利要求I所述的红凤菜蛋白提取物，其特征在于所述蛋白提取方法为采用Tris-HCl缓冲液提取、硫酸铵盐析法沉淀。
3.根据权利要求2所述的红凤菜蛋白提取物，其特征在于所述Tris-HCl缓冲液浓度为20-100 mmol/L, pH 7. 50-8. 80 ;所述缓冲液中含有苯甲基磺酰氟、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇、维生素C和氯化钠；所述缓冲液中苯甲基磺酰氟的浓度为0.01-1 mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮的质量百分浓度为O. 1-1%,乙二胺四乙酸二钠的浓度为O.2-2 mmol/L, 二硫苏糖醇的浓度为2-50 mmol/L,维生素C的浓度为1_10 mmol/L,氯化钠的质量百分浓度为0. 5-1% ;所述缓冲液的加入量为每克红凤菜新鲜叶片加入5-10毫升缓冲液。
4.根据权利要求2所述的红凤菜蛋白提取物，其特征在于所述硫酸铵盐析法沉淀为依次在硫酸铵的饱和度为20%、50%和80%下进行分级沉淀，分别得到0-20%饱和度的蛋白提取物、20-50%饱和度的蛋白提取物以及50-80%饱和度的蛋白提取物；所述0-20%饱和度的蛋白提取物或50-80%饱和度的蛋白提取物为所述红凤菜蛋白提取物。
5.一种权利要求I所述红凤菜蛋白提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)提取取红凤菜的新鲜叶片，加入预冷的提取缓冲液，匀浆，在4°C提取20min，用2层纱布过滤，取滤液，离心，所得上清液即为提取液；所述提取缓冲液是浓度为20-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7. 50-8. 80 ;所述提取缓冲液中含有苯甲基磺酰氟、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇、维生素C和氯化钠；所述缓冲液中苯甲基磺酰氟的浓度为0. 01-1 mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮的质量百分浓度为0. 1-1%,乙二胺四乙酸二钠的浓度为0. 2-2 mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2_50 mmol/L，维生素C的浓度为1_10mmol/L，氯化钠的质量百分浓度为0. 5-1% ;所述缓冲液的加入量为每克红凤菜新鲜叶片加入5-10晕升缓冲液； (2)盐析法沉淀将步骤(I)中得到的提取液，加入硫酸铵，使饱和度达到20-80%，在4°C沉淀10-30min后，离心； (3)透析取步骤(2)中离心得到的沉淀，加入溶解缓冲液，使沉淀完全溶解，将溶液装入透析袋中进行透析，得到蛋白质溶液；所述溶解缓冲液是浓度为10-50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7. 50-8. 80 ;所述溶解缓冲液含有2_50 mmol/L的DTT ； (4)冷冻干燥将步骤(3)制得的蛋白质溶液进行冷冻干燥，所得干燥粉末即为红凤菜蛋白提取物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中硫酸铵的饱和度为20%，沉淀lOmin，离心15min，取沉淀，即得0-20%饱和度的蛋白提取物；所述离心的转速为lOOOOrpm，温度为 4°C。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的盐析法沉淀采用分级盐析，具体步骤如下在提取液中加入硫酸铵使饱和度达20%，4°C放置IOmin后，离心15min ;取上清液，加入硫酸铵使饱和度达50%，4°C放置IOmin后，离心15min ;取上清液，继续加入硫酸铵使饱和度达80%，4°C放置IOmin后，离心15min，取沉淀，得到50-80%饱和度的蛋白提取物；所述离心的速度为10000 rpm，温度为4°C。
8.权利要求I所述红凤菜蛋白提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类保健品或药物上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种红凤菜蛋白提取物及其制备方法与应用。该红凤菜蛋白提取物以红凤菜植物的新鲜叶片为原料，通过蛋白提取方法制备得到。本发明制备的红凤菜蛋白提取物具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可作为辅助治疗糖尿病的保健品或药物而进一步研究开发。
文档编号C07K1/30GK102690324SQ20121020077
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者任冰如, 吕寒, 吴菊兰, 李维林, 梁呈元, 陈剑, 马丽 申请人:江苏省中国科学院植物研究所