奶中一种或多种蛋白的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种存在于奶中的至少一种蛋白的提取方法，所述蛋白表现出与所述奶中复合的或非复合的钙离子的亲和性，包括如下步骤：a）通过将奶与可溶性盐接触产生钙化合物沉淀而释放蛋白，以通过这种方法获得蛋白富集的液相，该可溶性盐的阴离子由于其具有在这种介质中形成所述不溶性钙化合物的能力而被选择；b)将蛋白富集的液相与钙化合物沉淀分离，而且，所述液相被分离成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及c)回收含有蛋白的水性非脂相。
【专利说明】奶中一种或多种蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及奶中一种或多种蛋白的提取方法。所述蛋白对所述奶中复合的或非复合的钙离子具有亲和性。
[0002]本发明中，复合的或非复合的钙离子指结合到酪蛋白以形成酪蛋白的胶束胶体结构的磷酸钙盐，或者指这些没有结合到酪蛋白并因此是自由的盐。这些离子也是溶解在奶中的与上述不同的各种钙盐和/或有机的和/或无机钙复合物。对奶中钙离子具有亲和性的蛋白是指那些自然存在的蛋白，例如乳清蛋白、乳球蛋白以及免疫球蛋白。这些蛋白也指存在于转基因动物奶中的重组蛋白，例如，血凝因子，尤其是因子νπ、因子珊和因子IX。
【背景技术】
[0003]市售药物的主要部分对应于合成获得的化学物质。事实上，直到最近，现代医学高度依赖于利用化学合成生产的药物，用于疾病的诊断和治疗。
[0004]然而，蛋白代表携带生物信息的分子的实质部分，尤其是大量的激素、生长因子、血凝因子或抗体。
[0005]通常，蛋白质为基于氨基酸的聚合物，且大部分具有高分子量，其不能通过化学合成在可接受的成本下获得。这些用于治疗的蛋白质通常从人类或者动物组织或血液，例如活体，通过分离和纯化获得。尤其是从猪胰腺提取的胰岛素、从血浆中提取的例如为因子珊或因子IX的血凝因子、或 者免疫球蛋白。
[0006]尽管目前上述蛋白质的制备方法被大量应用，然而，它们具有缺陷。从血小板中提取的一些蛋白，例如为促红细胞生成素，的低含量使得它们不能足够量的分离以满足不断增长的治疗需要。此外，在血浆蛋白的生产过程中，人体内病毒、朊病毒或者其他致病剂的存在需要添加病毒灭活和/或病毒消除的包涵体，以获得可用于治疗的有用产品。
[0007]为了克服这些缺陷，遗传工程被使用。该技术同样大量应用于合成蛋白中，从一个独立基因转移到负责分泌期望蛋白的细胞。从源细胞系统外获得的这样的蛋白称之为《重组》。
[0008]根据这一技术，可以使用不同细胞系统。
[0009]细菌系统，例如Ε.coli，大量应用且有效。它们能低成本的生产重组蛋白。然而，这些系统不能用于生产简单的非糖基化蛋白，其不需要精细折叠处理。
[0010]真菌系统同样应用于分泌蛋白的生产。这些真菌系统的缺陷在于它们是翻译后修饰的起因，包括，例如，接枝聚糖部分和硫酸基，其能高度影响生产的蛋白的药代动力学，尤其是添加甘露糖衍生物的不同基团。
[0011]使用杆状病毒的系统可以生产非常不同的蛋白，例如疫苗蛋白或生长激素，但是它们工业化应用不是最优的。
[0012]同样使用哺乳动物培养物以用于重组复合蛋白的生产，例如单克隆抗体。细胞表达系统导致正确的折叠的和修饰的重组蛋白。与生产成本相比，低的产量是其主要缺陷。
[0013]这些细胞系统的变体包括实现转基因植物以用于获得大量的蛋白。然而，这些系统产生植物-特异性翻译后修饰，尤其是在生产的蛋白中添加了高度致免疫木糖残基，因此限制了它们在治疗应用中的用途。
[0014]前面提到的细胞系统的替代包括使用转基因动物以用于生产重组疫苗或者复合治疗蛋白。因此，获得的蛋白表现出与人类接近的糖基化，且能被正确的折叠。这些复合蛋白并不仅由一个简单的例如为生长激素的多肽链组成，它们组装成氨基酸后用不同的途径被修饰，尤其是通过特异性断裂、糖基化和羧甲基化。大部分情况下，通过细菌细胞或酵母不能实现修饰。另一方面，转基因动物能同时结合细菌细胞系统中遇到的表达水平以及细胞培养物中获得的翻译后修饰，同时与使用细胞表达系统相比，降低了制造成本。
[0015]来自于转基因动物的生物材料中，奶是研究的目标，其被考虑为非常符合要求的分泌重组蛋白的来源。
[0016]从转基因动物的奶中生产的重组蛋白，能很容易的通过将编码所感兴趣蛋白的基因接枝到一个负责合成奶蛋白的基因的调控区而获得，其会指导特别是在乳腺中的合成，之后分泌到奶中。
[0017]例如，EP0527063描述了在转基因哺乳动物的奶中感兴趣蛋白的生产。提到了通过抗乳血清的启动子来控制编码感兴趣蛋白的基因的表达。
[0018]另外的专利申请或者专利描述了抗体(EP0741515)、胶原(W096/03051)、人类因子IX (US6046380)、以及因子VDI /血管性血友病因子复合物(EP0807170)在转基因哺乳动物的奶中的制备。
[0019]尽管这些方法在蛋白表达方面有满意的结果，但是使用奶作为重组蛋白的源具有缺陷。主要缺陷一方面在于难以从奶中提取获得满意的产量，另一方面在于接下来难以提纯。
[0020]事实上，奶是一种混合物，90%由含有不同成分的水组成，该成分能分为三类。第一类称为抗乳血清(或乳清)，由糖类、可溶蛋白、矿物质和水溶性维生素组成。第二类称为脂相(或乳膏)，含有乳化形式的脂肪。第三类称之为蛋白相，包含80%的酪蛋白，其在钙的存在下，在PH4.6或者凝乳酶、酶促凝剂的作用下形成全部的可沉淀蛋白。不同的酪蛋白与磷酸钙盐能形成直径达到0.5 μ m胶体胶束复合物，磷酸钙盐例如为磷酸三钙盐的聚合《团簇》形式，即Ca9(P04)6。这些胶粒是由酪蛋白亚基形成的，酪蛋白亚基包含包围着疏水核的富含酪蛋白-K的亲水层，磷酸钙盐通过静电作用与亲水层结合。这些磷酸盐也可存在于胶粒的内部空间中，不与酪蛋白结合。这种蛋白相也包含可溶性蛋白，例如乳清蛋白和乳球蛋白，以及来自于血液的白蛋白和免疫球蛋白。
[0021]依赖于分泌到转基因动物奶中的重组蛋白的性质，其可以存在于抗乳血清或者蛋白相中，甚至是同时存在于上述两者中。每个奶成分的含量和复杂度使得提取蛋白变的更为困难，尤其是当其圈闭到酪蛋白胶束中。另外的困难在于蛋白存在于两种相中的一个具有不可预见性。
[0022]重组蛋白还能与奶中以盐和/或不同可溶性复合物、或者酪蛋白胶束的磷酸钙盐的形式存在的钙离子表现出亲合性。这一亲合性通过蛋白与二价钙离子的静电连接表现出来。亲合性蛋白/钙离子可以定义亲合常数，利用该值规定连接强度。通常来说，大部分与钙离子表现出亲合性的蛋白与胶束的磷酸钙盐相结合。其的提取需要执行复合步骤，带来了实现和产量的问题。[0023]乳品加工业的经典溶剂不能用于这种情况，该经典溶剂用于蛋白的分离，该分离由巴氏灭菌、接着再酶促凝或者酸促凝(PH4.6)组成。这是由于在温度和pH联合作用下，重组蛋白常常被变性。此外，蛋白在酪蛋白胶束中的圈闭导致了低的提取产量。另外用在通过过滤、离心和/或沉淀或析出技术来对奶进行分离的物理方法中的溶剂也导致不能接受的提取产量，且提取出的重组蛋白纯度低。
[0024]EP0264166描述了在遗传学转基因动物的奶中期望蛋白的分泌。该文献中没有提及这种蛋白从奶中的纯化步骤。
[0025]US4519945描述了一种用于提取重组蛋白的方法，该方法通过从奶中制备酪蛋白的沉淀物，再进行如前所述的酸化和加热步骤。该方法显著降低了期望蛋白的活性并且提
取产量低。
[0026]US6984772公开了从转基因哺乳动物的奶中纯化重组纤维蛋白原的方法。该方法包括通过连续离心从酪蛋白球中分离抗乳血清，以及蛋白相的分离。抗乳血清被分离并被储存用于接下来的处理，获得了一种纤维蛋白原的纯化溶液。
[0027]然而，该方法不能用于生产产量满意的圈闭到酪蛋白胶束内和/或上的重组蛋白。例如血凝因子，例如因子νπ、因子VDI和因子IX。
[0028]专利申请W02004/076695描述了从转基因动物的奶中重组蛋白的过滤方法。该方法包括第一步奶的净化，该步骤即利用一种方法除去奶的成分以获得一种易于过滤通过孔直径为0.2μπι的过滤膜的溶液。最终该步骤除去了酪蛋白胶束。因此，如果酪蛋白胶束易于包含圈闭在其结构内的感兴趣的蛋白，这个步骤在产量方面是有缺陷的，
[0029]US6183803描述了一种从奶中分离蛋白的方法，该蛋白为天然存在于奶中的例如为乳清蛋白的蛋白，以及例如为人类白蛋白或α 1-抗胰蛋白酶的重组蛋白。该方法包括将含有感兴趣蛋白的奶与螯合剂接触的初始步骤。这破坏了酪蛋白胶束，导致了含有酪蛋白、抗乳血清蛋白以及感兴趣蛋白的澄清奶血清。该方法还包括酪蛋白胶束的再构造步骤，该步骤为添加二价阳离子不溶性盐到液体介质(澄清奶血清)。由于盐饱和了酪蛋白的静电连接位点，这些胶束析出，并获得了一个含有没有被圈闭到胶束中的感兴趣的蛋白的液相。因此，根据这一方法，感兴趣的蛋白的分离最终通过胶束的再构造以及它们的析出实现。
[0030]该方法操作复杂，不能被应用到与钙离子具有相对高度亲和性的蛋白上。凝析的蛋白，以及尤其是那些已知的在维生素K影响下合成的蛋白，属于这个类别。
[0031]观察发现，对某一类别的、分泌到转基因动物奶中的、存在于抗乳血清中的转基因蛋白的分离和纯化方法导致了非常低的产量，对于那些圈闭到酪蛋白胶束的其它类蛋白，该分离和纯化方法操作复杂。 申请人:给自己设定了一个任务，以提供一种从奶中提取与奶中离子形式的钙具有亲和性的天然或非天然的奶组成蛋白的简单方法，且具有满意的产量，同时保留蛋白的生物活性，该奶组成蛋白例如为重组因子νπ、因子VDI和因子IX。
【发明内容】
[0032]因此，本发明涉及一种存在于奶中的至少一种蛋白的提取方法，所述蛋白表现出与所述奶中复合的或非复合的钙离子的亲和性，包括如下步骤:
[0033]a)通过将奶与可溶性盐接触产生钙化合物沉淀而释放蛋白，以通过这种方法获得蛋白富集的液相，该可溶性盐的阴离子由于其具有在这种介质中形成所述不溶性钙化合物的能力而被选择；
[0034]b)将蛋白富集的液相与钙化合物沉淀分离，而且，所述液相被分离成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及
[0035]c)回收含有蛋白的水性非脂相。
[0036] 申请人:惊奇的注意到添加可溶性的盐可以沉淀钙化合物，其中，感兴趣的蛋白被从这些复合的或非复合的离子中释放，并可以在液相的溶液中再次找到，该可溶性盐的阴离子由于其具有在含有蛋白，尤其是重组蛋白的奶中形成所述不溶性钙化合物的能力而被选择，该蛋白表现出与复合的或非复合的钙离子的亲和性，即表现出固定到钙离子的位点。
[0037]上述提到的复合的或非复合的钙离子代表在奶中可溶的不同的有机和/或无机钙盐和/或复合物。这些盐或复合物能存在于酪蛋白胶束的内部空间中(参见后面图1所示)。
[0038]这些钙离子也表示与酪蛋白胶束，尤其是聚集形式(《团簇》)的酪蛋白胶束，相互作用的磷酸钙盐。这些盐还以磷酸一钙和/或磷酸二钙的形式存在于奶中，其与钙的其他离子形式相平衡，取决于所执行的化学的和生化的反应。
[0039]最后，这些钙离子代表钙/酪蛋白复合物，即，通过静电作用与磷酸钙盐相连的酪蛋白亚基。这些钙/酪蛋白复合物也指与磷酸钙盐以及有机和/或无机可溶性钙盐和/或复合物相连的酪蛋白胶束。
[0040]不可溶钙化合物指在奶中溶解度小于0.5%的钙盐或者复合物。
[0041]大部分情况下，感兴趣的蛋白大多与酪蛋白胶束的磷酸钙盐相连。
[0042]因此，表现出与复合的或非复合的钙离子亲和性的蛋白是指具有足够数量的固定位点的任何蛋白，该固定位点用于与钙离子全部或部分相连，或者用于与酪蛋白胶束的磷酸钙盐全部或部分相连。
[0043]例如，如果感兴趣的蛋白表现出许多与钙离子的固定位点，例如8到10个GLA域，该域富含可以固定钙离子的Y —羧基谷氨酸，至少70%到90%的感兴趣的蛋白圈闭到酪蛋白胶束内和/或上。对于其它蛋白表现出较少钙离子固定位点，例如2到8个GLA域，其至少30%到60%圈闭到酪蛋白胶束内和/或上。最后，甚至蛋白表现出非常少的钙离子固定位点，例如O到2个GLA域，其可能以至少5%到20%的比例圈闭到酪蛋白胶束内和/或上。对于工业范围内实现本方法，这些被圈闭蛋白的量是不可被忽视的，这意味着可以达到最高可能的产量。没有被圈闭到胶束内和/或上的余下的蛋白表现出与上面提到的奶中的其它形式的钙离子的亲和性。
[0044]因此，本发明的方法可以应用于至少2%_10%、或者至少40%_60%、或者尤其是至少90%与钙离子相连的蛋白中提取蛋白。
[0045]这些蛋白与钙离子的亲和性能由未修饰的或体内或体外修饰过，例如通过翻译后修饰，的蛋白的相互作用产生。
[0046]因此，表现出许多与复合的或非复合的钙离子的固定位点的蛋白可以与奶中存在的不同形式的钙离子相连。
[0047]没有被任何所观察到机理的解释束缚， 申请人:假设可溶性盐的加入替换了胶粒的磷酸钙盐 的平衡，尤其是钙/磷酸盐比，从而导致其变性，以及酪蛋白亚基的聚合沉淀。圈闭于胶粒中和/或上的与磷酸钙盐结合的感兴趣蛋白在其变性时被释放进入媒介中。另外，同时，感兴趣的蛋白还被从磷酸钙盐上释放或分离，由于它们在本发明方法中所使用的可溶性盐的作用下以不溶性钙化合物的形式沉淀。同样的，与可溶性钙的有机和/或无机盐或复合物结合的感兴趣的蛋白将会由于相同类型的反应而分离。
[0048]这一机制在图1中举例阐述。
[0049]在本发明的范围内，该可溶性盐是任何可以获得期望效果的盐。
[0050]在本发明的方法中，为了成功将蛋白从与钙离子的相互作用中释放，所使用的可溶性盐可以以由本领域技术人员选择的浓度加入到奶中。事实上，该浓度是足够允许至少20%的分离，或有利的，至少30%到50%的感兴趣蛋白释放的浓度。特别有利的，该浓度是足够允许至少60%到80%的，或至少90%的感兴趣蛋白释放的浓度。
[0051]此外，本发明方法也可以被应用到仅部分具有与钙离子固定位点的蛋白。例如，本发明的方法能被应用到奶中的1%与钙离子结合的蛋白的提取。本发明的方法也能用于从至少2%到10%、或者至少40%到60%、或者尤其是至少90%与这些钙离子结合的蛋白。
[0052]本发明的方法允许尤其是酪蛋白亚基聚合的沉淀。该沉淀是由于如前面提到的酪蛋白胶粒的变性。所应用的本发明的方法通过沉淀而破坏了奶的胶质状态。[0053]因此，本发明的方法是一种允许奶从胶质状态转变为液体状态的方法，其对应于胶质/液体的直接提取。
[0054]本发明的方法还可以获得比初始奶中颜色更浅的抗乳血清和脂相。事实上，这是钙离子结合酪蛋白将它们的白色赋予了奶。一旦沉淀，它们不再能够将它们的颜色赋予奶。
[0055]因此，本发明的方法具有几个优点:第一，容易实现，这是由于其允许通过简单的实施分离感兴趣的蛋白，此外，它允许在非脂水性相中回收感兴趣的蛋白，且具有很好的产量。有利的，本发明的提取方法获得的产量至少为50%、或者至少60%、或者至少80%。特别有利的，产量为至少90%。
[0056]该方法还允许获得含有感兴趣蛋白的非脂水相，其适宜于实现另外的纯化步骤，尤其是层析法步骤。
[0057]最终，由于本发明方法的步骤是在不改变它们的生物活性的pH下实施的，感兴趣的蛋白仍具有生物活性。pH优选为碱性，例如大约8。
[0058]根据本发明的可溶性盐是指在奶中至少具有0.5份盐每份奶(w/w)的溶解度的盐。
[0059]有利的，方法中所使用的可溶性盐是磷酸盐。该盐可以是水溶液，其随后被加入到奶中，或是粉状的，其被直接加入到奶中。
[0060]优选的，该磷酸盐选自由磷酸钠、磷酸锂、磷酸钾、磷酸铷和磷酸铯组成的组，而特定的，是磷酸钠。
[0061]可选的，在本发明方法中所使用的可溶性盐可以是碱金属草酸盐，特别是草酸钠或钾，或碱金属碳酸盐，特别是碳酸钠或钾，或其的混合物。
[0062]有利的，为实施方法而制备的可溶性盐在水溶液中的浓度在IOOmM到3M之间，更优选的，在200mM到500mM之间，特别的，在200mM到300mM之间。
[0063]因此，根据本发明的优选实施例，本发明的可溶性盐是磷酸钠，其在水溶液中的浓度在IOOmM到3M之间，更优选的，在200mM到500mM之间，特别的，在200mM到300mM之间。
[0064]含有要提取的感兴趣蛋白的奶可以是原始的全奶或脱脂奶。对脱脂奶采用本发明方法的优势在于其脂质含量较低。该方法同样可以应用于新鲜的或冰冻过的奶。
[0065]步骤b)允许分离脂相中的液相以及含有蛋白的水性非脂相，优选的是通过离心实现的。非脂水相实际上是抗乳血清。该分离步骤同时还可以分离酪蛋白胶粒状亚基的聚合体以及钙化合物的沉淀物。
[0066]含有蛋白的水性非脂相从脂相中分离。
[0067]有利的，该方法允许获得清澈的水性非脂相。
[0068]而且，该方法能包括接着步骤c)的用孔隙度逐渐减小的过滤器对水性非脂相连续过滤的步骤，孔隙度优选的为I μ m，接着是0.45 μ m。这些过滤器的使用，例如玻璃纤维基础的，可以减少仍可能存在的脂类、脂肪球以及自然存在于奶中的磷脂的含量。孔隙度小于0.5 μ m的过滤器可以保持非脂水相以及随后执行纯化的载体(超滤器，层析柱等)(见此后)的细菌学质量。脂相优选的通过这些能完全保留奶中脂肪球的过滤器过滤，滤出液是清澈的。
[0069]这一步骤可以接着通过超滤的浓缩/透析的步骤。
[0070]浓缩允许减少非脂水相的体积以便于保存。超滤膜根据所感兴趣蛋白的特征由本领域技术人员选择。通常，空隙尺寸小于或等于感兴趣蛋白的分子量的孔隙度限制可以在没有显著损失的情况下浓缩产品。例如，空隙尺寸为50kDa的膜可以无损失地浓缩分子量为 50kDa 的 FVI10
[0071]透析意在为了接下来的纯化步骤，尤其是层析法，调节含有蛋白的水相。透析也可以去除小分子量的组分，例如乳糖、盐、肽、朊间质一蛋白胨以及任何会破坏产品保藏的试剂。
[0072]优选的，透析缓冲液是(λ 025M到(λ 050M、pH7.5到8.5的磷酸钠溶液。
[0073]步骤c)之后，或者如果可能，在过滤和/或浓缩/透析步骤之后获得的非脂水相可以冰冻并存放于_30°C，直到对其实施进一步的纯化步骤。
[0074]本发明的方法允许用这种方式，从奶中的以静电相互作用结合到蛋白的钙离子中提取并分离一种或多种感兴趣的蛋白。
[0075]蛋白可以是自然存在于奶中的蛋白，表示例如为乳球蛋白、乳铁蛋白、α-乳清蛋白、免疫球蛋白或者蛋白胨，或者它们的混合物。
[0076]蛋白也可以是非自然存在于奶中的蛋白。例如，因子νπ、因子珊、因子IX、因子X、α-1抗胰蛋白酶因子、抗凝血酶II1、白蛋白、纤维蛋白原、胰岛素、髓鞘碱性蛋白、胰岛素原、纤溶酶原组织激活剂et抗体。
[0077]因此，根据本发明的一个优选实施例，含有感兴趣蛋白的奶是转基因奶。
[0078]事实上，由于重组DNA技术以及转基因，非自然存在于奶中的蛋白能通过非人类转基因哺乳动物合成。
[0079]这些对于本领域技术人员熟知的技术，允许在转基因动物的奶中合成任何感兴趣的蛋白。
[0080]这样的蛋白是通过转基因DNA技术合成的重组或转基因蛋白，这两个术语在本申请中被认为是等同的。
[0081]《转基因动物》指的是具有合并到其基因组的外生DNA片段的任何非人类动物，该外生DNA片段尤其是指能编码感兴趣蛋白的DNA片段。该动物表达编码蛋白的外生DNA，且易于传送外生DNA到其产物中。
[0082]照此，任何非人类哺乳动物适合于生产这样的奶。
[0083]有利的，可以使用雌性的兔、绵羊、山羊、牛、猪和老鼠。上述列举是非限制性的。
[0084]感兴趣的蛋白从乳腺分泌，允许该分泌物进入转基因哺乳动物的奶中，意味着用组织依赖性方法来控制重组蛋白的表达。
[0085]这控制方法对于本领域技术人员而言是公知的。对表达的组织控制的执行是由于允许导向特定动物组织进行蛋白表达的序列。这些序列就是启动子序列和肽信号序列。
[0086]本领域公知的启动子的例子是WAP启动子(乳清酸蛋白)、酪蛋白启动子、β_乳球蛋白启动子，此处列举不是限制性的。
[0087]在转基因动物奶中重组蛋白的生产方法可以包括下列步骤:合成DNA分子包含编码感兴趣蛋白的基因，该基因由天然分泌蛋白到奶中的启动子控制，该合成DNA分子被整合到非人类的哺乳动物胚胎中。之后，胚胎被置于同种的雌性哺乳动物中。一旦从该胚胎中获得的哺乳动物发育充分，诱导该哺乳动物进入哺乳期，收集奶。然后，该奶中含有感兴趣的蛋白。
[0088]在非人类的雌性哺乳动物的奶中制备蛋白的方法示例在ΕΡ0527063中进行了描述，该教导可以作为本发明感兴趣蛋白生产的参考。
[0089]含有WAP启动子的血浆通过引入包含WAP基因启动子的序列而制备，该血浆制备成能够接受置于依赖WAP启动子之下的外来基因。编码感兴趣蛋白的基因被整合，并被置于依赖WAP启动子之下。含有该启动子和编码感兴趣蛋白的基因的血浆用来通过显微注射到兔雄原核中而获得转基因雌兔。之后，胚胎被转移至通过激素制备的雌性的输卵管中。转基因的存在通过对从所获得的转基因幼兔中提取的DNA的Southern杂交来显示。动物奶中的浓度通过专门的放射免疫学检测进行评估。
[0090]有利的，根据本发明的方法从奶中生产的和提取的蛋白是凝血蛋白或者凝血因子。实际上，这些蛋白表现出与钙离子很强的亲和性是已知的(Hibbard et al.(1980), J.Biol.Chem.1980, Jan25; 255 (2):638-645)0根据本发明的一个特殊方面，在本发明的提取过程中，凝血因子被活化了。它可以是一种尤其是蛋白《维生素K依赖》的物质，其为血液凝固的关键因子。
[0091]有利的，根据本发明的方法从奶中生产的和提取的蛋白是含有《GLA域》的能固定钙离子的蛋白，或者含有《EDF域》(类表皮生长因子)或者更多的具有固定钙离子能力的域的蛋白，例如《main EF))结构(可以固定钙离子的螺旋-环-螺旋结构)。
[0092]此外，钙依赖蛋白也是易于通过本发明的方法纯化的蛋白，尤其是抗体或单克隆抗体。
[0093]有利的，本发明的蛋白选自由因子II (FII)、因子VD(FVII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、以及它们的活化形式、蛋白C、活化蛋白C、蛋白S和蛋白Z组成的组，或者上述的混合物。
[0094]特别有利的，本发明的蛋白是FVII或者活化的FVII (FVIIa)。
[0095]在这一方面，可以根据EP0527063的教导生产FVII或FVIIa，该方法的概述在上文中已经给出。序列为人类FVII的序列的DNA片段被置在WAP启动子的控制下。例如，这样的DNA序列如EP0200421中序列表1b所列。[0096]有利的，本发明的FVII是活化的。活体中，FVIIa由在两条由二硫键连接的链上用不同蛋白酶(FIXa，FXa，FVIIa)对酶原的裂解形成。FVIIa自身具有非常低的酶活性，但是与其辅助因子，组织因子(TF)复合后，其通过活化FX和FIX而触发凝血过程。
[0097]FVIIa在与组织因子(TF)相互作用上表现出比FVII大25到100倍的凝血活性。
[0098]在本发明的一个实施例中，FVII可以在体外通过因子Xa，Vila, Ila，IXa和XIIa活化。
[0099]本发明的FVII也可以在其提纯过程中被活化。
[0100] 申请人:惊奇的注意到感兴趣的蛋白即使置于抗乳血清中天然产生的蛋白质的启动子，例如WAP启动子，的控制下，其仍然易与奶中的钙离子结合，从而与酪蛋白胶粒结合。
[0101]因此，本发明的方法能用于分离在抗乳血清蛋白启动子的控制下产生的重组蛋白。
[0102]而且，本发明的方法特别适用于在酪蛋白启动子控制下生产的重组蛋白的分离。[0103]蛋白也可以选自由因子珊、α-1抗胰蛋白酶因子、抗凝血酶II1、白蛋白、纤维蛋白原、胰岛素、髓鞘碱性蛋白、胰岛素原、纤溶酶原组织激活剂、和抗体组成的组，或者上述的混合物。
[0104]本发明的方法也可以用于重组乳蛋白的制备。这种情况下，其为不同种类动物的乳腺中合成的乳蛋白(Simons and al, (1987)，Aug6_12; 328 (6130): 530-532)。为了这一目的，举例提及了转基因乳铁蛋白、乳球蛋白、溶菌酶和/或乳清蛋白。
[0105]本发明的另一目的涉及一种奶中的水性非脂相，该奶含有至少一种易于通过本发明的方法获得的蛋白。有利的，水性相是高盐、碱性的，且含有可溶性酪蛋白和至少一种另外的感兴趣蛋白。高盐优选指的是浓度为至少7g/l的钠离子、或者至少18g/l的氯化钠、或者至少0.3mol的氯化钠。优选的，浓度为大约8g/l的钠离子、或者大约为20g/l的氯化钠。碱性指的是pH在8到9之间，优选高于7.8。可溶性酪蛋白表示至少25%的酪蛋白，更优选的指的是至少50%的酪蛋白。
[0106]与没有进行这样方法步骤的奶相比，这样的用于纯化的相中含有至少50%或者优选的至少60%到80%的所有感兴趣蛋白。特别有利的，水性非脂相中包含至少90%的存在于提取前的奶中的所有蛋白。
[0107]根据本发明的一个优选实施例，存在与水性非脂相中的感兴趣蛋白是因子VII(FVII)或者活化的因子VII (FVIIa)。
[0108]本发明的水性非脂相，即使其不再含有酪蛋白胶束以及不溶性钙化合物，然而其仍然包括大部分的杂质。因此，有必要依靠各自情况，继续对水相中的蛋白进行纯化。
[0109]而且，本发明的方法可以包括接下来的对包含蛋白或者感兴趣蛋白的水性非脂相的纯化步骤，该水性非脂相在步骤c)后获得，或者在步骤c)后的过滤和浓缩/透析之后获得。
[0110]因此，步骤c)之后是使用标准层析设备的亲和层析步骤d)，有利的在具有羟磷灰石胶(Caltl(PO4)6(OH)2)或者氟磷灰石(Caltl(PO4)6F2)胶的载体的层析柱上实施。这样水性非脂相中的蛋白被留在载体上，大部分的未保留的乳蛋白被除去。通过在波长(λ)为280nm处的吸收测量进行检测。
[0111]优选的，使用的层析柱与基于0.025M到0.035M磷酸钠、pH7.5到8.5的水性缓冲液A相平衡。水性非脂相被注入到能够保留感兴趣蛋白的柱上。未保留部分通过缓冲液A的浸透而去除，直到回到基线(RBL)来保证对如乳蛋白这样不期望的化合物进行良好的去除。
[0112]蛋白的洗提用基于磷酸盐的缓冲液以预定浓度进行进行，例如磷酸钠或钾或其混合，优选的为基于0.25M到0.35M、pH7.5到8.5的磷酸钠缓冲液B。被洗提的部分被收集直至RBL (回到基线)。
[0113]由于这一步骤，超过90%的所有乳蛋白被去除，而超过90%的感兴趣的蛋白被回收。在这一步，该洗提部分中的纯度约为5%。
[0114]纯度定义为感兴趣蛋白与被考虑的样品、部分或洗提液中存在的所有蛋白的重量比例。
[0115]有利的，蛋白的特异活性作为感兴趣蛋白对层析载体的亲和力的结果从因子10增加到25。
[0116]有利的，对由步骤d)所得到的洗提液进行切向过滤。切向过滤膜由本领域技术人员根据感兴趣蛋白的特性选择。一般而言，孔隙尺寸比感兴趣蛋白的分子量大两倍的孔隙度可以对其进行过滤。例如，孔隙尺寸为IOOkDa的膜可以对FVII进行过滤，并有好的产量。
[0117]这一步过滤的目的是减少尤其是分子量大于感兴趣蛋白的蛋白质的量，特别的来去除感兴趣蛋白的非典型形式(例如聚合形态的蛋白)，以及在一定时间后易于降解感兴趣蛋白的蛋白酶。
[0118]优选的，对获得的过滤过的洗提液进行浓缩和透析。用于通过超滤进行浓缩/透析步骤的合适系统已经进行过描述。
[0119]根据本发明的一个优选实施例，方法包括至少一个用于纯化感兴趣的蛋白的离子交换层析步骤，以及特别的两个连续的离子交换层析步骤。这优选的允许去除保留的乳蛋白。
[0120]离子交换剂以及平衡、冲洗和洗提缓冲液的选择取决于要纯化蛋白的性质。
[0121]该步骤可以直接在步骤c)后实施，可选的，在亲和层析和/或切向过滤步骤之后实施。
[0122]优选的，至少一步和两步层析步骤为阴离子交换层析。更优选的，该阴离子交换层析采用弱碱性层析载体实现。通过在波长(λ)为280nm处的吸收测量进行检测。
[0123]第二个层析步骤意在限制蛋白的可能的蛋白酶降解。
[0124]例如，在对从水性非脂相中获得的因子VII进行第一次层析步骤中，使用Q-Sepharose? FF胶型层析载体，在其上保留因子VII。为了获得中间纯度的因子VII的洗提液，使用基于0.05M Tris以及优选的0.020M到0.05M氯化钙的pH7.0到8.0的水性洗提缓冲液，该中间纯度即纯度为25%到75%。
[0125]FVII的洗提液可以进一步进行如前面所述的透析步骤，使用0.15到0.20M氯化钠溶液缓冲液。
[0126]第二次层析步骤可以在Q-Sepharose? FF胶型层析载体上进行，例如可以用于
对前一步骤获得的因子VII洗提液进行纯化，该洗提液可选的进行稀释以允许其能被再次吸收，因子VII被保留在载体上。使用基于优选的0.05M Tris以及优选的0.005M氯化钙的pH7.0到8.0的水性洗提缓冲液，以洗提因子VII的高纯部分，即纯度高于90%。
[0127]根据本发明的一个优选实施例，方法包括在两次阴离子交换层析步骤之后进行的第三次阴离子层析步骤。该步骤允许制备富含蛋白的合成物，以适用于医学应用。更优选的，所述第三次阴离子层析采用弱碱性层析载体。通过在波长(λ)为280nm处的吸收测量进行检测。
[0128]例如，将稀释后的第二次阴离子交换层析步骤获得的洗提液注入到到充满能保留因子VII的Q-Sepharose_? FF型载体的柱中。用组成为优选的0.02MTris和0.20-0.30M
氯化钠、PH6.5-7.5的水性缓冲液对保留在载体上的因子VII进行洗提。
[0129]因此，在阴离子交换胶上进行的三次层析步骤允许更进一步的纯化感兴趣的蛋白。此外，它们允许感兴趣蛋白的合成物的浓缩和配制。
[0130]根据本发明的一个优选实施例，当要纯化的感兴趣蛋白为凝血因子时，三个在阴离子交换剂载体上进行的层析步骤中的至少一个允许活化全部或部分凝血因子。有利的，第一次层析允许凝血因子的纯化。
[0131]最终的洗提液一经回收，对该洗提液可以进行在0.22 μ m过滤器上进行的过滤步骤、容器内的分装步骤，然后冷冻至_30°C并在该温度下保存。
[0132]本发明的方法也可包括下列步骤中的至少一个:配制、病毒灭活和灭菌。通常来说，方法可以包括在亲和层析之前进行的抗病毒处理步骤，有利的，该步骤使用导致包膜病毒失活的溶剂/洗涤剂进行，特别的含有Tween? 80 (l%w/v)和TnBP (tr1-n-磷酸丁酯)(0.3%v/v,)的混合物。 此外，对从第二次在阴离子交换柱上的层析步骤获得的洗提液优选地进行一次纳米过滤来有效地消除病毒，特别是非包膜病毒，例如细小病毒B19。使用ASAHIPLANOVAtmI5过滤器来截留大小大于15nm的病毒是可能的。
[0133]发明的其他方面和优势将通过以下例子进行描述，它们意在阐述而不是限制本发明的范围。
【具体实施方式】
[0134]下面的实施例阐述了利用本发明的提取和纯化方法，从转基因雌兔的奶中制备活化的因子VII (FVIIa)的浓缩物的应用(FVI1-tg:转基因FVII)。
[0135]从5个雌性Fl (初始谱系的第二代)的初乳中获得原奶。根据FVII抗原(FVI1:Ag)在乳分泌物中的比例选择雌性。STAGO (ASSERACHROM VII)允许从D04到D25 (D:产奶日)的初乳中追求人类VII的含量。对于雌性来说这一分泌相对稳定(188和844IU/ml之间的VII)，这依赖于雌性和采集天数。
[0136]例如，选择的纯化方法允许从500ml原奶中纯化12mg的FVII_tg。纯化的总产量是 22%。
[0137]根据非还原条件下进行的SDS-PAGE电泳分析，该浓缩物是纯净的。即双硫键被保留，且在还原条件下表现出重链和轻链的完全分裂。这导致在方法中完全转化成活化的FVII (FVIIa)。
[0138]实施例1:从奶中提取FVII
[0139]取500ml全原奶，用9倍体积的0.25M，pH8.2的磷酸钠缓冲液稀释。室温下搅拌30分钟后，富含FVII的水相在15°C下1000Og离心I小时(离心机Sorvall Evolution RC 一6700rpm —转子SLC-6000)。6罐约为835ml是必需的。
[0140]离心后，存在三个相:一脂相在表层(乳脂)，一非脂水性清澈富含FVII的相(主要相)以及一白色颗粒状固相(不溶性酪蛋白和钙化合物沉淀)。
[0141]含有FVII的非脂水相通过蠕动泵收集直至脂相。脂相单独回收。固相(沉淀)被去除。
[0142]然而，非脂水相仍然含有非常少量的脂质，其在一系列过滤器上过滤(PallSLK7002U010ZP 一孔径为I μ m的玻璃纤维预滤器一之后Pall SLK7002NXP 一孔径为
0.45 μ m的尼龙66)。在过滤的最后，脂相通过该过滤系列，其完全截留了奶中的脂肪球，滤出液是清澈的。
[0143]过滤过的非脂水相接着在超滤膜上进行透析(Millipore Biomax50kDa - 0.1m2)以使其适合层析阶段。分子量约为50kDa的FVII不滤过该膜，不像奶中的盐、糖以及肽。第一时间内，溶液(约5000ml)被浓缩到500ml,接着通过维持这个恒定体积的超滤膜透析可以去除电解质以及使该生物材料适于层析步骤。透析缓冲液是0.025M的磷酸钠缓冲液，pH8.2。
[0144]含有FVII的非脂水相可以被吸收到富含FVI1-tg的抗乳血清中。该制备物在后继处理前被保存于_30°C。
[0145]这步的FVII的总回收率非常令人满意:90% (用磷酸盐提取91 %+透析/浓缩99%)。
[0146]包含FVII的非脂水相在这步的最后完全清澈，并适于后续层析步骤。
[0147]大约93000IU的FVI1-tg在这一步被提取。在这一步制备中的FVII的纯度在0.2%的级别。
[0148]实施例2 =FVIIa的纯化方法
[0149]1.羟磷灰石胶上的层析
[0150]Amicon90柱(直径9cm —横截面64cm2)充满BioRad陶瓷羟磷灰石I型(CHT — I)胶。吸收测量在波长(X)为280nm处进行。
[0151]该胶用水性缓冲液A平衡，A包含0.025M磷酸钠和0.04氯化钠的混合物，pH8.0。存于-30°C的所有制备物用水浴在37°C解冻，直到冰块完全溶解，接着注入到胶上(直线流动速率100cm/h，即105ml/min)。未保留的部分利用含有0.025M磷酸钠和0.04M氯化钠、PH8.2的缓冲液的经过而去除，直到回到基线(RBL)。
[0152]含有FVI1-tg部分用含有0.25M磷酸钠和0.4M氯化钠的、pH8.0的缓冲液B实施洗提。洗提部分被收集，直到回到基线。
[0153]该层析可以回收超过90%的FVI1-tg，同时消除超过95%的乳蛋白。该特异活性(S.A.)增加了 25倍。在这一步，可获得约85000IU、纯度为4%的FVI1-tg。
[0154]2.1OOkDa切向讨滤以及50kDa浓缩/诱析
[0155]前一步骤中所有的洗提液在IOOkDa超滤膜(Pall OMEGA SClOOK - 0.1m2)的切向模式下过滤。FVII滤过IOOkDa的膜，同时分子量超过IOOkDa的蛋白不能滤过。
[0156]之后,滤过的部分被浓缩到约500ml,接着在50kDa的已在实施例1中描述了的超滤器上透析。透析缓冲液使用0.15M的氯化钠。[0157]在这阶段的处理中，产品在进行离子交换层析前被保存于_30°C。
[0158]这一阶段可以减少分子量超过IOOkDa蛋白的量，并且特别的是酶前体。在IOOkDa膜上的处理可以截留留约50%的蛋白，其中为高分子量蛋白，同时滤过95%的FVI1-tg，为82000IU 的 FVI1-tg。
[0159]该处理可以减少后续步骤中的蛋白酶水解的风险。
[0160]3.在Q-Sepharose? FF 胶上的层析
[0161]这连续三步在离子交换胶Q-Sepharose? Fast Flow (QSFF)上进行的层析是为
了纯化有效成分，以允许FVII活化为活化的FVII(FVIIa)，以及最终浓缩并制备为FVII合成物。对化合物的检测通过λ=280ηπι处的吸收测量而进行。
[0162]3^ Q-Sepharose? FFl 步一洗提《高钙》
[0163]一直径 2.6cm (横截面 5.3cm2)的柱用 100ml Q-Sepharose? FF 胶(GEHealthcare)填充。
[0164]该胶用0.05M, pH7.5的Tris缓冲液平衡。
[0165]保存于-30°C的整个部分在37°C水浴中解冻，直到所有冰块都溶解。在注入到胶之前(流速13ml/min，即直线速度150cm/h)，该部分用平衡缓冲液稀释到l/2[v/v]，未保留部分随后随缓冲液的通过去除，直到RBL。
[0166]具有低FVII含量的第一蛋白部分被0.05M的Tris和0.15M氯化钠、pH7.5的缓冲液以9ml/min (即100cm/h)洗提而被去除。
[0167]第二富含FVII的蛋白部分被0.05M的Tris和0.05M氯化钠和0.05M氯化钙、pH7.5的缓冲液以9ml/min (即100cm/h)洗提。检测通过λ =280nm处的吸收测量而进行
[0168]该第二部分在50kDa的在实施例1中已描述过的超滤器上进行透析。该透析缓冲液是0.15M氯化钠。该部分在第二次通过阴离子交换层析前在夜间被存储于+4°C。
[0169]这一步可以回收73%的FVII (即60000IU的FVI1-tg)，同时消除80%的结合蛋白。它同时允许FVII活化成FVIIa。
[0170]3^2 Q-Sepharose? FF2 步一洗提《低韩》
[0171]一直径2.5cm(横截面4.9cm2)的柱用 30ml Q-Sepharose? FF胶(GE Healthcare)填充。
[0172]该胶用0.05M, pH7.5的Tris缓冲液平衡。
[0173]之前存储于+4°C的洗提部分(第二部分)在注入到胶(9ml/min，即直线流速100cm/h)之前被稀释。
[0174]在注入第二部分后，该胶用平衡缓冲液冲洗以去除未保留的部分。
[0175]含有很高纯度FVII的部分被0.05M的Tris和0.05M氯化钠和0.005M氯化钙、pH7.5的缓冲液以4.5ml/min (即50cm/h)洗提。
[0176]约23000IU 的 FVI1-tg 被纯化，即 12mg 的 FVI1-tg。
[0177]这一步可以消除超过95 %的结合蛋白(雌兔奶中的蛋白)。
[0178] 该洗提液，纯度高于90%，表现出接近天然人类FVII分子的结构与功能特征。其在第三次通过离子交换层析时被浓缩和制备。[0179]3.3 O-Sepharose? FF3 步一《钠》洗提
[0180]一直径 2.5cm (横截面 4.9cm2)的柱用 IOml Q-Sepharose? FF 胶(GEHealthcare)填充。
[0181]该胶用0.05M，pH7.5的Tris缓冲液平衡。
[0182]前一步骤中洗提的、纯化的部分在注入到胶上(流速4.5ml/min，即直线速度50cm/h)前用注射用纯水(PWI)稀释五倍。
[0183]在注入所述部分后，该胶用平衡缓冲液冲洗以去除未保留的部分。
[0184]之后，FVI1-tg被0.02M的Tris和0.28M氯化钠、pH7.0的缓冲液以3ml/min (即36cm/h)洗提。
[0185]FVI1-tg浓缩物被制备，纯度高于95%。该产品适于静脉注射。该方法累积产量为22%，每升所使用的奶可以纯化至少20mg的FVII。
[0186]表A概括了按照本发明的一个优选实施例的处理步骤，并提供了在每一步后获得的产量，纯度以及比活性。
[0187]表A
[0188]
【权利要求】
1.提取存在于奶中的至少一种蛋白的方法，所述蛋白表现出与所述奶中复合的或非复合的钙离子的亲和性，包括如下步骤: a)通过将奶与可溶性盐接触产生钙化合物沉淀而释放蛋白，以通过这种方法获得蛋白富集的液相，该可溶性盐的阴离子选择具有在这种介质中形成不溶性钙化合物的能力的阴离子； b)将蛋白富集的液相与钙化合物沉淀分离，而且，所述液相被分离成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及 c)回收含有蛋白的水性非脂相。
2.根据权利要求1的方法，其中可溶性盐是磷酸盐。
3.根据权利要求2的方法，其中磷酸盐选自由磷酸钠、磷酸锂、磷酸钾、磷酸铷和磷酸铯组成的组，而特别的， 是磷酸钠。
4.根据权利要求1的方法，其中可溶性盐是碱金属草酸盐，特别是钠或钾的草酸盐，或碱金属碳酸盐，特别是钠或钾的碳酸盐，或上述的混合物。
5.根据权利要求1-4中任一的方法，其中可溶性盐在水溶液中的浓度在IOOmM到3M之间，更优选的，在200mM到500mM之间，特别的，在200mM到300mM之间。
6.根据权利要求1-5中任一的方法，其中步骤b)通过离心实现。
7.根据权利要求1-6中任一的方法，包括在步骤c)之后的用孔隙度逐渐减小的过滤器对水性非脂相连续过滤的步骤，孔隙度优选的为I μ m、接着是0.45 μ m,接着是浓缩步骤/超滤透析步骤。
8.根据权利要求1-7中任一的方法，其中对脂相用孔隙度逐渐减小的过滤器进行过滤，孔隙度优选为I μ m、接着是0.45 μ m。
9.根据权利要求1-8中任一的方法，其中蛋白是非自然存在于奶中的蛋白。
10.根据权利要求1-9中任一的方法，其中奶是转基因非人类哺乳动物奶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中哺乳动物选自雌性的兔、绵羊、山羊、牛、猪和鼠。
12.根据权利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是凝血蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其中蛋白选自由因子I1、因子VI1、因子IX、因子X、以及它们的活化形式、蛋白C、活化蛋白C、蛋白S和蛋白Z组成的组，或者是上述的混合物。
14.根据权利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是含有GLA域、EGF域(类表皮生长因子)或者具有固定钙离子能力的另外的域。
15.根据权利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是维生素K依赖性蛋白。
16.根据权利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是钙依赖蛋白。
17.根据权利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白选自由因子珊、α-l抗胰蛋白酶因子、抗凝血酶II1、白蛋白、纤维蛋白原、胰岛素、髓鞘碱性蛋白、胰岛素原、纤溶酶原组织激活剂和抗体组成的组，或者上述的混合物。
18.根据权利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是转基因乳铁蛋白、乳球蛋白、溶菌酶和/或乳清蛋白。
19.奶中的水性非脂相，其特征在于其是高盐、碱性的，且含有可溶性酪蛋白和至少一种另外的蛋白，易于通过权利要求1-18中任一所述的方法获得。
20.根据权利要求1-18任一所述的方法，其中在步骤c)之后进行亲和层析步骤d)，用基于磷酸盐的缓冲液以预定的浓度对蛋白进行洗提。
21.根据权利要求20所述的方法，其中亲和层析在载体为羟磷灰石胶(Ca10(PO4)6(OH)2)或者氟磷灰石(Caltl(PO4)6F2)胶的层析柱上实施。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，对步骤d)中获得的洗提液进行切向过滤。
23.根据权利要求1-18任一所述的方法，包括在步骤c)之后直接进行的至少一步离子交换层析，且特别的，是两步连续的离子交换层析。
24.根据权利要求23所述的方法，其中至少一步和两步层析是阴离子交换层析。
25.根据权利要求24所述的方法，包括在两步阴离子交换层析之后的第三次阴离子交换层析步骤。
26.根据权利要求20-25中任一所述的方法，包括在亲和层析之前的通过溶剂/洗涤剂进行的抗病毒处理步骤。
27.根据权利要求23-25中任一所述的方法，其中对从第二次阴离子交换层析步骤获得的洗提液进行纳米过滤步骤。
【文档编号】C07K1/22GK103910779SQ201410138470
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2007年5月31日 优先权日:2006年5月31日
【发明者】阿兰·勒雅尔, 米歇尔·诺格雷, 米歇尔·泰利耶 申请人:Lfb生物科技公司