一种用于创面修复的环二肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明所属生物医药领域，特别是一种用于创面修复的环二肽。
【背景技术】
[0002] 2, 5-二酮哌嗪类化合物（DKP)，又称环二肽。该类化合物是由两个氨基酸通过肽 键缩合环合而形成的，是自然界中存在最小的环肽类化合物，并且广泛存在于自然界，在 人、脊椎动物、无脊椎动物、细菌和真菌中均有发现。2, 5-二酮哌嗪类化合物拥有两个氢键 给体和两个氢键受体，因为氢键是受体与药物相互作用的主要方式之一，因而DKP的六元 环在药物化学中是一个重要的药效团，已经发现的许多有活性的天然产物中含有DKP的六 元环结构，具有多种生物活性如广谱抗菌活性、抗肿瘤活性、调节免疫能力（刘友涛.几种 2, 5-二酮哌嗪类化合物的合成及其生物活性研究.2011)。本发明的发明人以丙氨酸、甘氨 酸、亮氨酸为原料合成的环二肽不仅具有广谱的抗菌活性、抗肿瘤活性、调节免疫功能，还 发现了创面修复的功能。
[0003] 创面是正常皮肤组织在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温 以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤组织完整性的 破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤组织的正常功能受损。常见的创面有烧烫伤、 溃疡、擦伤等。大范围、深度的创面为外界的致病菌提供了一个类似营养基的场所，这也是 创面容易感染的原因。而环二肽是由两个氨基酸残基通过肽键连接形成的肽在经过缩合成 环状的最小的环肽，在体内可被二肽酶水解而成两个游离氨基酸。在体内肠粘膜细胞上存 在着吸收二肽的耗能主动运转体系，因此二肽比氨基酸更易于被吸收。将具有一定生理活 性的环二肽应用到创面中，可以有目的的降低创面的感染，提高机体的自身免疫能力，在外 界与机体的双重作用下对创面进行修复。
[0004] 未见以丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸为原料合成的环二肽在创面修复中的应用的报道 出现。
【发明内容】
[0005] 针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于创面修复的环二肽。
[0006] 本发明所述的环二肽为环丙-甘二肽（ala-gly)、环丙-亮二肽（ala-leu)的中的 任意一种。
[0007] 本发明所述的环二肽的制备方法为：
[0008] 1.氨基酸的甲酯盐酸盐的制备：向适量甲醇与二氯亚砜的混合液中加入适量的 氨基酸，在室温下搅拌。TLC跟踪反应完成，减压旋干溶剂，得到氨基酸的甲酯盐酸盐。
[0009] 2.中和缩合：取进行Boc氨基保护的丙氨酸与氨基酸的甲酯盐酸盐在含有 THF(四氢呋喃）、吡陡、（Boc)20、DMAP (催化剂）的条件下进行中和缩合反应得到N-叔丁 氧羰基-丙氨酰氨基酸甲酯；
[0010] 3.脱保护：在EtoAc (乙酸乙酯）和HC1的饱和溶液的作用下对步骤2中得到的 N-叔丁氧羰基-丙氨酰氨基酸甲酯进行氨基脱保护处理，得到丙氨酰氨基酸甲酯；
[0011] 4.环化：将步骤3中得到的丙氨酰氨基酸甲酯与甲醇混合，用NaHC03调节pH后， 加热回流18-22小时，过滤，柱层析纯化，得到所述的环二肽。
[0012] 本发明所述的环二肽的制备方法，其中步骤1中所述的氨基酸为甘氨酸、亮氨酸 中的任意一种。
[0013] 有益效果：本发明所述的环二肽通过小鼠烧烫伤实验与小鼠溃疡实验，结果显示 本发明所述的环二肽具有良好的创面修复作用，且具有治疗效果明显，创面愈合速度快、疤 痕浅等优点。
【具体实施方式】
[0014] 以下是结合具体试验对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。
[0015] 实施例1本发明中所述的环二肽（环丙-甘二肽）的制备方法
[0016] 主要药品试剂：甘氨酸、经Boc氨基保护的丙氨酸
[0017] 制备环ala-gly二肽的过程：
[0018] (1)甘氨酸甲酯盐酸盐的制备：向适量甲醇与二氯亚砜的混合液中加入甘氨酸 l〇g，在室温下搅拌20h。TLC跟踪反应完成，减压旋干溶剂，得到甘氨酸甲酯盐酸盐13. 91g。
[0019] (2)中和缩合反应：向100ml无水四氢呋喃中加入步骤⑴中得到的甘氨酸甲酯 盐酸盐、经Boc氨基保护的丙氨酸20g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合后， 在氩气的保护下加入无水四氢呋喃的（Boc)20,室温下搅拌10小时。TLC跟踪反应完成，柱 层析纯化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶剂得到N-叔丁氧羰基-丙氨酰甘氨酸甲酯固 体 22. 97g。
[0020] (3)Boc保护氨基脱保护处理：取步骤（2)中得到的N-叔丁氧羰基-丙氨酰甘氨 酸甲酯，加入乙酸乙酯盐酸（HCl/EtOAc)的饱和溶液2. 5L，冰水浴下搅拌1. 5h，冰水浴中减 压蒸掉溶剂，以甲醇-乙醚重结晶得丙氨酰甘氨酸甲酯固体20. 78g。
[0021] (4)环丙-甘二肽的制备：将步骤（3)中得到的丙氨酰甘氨酸甲酯加入到0. 9L甲 醇中，用NaHC03调节pH为7-8,加热回流18h，过滤，柱层析纯化（乙酸乙酯：甲醇=2:1)， 最后得到环丙-甘二肽固体13. 88g。
[0022] 实施例2本发明中所述的环二肽（环丙-亮二肽）的制备方法
[0023] 主要药品试剂：亮氨酸、经Boc氨基保护的丙氨酸
[0024] 制备环ala-leu二肽的过程：
[0025] (1)亮氨酸甲酯盐酸盐的制备：向适量甲醇与二氯亚砜的混合液中加入亮氨酸 l〇g，在室温下搅拌24h。TLC跟踪反应完成，减压旋干溶剂，得到亮氨酸甲酯盐酸盐14. 34g。
[0026] (2)中和缩合反应：向100ml无水四氢呋喃中加入步骤（1)中得到的亮氨酸甲酯 盐酸盐、经Boc氨基保护的丙氨酸20g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合后， 在氩气的保护下加入无水四氢呋喃的（Boc)20,室温下搅拌12小时。TLC跟踪反应完成，柱 层析纯化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶剂得到N-叔丁氧羰基-丙氨酰亮氨酸甲酯固 体 24. 55g。
[0027] (3)Boc保护氨基脱保护处理：取步骤（2)中得到的N-叔丁氧羰基-丙氨酰亮氨 酸甲酯，加入乙酸乙酯盐酸（HCl/EtOAc)的饱和溶液2. 5L，冰水浴下搅拌2h，冰水浴中减压 蒸掉溶剂，以甲醇-乙醚重结晶得丙氨酰亮氨酸甲酯固体22. 15g。
[0028] (4)环丙-亮二肽的制备：将步骤（3)中得到的丙氨酰亮氨酸甲酯加入到1. 2L甲 醇中，用NaHC03调节pH为7-8,加热回流18h，过滤，柱层析纯化（乙酸乙酯：甲醇=2:1)， 最后得到固体环丙-亮二肽（ala-leu) 15. 19g。
[0029] 以下通过实验对上述实施例1-2制备的环二肽做进一步的应用说明。
[0030] 实施例3本发明所述的环二肽在溃疡中的应用
[0031] 1、实验材料
[0032] 1. 1样品：按实施例1-2制得样品：环丙-甘二肽（ala-gly)、环丙-亮二肽 (ala-leu)
[0033] 1. 2实验动物：KM小鼠，18~22g，120只，雌雄各半。SD大鼠，200~220g，180只， 雌雄各半。
[0034] 1. 3实验试剂：盐酸雷尼替丁胶囊、达喜（铝碳酸镁片）
[0035] 2、样品对胃溃疡粘膜的保护功能评价方法
[0036] 2. 1无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤模型试验
[0037] 40只KM小鼠按性别与体重随机分组（详见表1)，各组给予相应的药物，各组小鼠 给药连续10天，第9天给药后禁食24h，自由饮水。每组的小鼠在末次给药3h后，所有小鼠 给予0. 2ml无水乙醇进行灌胃，1小时后处死动物，结扎幽门，1%甲醛固定，观察并评定溃 疡指数（标准：条索状损伤的长度大于1mm者，测定其长度，每毫米计1分，其宽度大于1mm 者计分加倍，长度与宽度均小于1mm，计0.5分，将计分相加即为该鼠的溃疡指数）并计算溃 疡抑制百分率。重复试验3次。
[0038] 2. 2乙酸致大鼠慢性胃溃疡模型试验
[0039] 除假手术组（12只），其余大鼠采用10 %醋酸按0. 05ml/只平刺于胃浆膜下 0. 4-0. 5_造模。术后造模大鼠进一步分组（详见表2)，并于第2日开始给药，每日1次， 各组给药14天，末日给药后禁食禁水一夜后处死动物。以游标卡尺测定溃疡最大长径及垂 直于最大长径的最大宽径。计算溃疡指数（溃疡指数=溃疡最大长径X垂直于最大长径 的最大宽径）及溃疡抑制率。重复试验3次。
[0040] 3、样品对胃溃疡粘膜的保护功能评价结果
[0041] 3. 1样品对无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤的影响
[0042] 表1样品对无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤的影响（f 土S)(第一次）
[0043]
[0044] 注：*:P〈0. 001与对照组比较；# :P〈0. 05与阳性组比较
[0045] 结果显示，与对照组比较，实施例1-2制备的环二肽均可使无水乙醇致小鼠胃粘 膜损伤的溃疡指数明显降低，具有统计学意义（p〈0.001);与阳性组（雷尼替丁）比较，实 施例1-2制备的环二肽在溃疡指数的抑制效果上明显高于雷尼替丁的