专利名称：前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物资源和基因工程领域，具体涉及前体肽基团突变产生环噻唑霉素类似物及其方法和用途。
背景技术：
抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或者高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或者其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。20世纪40年代，青霉素应用于临床标志着抗生素的诞生。自 1拟8年Alexander Fleming发现第一个抗生素——青霉素以来，科学家已经发现了近万种抗生素，它们中的绝大多数都是毒性太大，不适合作为治疗人类和牲畜传染病的药品，不过临床应用的抗生素已有达近百种之多，有些能够抑制微生物的生长，有些能够抑制寄生虫的繁殖，有些能够用来除草，有些能够用来治疗心血管疾病，还有些能够抑制人体免疫反应，用作人体器官移植手术中，所以，正是由于抗生素的存在，使得人类能够战胜了一次次的感染性疾病，保持健康。20世纪60年代末，伴随着抗生素和疫苗在全球范围内的快速普及与发展，感染性疾病逐渐被人类控制住，到1988年时，感染性疾病甚至被控制在美国死亡率最高的10大疾病之外。然而，也从那时起，随着抗生素的滥用，抗生素耐药问题逐渐呈现在人类面前，但是当时这些问题被未被人类所重视，这直接导致感染性疾病卷土从来，成为死亡率第三高的疾病，更令人恐怖的是滥用和错用抗生素导致的抗生素耐药性催生了 “超级细菌”，即所有已经的抗生素都对其无效。目前，抗生素耐药性已经成为了“全球威胁”，这也更加促进了人类对新型抗生素的研究与发展，尤其是抗高耐药性致病菌的抗生素新药的研究承担着拯救人类的责任。在众多新型抗生素之中，硫肽类抗生素凭借着十分独特的结构特征已经极富潜力的应用价值，受到了包括各国科学家在内的全世界人民的广泛关注。硫肽类抗生素是一类源于微生物，富含硫元素、结构被高度修饰的重要天然产物， 到目前为止，已经发现80余种。尽管它们存在着整体上的结构差异，但是它们共同具有典型的结构特征(1)硫肽类抗生素都富含经高度修饰且含有硫的环形(macrocyclic)多肽；(2)在空间结构的中心位置上是一个被三位或者四位噻唑环取代的含氮杂环(如吡啶 pyridine和脱水哌啶dehydrapiperidine) ； (3)在这个中心杂环的周围分布着众多个被修饰过的异分子环状氨基酸残基(heterocyclic residues)，其中包括噻唑(thiazoles)， 噁唑(oxazoles)，和脱氢氨基酸(dehydroamino acids) [Chem Rev (2005) 105，685-714]。 除了这些诸多的结构共性之外，大多数硫肽类抗生素在生物活性方面也有着共同的特点 (1)硫肽类抗生素在医药与农业方面有广泛的应用价值，硫链丝菌素(thiostr印ton)能够抑制核糖体合成蛋白[J Mol Biol (1998) 276，391-404]，还能诱导TipA蛋白的大量合成[J Bacteriol (1989) 171，1459-1466] ； (2)环噻唑霉素(cyclothiazomycin)则是一种具有潜在应用前景的肾素抑制剂(renin inhibitor)，与此同时对水稻胡麻等农作物致病真菌也有抑制杀菌的作用[J Antibiot (1991) 44, 582-8 ；Bioorg Med Chem(2006) 14,8259-70] ； (3)在已经的硫肽类抗生素中有相当多的抗生素对各种高耐药性致病菌 tt ^ W Φ M # ffl， 1MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,)， PRSP(penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae)禾口VRE(vancomycin-resistant enterococci) [Chem Rev (2005) 105,685-714 ；Chem Biol (2009) 16，141-147]。这特点极大地激发了各国科学家对硫肽类抗生素的研究热情，使得科学家对能研制出抗高耐药性致病菌株的新药充满信心。近些年来，全球的科学家一直在关于硫肽类抗生素的一系列有趣的问题，包括普通的氨基酸残基是通过哪些酶的哪种生化反应形成如此复杂的空间结构的，又是如何呈现出如此不同的生物活性的。有机化学家立志于通过有机人工合成的方法在体外合成之中高修饰的多肽[Angew Chem Int Ed Engl Q007) 46，7930-7卯4]，而生物学家对于硫肽类抗生素的研究也在09年开始有重大突破性进展。国内外几个实验室几乎同时钓取了硫肽类抗生素生物合成基因簇，实现了零的突破。此类抗生素的生物合成机制正在被一步步地揭开。 随着基因组测序技术的不断发展，我们相信硫肽类抗生素的研究将不断地深入，揭开困扰着科学家的诸多问题的谜底，从而为人类研制出新型的抗高耐药性致病菌株的新药奠定了扎实的基础。环噻唑霉素(Cyclothiazomycin，CLT)于1991 年由日本科学家从 Sti^ptomyces sp.NR0516分离得到[J Antibiot (1991) 44，582-8]，在硫肽类抗生素之中算是发现时间较晚的抗生素。它是一种成桥状的多环硫肽类抗生素，体外毒理实验显示其具有抑制人类细胞高血压蛋白酶原(human plasma renin)活性，IC50 = 1. 7mM。从分子结构上相比较与其他硫肽类抗生素，它具有众多结构上的独特性(1)唯一拥有三环结构的硫肽类抗生素； (2)拥有非2，3-位噻唑取代的中心吡啶环；(3)游离的羧基端因为硫醚键的存在而呈现出半游离状态，分子内并非都是硫肽中普遍存在的噻唑环，而是包含了 3个噻唑环和3个噻唑啉；(4)拥有叔碳位上的一个硫醚键。正是由于环噻唑霉素拥有三环结构以及含有多个噻唑环或者噻唑啉，使得其溶解性较低，给科学家解析其空间结构带来了巨大的挑战。2006 年，日本科学家通过NMR的方法成功地描述出环噻唑霉素的立体结构，并且发酵产物中分离出了两种不同构象的环噻唑霉素的衍生异构物Bl和B2，他们发现这两种衍生异构物在固体状态下非常的稳定，但是在溶液中能够相互转化，只是转化速度非常的缓慢[Bioorg Med Chem (2006) 14，8259-70]。并且，他们还发现，环噻唑霉素是一种RNA聚合酶的抑制剂 [Bioorg Med Chem(2006) 14,8259-70] 0此外，由于环噻唑霉素的结构特殊性，结构化学家对于体外合成类似的分子也产生了浓厚的兴趣[Org Lett 0004)6 :3401-4]。2009年，上海交通大学王绛博士从吸水链霉菌应城变种10-22基因组文库中成功地钓到阳性的柯丝质粒(cosmid)，其中包含着一小段DNA序列编码60aa的一个多肽， 其中C端的ISaa的序列与环噻唑霉素的结构氨基酸序列完全一致，并且通过后续的生物活性测试以及LC-EI-Q-TOF分子量检测分析和MS/MS碎片分析都能证明5102-11抗生素就是环噻唑霉素。此外，通过构建多个异源表达载体，首次在链霉菌模式菌株变铅青链霉菌(Sti^ptomyces lividans) 13 中成功实现硫肽类抗生素的异源表达，并且通过不同的 ORF组合定位了一个完整的环噻唑霉素生物合成基因簇，包含了 15个ORFs、长度为22. 7kb 的DNA序列，通过生物信息学分析表明其中唯一的结构基因cltA编码产生环噻唑霉素的前体，这个前体多肽通过基因簇中所表达的其他蛋白进行翻译后修饰，最后成熟后被释放到细胞外部[AEM (2010) p. 2335-2344]。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种前体基团突变产生环噻唑霉素类似物及其方法和用途。本发明是一种利用点突变和异源表达获得新型环噻唑霉素类似物的方法及其应用；通过选择点突变了环噻唑霉素前体肽7个位点的氨基酸残基，然后通过在链霉菌的模式菌株变铅青链霉菌Mi^ptomyces lividans 13 中的异源表达，获得了 14个突变株，产生了 23种新型环噻唑霉素类似物，其中，有6个突变株的产物对玉米小斑 (Bipolaris maydis)的生长有抑制作用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明涉及一种前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，是通过以下方法获得的通过在环噻唑霉素前体肽基因cltA内插入两个BglII和SpeI限制性内切酶的酶切位点；用突变引物与双酶切产物相连接构建来实现原位点突变环噻唑霉素前体肽基因cltA ； 然后通过在链霉菌的模式中的异源表达获得环噻唑霉素类似物。优选的，所述在环噻唑霉素前体肽基因cltA内插入两个BglII和SpeI限制性内切酶的酶切位点的方法，具体包括如下步骤(1)选用pMD-18T载体，与PCR扩增出来含有环噻唑霉素前体肽基因cltA的部分环噻唑霉素基因簇的31Λ片段相连接，PCR扩增产生的片段两端含有限制性内切酶SnaBI和 SacI酶切位点，切下再与PJTU4892相连接；(2)通过PCR-Targeting的方法将质粒pJTU4892中的aac (3) IV阿泊拉霉素抗性基因替换成neo卡那霉素抗性基因，得到质粒PJTU4895 ；(3)用限制性内切酶SnaBI和SacI从含有BglII和SpeI识别位点的重组质粒PMD-18T-31A切下31Λ的片段，与用限制性内切酶SnaBI和McI酶切处理过的载体 PJTU4895相连接，转化大肠杆菌DH10B，获得还有限制性内切酶BglII和SpeI识别位点的质粒 PJTU4896 ；(4)用XbaI和EcoRI酶切处理ρJTU4896的片段与用XbaI和EcoRI酶切处理 PSET152的片段连接构建得到质粒PJTU4897，该质粒pJTU4897含有aac (3) IV阿泊拉霉素抗性基因，并且含有限制性内切酶BglII和SpeI识别位点。优选的，所述原位点突变环噻唑霉素前体肽基因cltA具体为突变了环噻唑霉素前体肽基因的7个位点中任一位点或两位点的氨基酸残基，所述7个位点为C3、T4、S5、T6、 G7、T8 禾口 P9 位。优选的，所述异源表达是在链霉菌的模式菌株变铅青链霉菌Mi^ptomyces lividans 1326中的异源表达。优选的，所述环噻唑霉素类似物对应的突变株为C3S、T4D、T6D、T6V、T6G、T6S、T6C、 G7A、G7S、T8D、T8S、P9H、P9A 或 T68D。优选的，所述环噻唑霉素类似物对应的突变株为T6D，T6S，T6V，T6G，T8S或P9A。优选的，所述环噻唑霉素类似物对应的突变株为T6S，T6V，T6G或T8S。优选的，所述环噻唑霉素类似物的结构式为式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)或式 (V)所示，
权利要求
1.一种前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，其特征在于，是通过包括以下步骤的方法获得的在环噻唑霉素前体肽基因cltA内插入两个BglII和SpeI限制性内切酶的酶切位点；用突变引物与双酶切产物相连接构建来实现原位点突变环噻唑霉素前体肽基因 cltA;然后通过在链霉菌的模式中的异源表达获得环噻唑霉素类似物。
2.根据权利要求1所述的前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，其特征在于，所述在环噻唑霉素前体肽基因cltA内插入两个BglII和SpeI限制性内切酶的酶切位点的方法，具体包括如下步骤(1)选用PMD-18T载体，与PCR扩增出来含有环噻唑霉素前体肽基因cltA的部分环噻唑霉素基因簇的31Λ片段相连接，PCR扩增产生的片段两端含有限制性内切酶SnaBI和 SacI酶切位点，切下再与PJTU4892相连接；(2)通过PCR-Targeting的方法将质粒pJTU4892中的aac(3) IV阿泊拉霉素抗性基因替换成neo卡那霉素抗性基因，得到质粒PJTU4895 ；(3)用限制性内切酶SnaBI和McI从含有BglII和SpeI识别位点的重组质粒 pMD-18T-3kb切下31Λ的片段，与用限制性内切酶SnaBI和McI酶切处理过的载体 PJTU4895相连接，转化大肠杆菌DH10B，获得还有限制性内切酶BglII和SpeI识别位点的质粒 PJTU4896 ；(4)用XbaI和EcoRI酶切处理pJTU4896的片段与用XbaI和EcoRI酶切处理pSET152 的片段连接构建得到质粒PJTU4897，该质粒pJTU4897含有aac C3) IV阿泊拉霉素抗性基因， 并且含有限制性内切酶BglII和SpeI识别位点。
3.根据权利要求1所述的前体肽基团突变产生的环噻唑霉素抗生素类似物，其特征在于，所述原位点突变环噻唑霉素前体肽基因cltA具体为突变了环噻唑霉素前体肽基因的7 个位点中任一位点或两位点的氨基酸残基，所述7个位点为C3、T4、S5、T6、G7、T8和P9位。
4.根据权利要求1所述的前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，其特征在于，所述异源表达是在链霉菌的模式菌株变铅青链霉菌Mi^ptomyces lividans 13 中的异源表达。
5.根据权利要求1所述的前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，其特征在于，所述环噻唑霉素类似物对应的突变株为C3S、I^D、T6D、T6V、T6G、T6S、T6C、G7A、G7S、T8D、T8S、 P9H、P9A 或 T68D。
6.根据权利要求5所述的前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，其特征在于，所述环噻唑霉素类似物对应的突变株为T6D，T6S，T6V，T6G，T8S或P9A。
7.根据权利要求6所述的前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，其特征在于，所述环噻唑霉素类似物对应的突变株为T6S，T6V，T6G或T8S。
8.根据权利要求7所述的前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物，其特征在于，所述环噻唑霉素类似物的结构式为式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)所示，
9.权利要求6所述的环噻唑霉素类似物在制备抑制玉米小斑生长的抑制剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的制备抑制玉米小斑生长的抑制剂中的用途，其特征在于所述抑制剂采用的环噻唑霉素类似物对应的突变株为T6S，T6V，T6G或T8S。
全文摘要
本发明涉及一种前体肽基团突变产生的环噻唑霉素类似物及其用途。本发明选择点突变了环噻唑霉素前体肽7个位点的氨基酸残基，然后通过在链霉菌的模式菌株变铅青链霉菌Streptomyces lividans 1326中的异源表达，获得了14个突变株，产生了23种新型环噻唑霉素类似物抗生素，其中，有6个突变株的产物对玉米小斑(Bipolaris maydis)的生长有抑制作用。与现有技术相比，本发明不仅让构建突变株过程变得快速有效，能获得随机突变株，而且通过环噻唑霉素突变株生成的产物，能进行生物合成机制的研究，给硫肽类抗生素生物合成机制的研究提供了更加丰富的方法和手段。最重要的是，获得的众多新型的硫肽类抗生素，为人工设计合成新型硫肽类抗生素开辟了道路。
文档编号A01P21/00GK102532275SQ20111032465
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者殷俊, 邓子新, 邬益鸣, 黄曦 申请人:上海交通大学