专利名称：基于组合方式产生多价重组抗原的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域和生产抗病原生物体的多价疫苗领域。本发明的一个实施方式具体地提供了一些方法和组合物，所述方法和组合物提供了能用于生产一群多价疫苗的异形核丝状真菌内的一群编码抗原的核苷酸序列。
背景技术：
目前可以用多种方法生产疫苗。通常用受精的鸡卵生产流感疫苗。在美国，疾病控制中心会选择出三种被认为能代表最可能在特定流感季节内流行的病毒的病毒株。将所选病毒的样品提供给生产商，作为种病毒母液(seed virus stock)，其具有所需的抗原特征。将种病毒注射到受精的鸡卵内。孵育鸡卵，同时复制流感病毒。在一段合适的时间之后，打开鸡卵并收集蛋白。蛋白样品内含有病毒。从鸡卵中纯化出病毒并灭活。然后组合各个病毒母液产生常用的流感病毒疫苗，所述疫苗通常是三价疫苗。
其中可能发生各种能影响整个批次疫苗的问题。例如，无菌问题使得Chiron疫苗生产设备在2004年被吊销执照。这种情况表明传统的疫苗生产方法是如何不可靠。此外，目前的流感疫苗生产方法每年都使用了数亿个鸡卵。储存、处理和加工步骤都是费时的和劳动密集的。另外，因为其较长的生产周期，如果一种新的流感病毒株在流感季节成为了主要的病毒株，那么目前基于鸡卵的生产方法将花费数个月来产生新的疫苗。
因为这些局限性，非常需要一种更为可变通的和有效的生产抗原物质例如流感疫苗的方法。
重组真菌表达蛋白质已经利用异源基因在真菌中的克隆和表达产生了各种有用的蛋白。例如Lambowitz的美国专利No.4,486,533描述了经线粒体质粒DNA自主复制丝状真菌的DNA载体以及往链孢霉菌内引入并表达异源基因。Yelton等的美国专利No.4,816,405描述了能够修饰丝状子囊菌的重要菌株使得其产生并分泌大量所需的异源蛋白的工具和系统。Buxton等美国专利No.4,885,249描述了含有能被整合到宿主黑曲霉细胞内的选择标记物的DNA载体对黑曲霉的转化。McKnight等的美国专利NO.4,935,349描述了一种用于在曲霉中表达更高等的真核基因的方法，其涉及能指导在曲霉和其它丝状真菌中表达异源基因的启动子。相似的技术已经被用于克隆出粗糙链孢霉(“Neurospora crassa”)的与氨基酸转运有关的mtr基因，以及被用于验证所克隆的DNA在体内与位于该基因侧面的基因组标记物的紧密连接。Stuart，W.D.et al.，Genome(1988.)30198-203；Koo，K.and Stuart，W.D.Genome(1991)34644-651。
丝状真菌具有多个使得它们成为用于产生真核蛋白的优秀候选者的特点。丝状真菌能分泌复杂的蛋白；正确折叠三维蛋白，包括形成二硫键；在翻译之后蛋白水解地剪切蛋白；以及用N连接的和O连接的糖基化反应使蛋白糖基化。这些能力使得该组微生物成为生产分泌型重组蛋白的吸引人的宿主(MacKenzie，D.A.et al.，J Gen Microbial(1993)1392295-2307；Peberdy，J.F.，Trends in BioTechnology(1994)1250-57)。
粗糙链孢霉已经被用作产生重组的同源和异源蛋白的宿主细胞(Carattoli，A.，et al.，Proc Nat Acad Sci USA5(199S)926612-6616；Yamashita，R.A.et al.，Fungal Genetics Newsletter(1995 Suppl.)42A；Kato.E.et al.，Fungal Genetics Newsletter(1995 Suppl.)42A；Buczynski，S.et al.Fungal Genetics Newsletter(1995 Suppl.)42A；Nakano，E.T.et al.FungalGenetics Newsletter(1995 Suppl.)40540)。另外，粗糙链孢霉已经被用作通过异核体方式表达重组的异二聚体和多聚体蛋白的宿主细胞，美国专利5,643,745，1997年7月，Stuart435/69.1。
发明内容
本发明提供了生产多价疫苗的异核体丝状真菌。
通过融合第一种和第二种亲代真菌菌株，且对于三价疫苗而言，还融合了第三种亲代菌株，以及对于更高价的疫苗，还为每一附加的抗原都添加了一种亲代菌株，由此产生了本发明的各个异核体，其中各亲代菌株含有保持异核体状态所必需的标记物以及一表达单元，所述表达单元编码多价疫苗的抗原的天然存在的变体、多价疫苗的抗原的经合理设计的变体、或多价疫苗的抗原的随机产生的变体。因此，除了天然变体以外，可以通过化学的、物理的或定点诱变技术或其它技术产生变体。
本发明的异核体能用于选择性地生产所需的给定抗原的多价疫苗。
综上所述，本发明提供了生产多价疫苗的变体的异核体。
图1显示了合成血凝素0(HA0)基因(A/NewCaledonial/20/1999/H1N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及用于真菌表达的概念性翻译(conceptual translation)。下划线显示出起始密码子。
图2显示了合成血凝素0(HA0)基因编码的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。粗体字显示了真菌的信号序列。
图3显示了合成血凝素(HA)基因(A/Vietnam/1194/2004/H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。下划线显示出起始密码子。
图4显示了合成血凝素(HA)基因编码的氨基酸序列(SEQ IDNO4)。粗体字显示真菌的信号序列。
图5显示了合成M1基质蛋白(A/Vietnam/I 194/2004/H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。下划线显示出起始密码子。
图6显示了M1基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
图7显示了对粗糙链孢霉表达的HAO的western印迹检测。用SDS分离来自菌株HAO5和HAO8的经2天摇瓶培养的培养基以及未转化的对照(C)、50ng及200ng对照HA(A/New Caldonia 20/99，ProteinSciences)，并将其印迹到硝基纤维素膜上。利用山羊多克隆的抗HA(H1N1)抗体(BioDesign)以及随后的抗山羊Ig-碱性磷酸酶缀合物和比色法检测血凝素。
图8显示了经考马斯亮蓝染色的来自HAO5和HAO8的经2天摇瓶培养的培养基的凝胶。在这些条件下，2天摇瓶培养产生了相当少量的分泌蛋白。
图9显示了HAO5的静止培养表达。对来自HAO5的经6天静止培养的培养基的western印迹。如图7所示的检测HA蛋白。在整个试验中，可检测到的主要条带位于约57kDa(根据氨基酸组成预计的大小)，对照HA蛋白(C)为72kDa。
发明详述“异核体”(或异形核细胞)是通过两种(或更多种)丝状真菌亲代菌株的融合所形成的细胞，每个异核体细胞因此都含有两个(或更多个)遗传上有所不同的细胞核。异核体含有亲代菌株的细胞核，所述亲代菌株通常都是所有异核体相容性等位基因的纯合子(除了当存在tol基因时的交配型等位基因(mating type allele))。已经鉴定出至少十个异核体不相容性的染色体位点het-c、het-d、het-e、het-i、het-5、het-6、het-7、het-8、het-9和het-10，推测还存在着更多的位点。见Peris et al.，″Chromosomal Loci of Neurospora crassa″，Microbiological Reviews(1982)46426-570中的第478页。
本发明通过提供用于利用异形核丝状真菌生产一群多价疫苗的方法和组合物拓展了美国专利5,643,745、5,683,899和6,268,140所述的工作。能用这些方法和组合物发现并生产多价疫苗，例如抗病毒疫苗、抗细菌疫苗和抗真菌疫苗。
优选实施方式本发明提供了用于产生一群多价疫苗的新方法和组合物。通过给定抗原的有序或随机组合产生多价疫苗。为了得到多价疫苗，在本方法中得到了异核体，其包括步骤将编码多价疫苗的给定抗原的第一群DNA分子、第二群DNA分子、以及有时还将第三群或更多群DNA分子引入到第一种、第二种、以及有时是第三种或更多种真菌亲代宿主内，利用第一种、第二种、以及有时还利用第三种或更多种亲代真菌宿主产生了异核体真菌株；然后如果合适，在能表达编码亚基的DNA的条件下培养所形成的异核体，并且进一步地筛选出所形成的能生产具有所需性能的多价疫苗的异核体。下面详细地描述了每个部分，即真菌亲代菌株、DNA分子和融合方法。
丝状真菌的性质以及异核体形成的背景要求真菌可以以单个的单个核细胞的形式存在，所述单个核细胞生长成丝状的多个核的菌丝、酵母细胞、具有多个孢子的子实体、和/或有性分化的细胞。它们也可以以多个核的形式存在。真菌如霉菌的生长形式的基本元件是菌丝，其为一种分支的管状结构，直径约为2μm到10μm。菌丝是通过其顶端的延长(顶端生长)和通过侧支的形成进行生长。因此，当菌落生长时，其菌丝会形成缠绕着的丝的块。
一些菌丝渗透到培养基内，真菌从中吸收营养物并生长于其中，同时这些菌丝会突出到培养基的表面，形成了“气生菌丝体”。大多数菌落都生长于液体的或固体的培养基内，形成不规则的、干燥的、丝状的团(mats)。在大多数物种中，菌丝被称作“隔(septa)”的横壁分割开来。但是，这些隔都有着细微的、中央的细孔。因此，甚至有隔菌丝都具有包埋于连续的细胞质中的细胞核，实际上在其可转运的细胞质内含有多个细胞核。
术语“丝状真菌”表示那些能通过分支的、缠绕的菌丝形成菌丝体的真菌，尽管菌丝受到了横壁的隔断，但是横壁上的细孔容许细胞质在隔室之间流动。当进行有性繁殖时，许多这样的真菌在囊内形成了减数分裂的孢子。在适当的刺激下，可以发生无性生殖，不过机理还不是很清楚。对于这种形式的生殖而言，在沿着菌丝的多个部位上所形成的发芽突起的顶部外生了称作“分生孢子”的孢子。
用于产生本发明的异核体组的丝状真菌通常是藻菌纲(Phycornycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)、和半知菌纲(Deuteromycetes)。藻菌纲包括所有的无隔的和一些有隔的丝状真菌。它们的无性孢子是不同类型的，包括在专门化的茎末端上形成的囊内所含有的孢囊孢子。不同的物种有着不同的性周期。
子囊菌与其它真菌有所不同的结构是子囊，一种含有称作子囊孢子的有性孢子的囊样结构。子囊孢子是交配、雄性和雌性核的融合、两次减数分裂、以及通常1次终末有丝分裂的终产物。通过在专门化结构的表面上形成的有性孢子可以区分出担子菌。半知菌常被称作“不完全菌(imperfect fungi)”，因为还没有观察到有性阶段。它们的菌丝都是有隔的，并且分生孢子形式与子囊菌的那些分生孢子形式相似。
优选的丝状真菌是子囊菌纲，更优选地是链孢霉属、曲霉属、镰刀菌属、木霉属(Tricoderma)、金孢子菌属、和青霉属。特别优选的种来自链孢霉属包括中间型链孢霉(N.intermedia)、粗糙链孢霉、N.sitopula、和N.tetraspora，其中最优选的种是粗糙链孢霉。有用的曲霉菌种包括构巢曲霉、黑曲霉、土曲霉、和烟曲霉。
丝状真菌的赘生物生长包括核分裂和细胞分裂(有丝分裂)。这种类型的细胞分裂包括无性生殖，即新菌落的形成是通过分生孢子的途径，这不涉及配子，也不涉及核融合。例如，链孢霉属的物种的细胞核内都含有7个不同的染色体，每个染色体都只有单一拷贝，即赘生物生物体是单倍体。在菌丝体生长期间以及通过形成分生孢子的无性繁殖期间通常都保持这种单倍体状态。
也可以发生有性生殖，不同配子类型的两个单倍体细胞(菌丝或分生孢子)融合形成了含有两个不同核的双核细胞。因此两个单倍体核共存于相同的细胞质内，同时在合胞体内或多或少地进行分裂。但是如果细胞启动了子囊孢子形成，两个不同的单倍体核可以融合形成二倍体核，其含有成对的同源染色体。然后这种二倍体细胞开始减数分裂。
“异核体”(或异形核细胞)是具有两个(或多个)遗传学上不同的细胞核的细胞。本发明的异核体必须含有来自其中所有异核体相容性等位基因(除了当存在tol基因时的交配型等位基因)都为纯合子的细胞的细胞核。例如在链孢霉菌中，已经鉴定出了至少10个异核体不相容性的染色体位点het-c、het-d、het-e、het-i、het-5、het-6、het-7、het-8、het-9和het-10，推测还存在着更多的位点。见Perkins et al.，″ChromosomalLoci of Neurospora crassa″，Microbiological Reviews(1982)46426-570中的第478页。
如果两个菌株都携带有一个或多个het位点的不同的等位基因，它们就不能形成稳定的异核体。在不同的异核体融合之后或者在往不同的菌株内微注射了细胞质或提取物之后都会发生原生质体杀灭。当重复体(部分二倍体)是het的一种或多种等位基因的杂合体时，其生长受到抑制并且是十分异常的。通过异核体检查首次鉴定出了大量的异核体不相容性位点(具体地是het-c、-d、-e和-i)。用重复体检测出了het-5到-10，因为天然群体中的het位点的差异是普遍的。参考文献同上。
交配型等位基因“A”和“a”在粗糙链孢霉中也可作用为het基因，尽管可以出现一些缓慢的异核型生长。微注射试验已经涉及到杀灭反应中的蛋白。因此，相反的交配型对于与异核型aseogenous菌丝的增生相关的复杂事件通常也是重要的。参考文献同上的第436和478页。但是，如果存在tol基因时，抑制了与相反的交配型等位基因A和a相关的赘生物(异核体)不相容性，且不影响性相容性。因此，(tol；A+a；a)异核体可以是完全相容的和稳定的，只要其它的het位点是相同的等位基因(或共等位基因的(conallelic))，并且存在tol基因，A/a重复体就可正常生长。
如果提供了来自对于相容性位点是共等位基因的(conallelic)两种不同的菌丝，当它们生长于相同的培养基时，它们可以融合，特别是如下所述的融合是强制性的。然后所形成的培养物含有来自两个菌株的细胞核，所述细胞核循环于共同菌丝体团的共有细胞质内。
构建编码给定抗原的混合群的表达单元在描述本发明时，根据如下设定的定义使用下面的术语本发明涉及在丝状真菌异核体内生产“异源的多价疫苗”。在上下文中，“异源的”表示蛋白通常不是真菌产生的。“多价”表示最终的疫苗产物是由至少两种抗原或抗原变体构成的。产物可以是异多价疫苗，包括完全不同的疫苗，或者可以是同多价疫苗，是由单个亚基的变体组成。多价疫苗的实例包括但不限于，来自细胞表面的重组抗原的混合物、病毒被膜蛋白、特殊致病性蛋白抗原等。
“编码抗原的核苷酸序列”是序列的一部分，其中当所述序列与合适的控制序列可操纵地连接时，其转录物被翻译成了多肽。用5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的终止密码子确定出编码序列的界限。该编码序列可以来源于例如原核基因、真核mRNA的cDNA、真核DNA(例如真菌)的基因组DNA序列，或者可以包括合成DNA。多腺苷酸信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
当控制序列影响到合适宿主细胞内的编码序列的表达时，编码序列与控制序列是“可操纵地连接的”。
“表达单元”是含有与“控制序列或区域”可操纵地连接的编码序列的DNA分子，所述控制序列或区域在合适的条件下指导可操纵连接的序列在合适宿主生物体内的转录和翻译。
当这些外源DNA已经被引入到宿主细胞膜内时，说明细胞已经被外源DNA所“转化”。对于原核生物例如细菌而言，外源DNA可以保持于游离基因元件例如质粒内。因为丝状真菌确实具有核(是真核生物)，被最稳定转化的真菌宿主细胞含有整合到染色体内的外源DNA，使得其可以通过染色体复制被子代细胞所继承。
“重组宿主”表示已经被或者即将被经重组技术制备的DNA序列转化的细胞，其包括原代转化的细胞及其培养物和后代。
可以采用多种方法产生一群DNA分子，其编码1)多价疫苗的抗原亚基的天然存在的变体；2)多价疫苗的抗原的随机产生的或选定的变体；或者3)多价疫苗的抗原的合理设计的或选定的变体。下面用流感疫苗作为举例说明的实例。本领域技术人员可以容易地用下面罗列的方法或本领域已知的等价方法产生编码亚基的DNA分子群。
用标准的cDNA产生/克隆技术可以产生编码具有天然异质性的抗原的抗原的天然存在的变体的DNA分子群。首先从病原体中分离出mRNA或病毒基因组RNA群，例如对于流感疫苗而言，直接从病毒本身的基因组RNA中分离出RNA群。在本领域已知的克隆方法例如RTPCR中，所分离的RNA分子群被用作产生cDNA分子的模板。因此可以将所产生的cDNA分子群插入到如下所述的合适的表达单元内。
或者，对于已知其蛋白序列的抗原而言，用本领域已知的方法可以产生人工cDNA序列，所述序列整合有丝状真菌宿主菌株高频率地用其产生它自己的内源性蛋白的密码子。
另外，可以对编码多价疫苗的抗原的分离的或人工的cDNA分子实施定点或随机诱变，以产生特殊亚基的非天然存在的变体。可以容易地用例如随机的或定点错配PCR引发(priming)、接头分区诱变、或化学和物理诱变的方法产生编码抗原的合理设计的或随机产生的变体的DNA分子群。例如，可以用随机产生的或合理设计的PCR引物产生抗原编码序列内的随机的或靶向的异质性。
当选择标准例如蛋白折叠或选择特殊的靶残基或区域被用于产生变体或选择编码变体的DNA分子时，变体在此被认为是合理设计的。当产生或选择变体编码DNA分子时没有使用选择标准时，变体被认为是随机产生的。
用于产生多价疫苗亚基中的异质性的优选的靶位点是免疫原性表位及其周围的氨基酸序列。对于流感病毒抗原基因而言，这种类型的变异形成位于每个抗原的已知的天然可变区的中心。例如，可以一个接一个地改变可变区内的每个氨基酸，以产生已知变异的文库。
构建编码多价疫苗的抗原的表达单元利用公知的技术构建出含有编码多价疫苗的抗原的核苷酸分子的表达单元。通过将亚基编码序列放置于与最终的丝状真菌宿主内指导表达亚基编码序列的控制序列可操纵地连接，产生表达单元。
本领域目前已知有多种用于以组成或诱导的方式指导可操纵地连接的蛋白编码序列的表达的控制元件。根据所用的真菌菌株、培养真菌所采用的条件、所需的蛋白表达水平、和所需的表达性能(例如诱导型对组成型)选择控制序列。本领域技术人员可以容易地用本领域已知的控制序列产生在本异核体组中所用的表达单元。
除了指导蛋白编码序列的转录和翻译的序列之外，本发明的表达单元还可以控制信号序列、指导抗原输出到细胞外的表达控制元件。Dalbey R.E.，et al.，TIBS 17474-478(1992)提供了对丝状真菌的已知的分泌信号的综述。本领域技术人员可以容易地产生含有分泌信号的表达单元。
本发明的另一种形式的表达单元可以含有融合蛋白，其通过与宿主细胞或异源的膜锚定序列融合指导抗原位于细胞膜，或者通过与宿主细胞或异源的细胞表面分子融合指导抗原位于细胞表面。
在一个应用中，产生了重组单元，而不是表达单元。在这种情况中，位于亚基编码序列或抗原编码序列的片段侧面的是含有与宿主真菌菌株的整合位点同源的序列的DNA区域。然后用同源序列刺激并指导重组单元和宿主染色体之间的同源重组。当使用重组单元时，优选地首先用含有表达控制元件的表达单元转化宿主菌株，随后用靶向重组所用的序列进行转化。例如，可以将流感抗原引入到宿主真菌内，然后可以用同源重组单元引入宿主染色体的靶区域内的异质性。
有时用中间宿主产生能够转化最终真菌细胞的中间载体。然后可以生长中间细菌转化体，得到所需量的DNA，其被用于转化所需的丝状真菌宿主。可以用作中间载体的常用的细菌载体的实例包括例如pBR322、pUC8和pUC9。其它有用的中间载体包括pHY201、pKBY2、pTZ18R、pX182和pCVTN2.9、pN807、pN846。
在另一个实施方式中，抗原或相关的物质被表达为与真菌疏水蛋白例如EAS的融合蛋白。通常大量地表达并分泌真菌疏水蛋白。然后用疏水蛋白涂层真菌的表面。已知这些蛋白在溶液中会发生聚集。这种聚集性能容许制备出聚集的重组蛋白，其形成了抗原颗粒。可以纯化出这些蛋白并用作抗原。当在相同的培养物中表达出多个抗原时，就产生了多价抗原颗粒。
要明白本发明的这种描述和阐述覆盖了在本发明的精神和范围之内的所有实施方式。例如，本领域人员知道插入、缺失或取代开放阅读框的氨基酸序列内的氨基酸基本上不会影响分子的抗原性，因此本发明包括通过对天然存在亚基的缺失、添加或取代所产生的这种多价抗原。
亲代菌株的性质因为用于制备本发明的异核体的每种亲代真菌菌株都含有编码多价疫苗的抗原的DNA分子群的成分，所以一种真菌亲代将具有被修饰成含有编码所需多价疫苗的第一个抗原或抗原组的第一个DNA分子群的成分的细胞核，以及每个连续的真菌亲代都将具有被修饰成含有所需多价疫苗的不同的抗原或抗原组的不同DNA分子群的成分的细胞核。例如，为了产生产二价流感疫苗的异核体，一种真菌亲代将由A H1N1型流感病毒的cDNA产生抗原组，而另一种真菌亲代将由A H3N2型流感病毒的cDNA产生抗原组。为了产生三价流感疫苗，一种真菌亲代将由A H1N1型流感病毒的cDNA产生抗原组，第二种真菌亲代将由AH3N2型流感病毒的cDNA产生抗原组，以及第三种真菌亲代将由B HN型流感病毒的cDNA产生抗原组。核苷酸和蛋白序列都是公开的。例如，HA基因的示例序列包括H3N2(AY738729)、流感A病毒(A/Leningrad/54/1(H1N1))神经氨酸酶基因(M38309)、流感A病毒(A/Swine/Ontario/42729A/01(H3N3))神经氨酸酶(NA)基因(AY619975)、流感A病毒(A/Swine/Ontario/KO 1477/01(H3N3))神经氨酸酶(NA)基因(AY619966)、流感A病毒(A/Swine/Saskatchewan/18789/02(H1N1))神经氨酸酶(NTA)基因(AY619960)、流感A病毒(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1))片段6(NC 004523)、流感A病毒(A/mallard/Alberta/211/98(H1N1))神经氨酸酶(NA)基因(AY633214)、流感A病毒(A/mallard/Alberta/99/91(H1N1))神经氨酸酶(NA)基因(AY207541)、和流感A病毒(A/duck/Miyagil/9/77(H1N1))神经氨酸酶(NA)基因(AY207534)。
除了如上述的每个亲代菌株的细胞核都已经被修饰成含有编码抗原或抗原组的DNA分子外，每个亲代菌株的细胞核还必须含有造成使得真菌依赖于第二个核、和/或第三个核和/或其它核的存在才能在形成异核体的条件下生存的特征的基因组。因此，每个亲代的细胞核都赋予了将造成含有核的真菌不能在培养条件下生存的特征，除非同时也存在第二个细胞核、和/或第三个细胞核和/或更多的细胞核。例如，需要特殊营养物的亲代必须与没有这种需要的亲代一起才能被培养于缺少这种营养物的培养基上。如果发生了菌丝融合，第二种亲代就赋予了在缺乏这种营养物的条件下生存的能力。反过来，第二种亲代可能需要第一种亲代所不需要的不同的营养物。当两种营养物都缺乏时，仅仅含有两种核的真菌才能生存。
所需的营养物可以是真菌菌株细胞的生长所需的、或者当缺少时会严重地损害真菌菌株生长或生存的能力的任一物质。有用的营养物需求以及相关突变体的实例包括(1)氨基酸例如组氨酸(his-1到-7突变体)、脯氨酸(aga突变体)、精氨酸(arg-11突变体)、瓜氨酸(arg-11突变体)、门冬酰胺(asn突变体)、胆碱(chol-1和chol-2突变体)、半胱氨酸(cys-1突变体)、谷氨酰胺(gln-1突变体)、亮氨酸(leu-1到4突变体)、赖氨酸(lys-2、-4和-5突变体)、甲硫氨酸(mac突变体和met-6、-9和-10突变体)、和苏氨酸(thr-2和-3突变体)。
(2)芳香族氨基酸混合物，例如对氨基苯甲酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的混合物(所有aro菌株都需要，除了aro-6、aro-7和aro-8)、色氨酸和苯丙氨酸的混合物(aro-6突变体需要)、异亮氨酸和颉氨酸的混合物(ilv-1、-2和-3需要)、以及苯丙氨酸和酪氨酸的混合物(pt突变体需要)。
(3)维生素例如泛酸(pan-1突变体)和硫胺素(thi-2和thi-4突变体)。
(4)嘌呤碱基例如腺嘌呤(ad-2到ad-4和ad-8突变体)、次黄嘌呤(ad-2和ad-3突变体)、肌苷、和鸟嘌呤或鸟嘌呤核苷(gua-1或-2突变体)。
(5)嘧啶碱基例如尿嘧啶(pyr-1到pyr-6)。
(6)饱和脂肪酸(cel突变体)或在9或11位点上具有顺式构象的双键的不饱和脂肪酸例如C16或C18脂肪酸、在9位点上具有反式构象的双键的脂肪酸、以及具有经甲撑桥中断的多个顺式双键的脂肪酸(ufa-1和-2)。
(7)生理上重要的离子例如钾离子(trk)。
(8)糖醇例如肌醇(acu和inl突变体)和甘油。以及(9)其它的有机物例如乙酸(ace突变体)、I-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、甲酸或甲醛(for突变体)、对氨基苯甲酸(pab-1、-2和-3突变体)、和磺胺(35℃下的sfo突变体)。
基于营养物需求的一个特殊实例是编码酶鸟氨酸转氨甲酰酶的ArgB+基因。野生型黑曲霉含有这种酶。用常规的一般技术例如用紫外线照射处理以及之后通过依据不能在基本培养基中生长的能力以及在含有精氨酸的培养基中生长的能力进行筛选，可以制备出缺少这种酶的突变体(ArgB-株)。如果它们也含有ArgB+核，含有这种基因组的真菌可以在基本培养基中生长。
也能用于强迫异核体形成的基因是赋予对多种细胞毒药物中的任何一种药物的耐药性的基因。例如，在可选择的实施方式中，其中一种亲代可以具有一种营养物需求以及对经有害化学试剂、抗生素或病毒、或恶劣环境条件例如其它亲代对此敏感的预定的温度范围所诱导的毒性作用的抗性。
可以施加毒性作用的有害化学试剂的特殊实例包括吖啶黄(通常由acr赋予抗性，acr-4和acr-6赋予抗性需要shg基因的存在)、3-氨基-1，2，4-三唑(由acr-2、atr-1、cpc、leu-1或leu-2赋予抗性)、染料例如孔雀绿(由acr-3赋予抗性)、咖啡因(由caf-1赋予抗性)、嘌呤类似物(由aza-1赋予对8-氮杂腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤的抗性；由aza-2赋予对8-氮杂鸟嘌呤和6-巯基嘌呤的抗性；由mep(3)和mep(10)赋予对6-甲基嘌呤的抗性)、氰化物(由cni-1赋予在生长的头24个小时内的不敏感性)、四唑盐(由cya-6和cya-7赋予抗性)、亚胺环己酮(由cyh-1、-2和-3赋予抗性)、铬酸盐(由cys-13赋予抗性)、2-脱氧-D-葡萄糖(由dgr赋予抗性)、伊短菌素(由edr-1和-2赋予抗性)、乙硫氨酸(由eth-1赋予抗性，在存在对氟苯丙氨酸时由nap赋予抗性；如果乙硫氨酸是D形式，则由oxD赋予抗性)、氟化合物例如5-氟脱氧尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、和5-氟尿甙(由fdu-2赋予对所有三种化合物的抗性；在无氨的基本培养基中，由uc-5赋予对5-氟尿嘧啶的抗性；由ud-1赋予对5-氟脱氧尿嘧啶和5-氟尿甙的抗性)、和氟苯丙氨酸(在某些条件下由fpr-1到-6赋予抗性)、8-氮杂腺苷(由mts赋予抗性)、甲基甲烷磺酸(upr-1赋予不敏感性或轻微敏感性)、表面活性物质例如地喹氯铵、溴化十六烷基三甲基铵、和氯化苯甲烃铵(由sur-1赋予抗性)、以及金属离子例如钒酸盐(由van赋予抗性)。
施加毒性作用的抗生素的实例通常包括苯菌灵(甲基-1-(丁基氨甲酰苯并咪唑-2-基-氨基甲酸酯)(由Bncil赋予抗性)、抗菌素A(由cni-1赋予在生长的头24个小时内的不敏感性)、聚烯抗生素例如制霉菌素(由erg-1和3赋予抗性)、以及寡霉素(由oli赋予抗性)。
能赋予对各种极端的环境条件的抗性的基因也是有用的，所述环境条件是例如高温或低温、缺氧(由an赋予抗性)、恒光照(由Hs-1、-2和-3赋予抗性)或缺乏光照、紫外线、离子射线、以及高渗透压或低渗透压。在特别优选的实施方式中，对毒性作用的抗性就是对抗生素例如潮霉素的抗性。
本发明所普遍使用的菌株可以生长于盖棉花塞的试管中的IX Vogel基本培养基(N培养基)内，根据菌株的表型往培养基中加入添加物，例如组氨酸、精氨酸和/或肌醇。例如可以从Fungal Genetics Stock Center(“FGSC”)以及从斯坦福大学D.D.Perkins得到常用的菌株。被认为有用的另一种粗糙链孢霉菌株是M246-89601-2A(来自Dr.Mary Case，University of Georgia，Athens)。该菌株是野生型74A的衍生物，其含有稳定的qa-2突变(M246)、arom-9突变(M6-11)和inos(io601)突变。双重突变体qa-2、arom-9缺少生物合成的和代谢的脱氢奎尼酸酶活性，并且不能在没有芳香族氨基酸添加物的基本培养基中生长，例如所述芳香族氨基酸是浓度为约80μg/mL的苯丙氨酸。
也从Fungal Genetics Stock Center得到有用的黑曲霉株(ATCC46951)以及镰刀菌、麻孢壳属(Gelasinospora)和粪生壳粪壳菌(Sordaria fimicola)的菌株，或者用紫外线诱变也能制备形成其在给定基本培养基中的生长需要鸟嘌呤和精氨酸的分离株。这种缺乏氨甲酰转移酶的菌株叫作argB(350(-)52)。Cove，Biochim Biophys Acta(1966)11351-56描述了用于生长黑曲霉或构巢曲霉的培养基。
通常用标准方法保持菌株和制备分生孢子(Davis and de Serres，Methods Enzymol(1971)17A79-141)。菌丝体通常在液体培养物中生长约14个小时(25℃)，如在Lambowitz et al.J Cell Biol(1979)8217-31中所述的那样。宿主菌株通常生长于添加有适当营养物的Vogel或Fries基本培养基中，所述营养物是例如组氨酸、精氨酸、phe、tyr、和/或trp(每种都为约80μg/mL)、对氨基苯甲酸(约2μg/mL)、和肌醇(约0.2mg/mL)。
许多具有所需特征的真菌菌株都是公众可得到的。但是，如果菌株不容易得到，本领域一般人员可以利用本领域公知的选择技术分离出提供有所需特征的所需突变体或遗传加工过的细胞核。下面的表显示了举例说明的亲代组合。
表1Diakaryon组合 亲本1 亲本2表型需要组氨酸 色氨酸或者需要精氨酸 赖氨酸或者需要尿嘧啶 胸腺嘧啶Trikaryon组合 亲本1 亲本2 亲本3表型 需要 组氨酸 色氨酸 精氨酸和 色氨酸精氨酸 组氨酸(给融合配偶体提供)(精氨酸) (组氨酸)(色氨酸)Tetrakaryon 亲本1 亲本2 亲本3 亲本4表型 需要 组氨酸色氨酸 精氨酸 亮氨酸和 色氨酸精氨酸 亮氨酸 组氨酸和 精氨酸亮氨酸 组氨酸 色氨酸(给融合配偶体提供)(亮氨酸) (组氨酸)(色氨酸) (精氨酸)如表中所示的那样，可以选出各种互补特征/性能组合以满足不同的融合条件。突变体菌株一般都具有营养物需求，而通过用抗性基因的表达载体修饰核可以更便利地赋予抗某些物质的能力。或者，利用重组技术例如与转化载体的同源重组可以实现营养物需求，以及通过在存在毒性条件的条件下通过突变可以赋予抗性。
在本发明的一个实施方式中，宿主细胞被转换成了用于转化的原生质体。当使用原生质体时，它们的优选的制备方法是例如用甲壳酶/glutamase混合物对细胞壁的酶消化。对用于酶消化的合适的酶的选择是在本领域技术人员的知识范围之内。有用的酶是那些能够消化复合多糖的酶，在已知能有效地制备多种真菌物种的真菌原生质体的酶中可以发现这些有用的酶。合适的酶的特殊实例包括Novozyme 234(一种酶的粗制混合物)和β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucurouidase)。可以用其它合适的方法产生原生质体。但是，如果鉴定出能让载体渗入到细胞壁的合适方法，可以与原生质体一起使用真菌宿主的整个细胞壁或者用整个细胞壁取代原生质体。
为了修饰真菌宿主菌株，使之含有编码多价疫苗的特殊亚基的DNA的表达单元，除非特殊标注，本发明的实施都采用本领域人员的能力范围之内的分子生物学、微生物学、和重组DNA技术。在文献中充分地解释了这些技术。见，例如Maniatis et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(1982)；D.N.Gover et al.DlSTA CloningA PracticalApproach(1985)Volumes I and II；寡核苷酸合成(M.J.Gait ed.1984)；核酸杂交(Hames et al.eds.1985)；转录和翻译(Hames et al.eds.1984)；动物细胞培养(R.I.Freshhey ed.1986)；固定化细胞和酶(IRL Press1986)；B.Perbat，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)。
用于转化粗糙链孢霉的常用方法一旦将编码多价抗原的DNA分子群放入到了表达单元内，用DNA分子转化丝状真菌的亲代宿主菌株，例如Smart“Heterologous dimericproteins produced in heterokaryons”所述的那样。粗糙链孢霉是从FungalGenetics Stock Center公开得到的，但是也可以使用独立制备的菌株。如Stadler et al.Genetics(1966)54677-685和Haas et al.Genetics(1952)37217-26所述的，可以从头分离出突变体。也可以从斯坦福大学D.D.Perkins得到有用的菌株。菌株通常生长于盖棉花塞的试管中的IX Vogel基本培养基(“N培养基”)内，根据菌株的表型添加合适的添加物。
原生质体作为转化的对象。为了形成分生孢子的原生质体，将真菌接种到4到5个125ml锥形瓶(用棉花塞盖住)中的添加有合适添加剂的25ml固体N培养基上。培养物在室温下生长5-7天。
通过往每个瓶内加入10ml N培养基、更换棉花塞，和摇晃培养瓶收集到分生孢子。晾置固体数分钟。将分生孢子混合物倾倒到悬挂在锥形瓶口上的经高压灭菌的粗棉布包内，并用一根或多根橡胶带将其扎紧。回收过滤液，用血细胞计数仪测定出分生孢子的浓度，将链(chains)计为一个。
往150ml含有1.5％蔗糖和合适添加物的液体N培养基中加入2×109个分生孢子。分生孢子在盖有棉花塞的烧瓶内发芽，同时在室温下摇晃5-6个小时(150-200rpm)，直到超过75％的分生孢子已经发芽以及发芽管的长度为1-4个分生孢子直径。通过在约1500-2000rpm下离心10分钟收集细胞。用水冲洗细胞沉淀3次。
然后将沉淀重悬于10ml 1.0M山梨糖醇内，通过在等渗条件下用酶清除坚硬的分生孢子的细胞壁以阻止在形成原生质体时发生原生质体“爆炸”，可以制备出原生质体。方案采自Vollmer和Yanofsky的方法Proc Natl Acad Sci USA(1986)834869-73。
具体地，在无菌的250ml锥形瓶内，往50mg Interspex出售的固体酶(商品名为Novozyme234)中逐渐加入分生孢子悬浮液。在30℃下摇晃(100rpm)混合物约1个小时(4±10分钟)，以消化细胞壁。通过显微镜下检查盖玻片下的混合物小液滴监测原生质体的形成过程。可以检测出原生质体，因为当往盖玻片的一端加入水时，它们可以发生渗透裂解。在分生孢子形成的晚期应当更频繁地监测这个过程。
将原生质体混合物倾倒到无菌的15ml尖底离心管内，通过在swinging bucket台式离心机中500rpm下离心10分钟可以回收原生质体。用10ml 1.0M山梨糖醇洗涤所得到的沉淀物2次，然后用下面的STC溶液洗涤1次91g山梨糖醇、50mM Tris.Cl、50mM CaCl2、用足量的NaOH将pH值调整到8.0，并加量到500ml。
将最终的原生质体沉淀悬浮于16.0ml STC、200μl DMSO和4ml下面的PTC溶液的混合物中200g Sigma出售的商品名为“4000”的聚乙二醇、50mM Tris.Cl、50mM CaCl2、用足量的NaOH将pH值调整到8.0，并加量到50ml。
可以直接使用所形成的原生质体悬浮液，或者可以按1.0ml冻存于-80℃。
在无菌的、15ml螺旋帽的试管内，通过轻摇试管混合2.0μl 50mM亚精胺溶液、5.0μl转染的质粒DNA以及5.0μl 5mg/ml肝素溶液，所述质粒DNA含有所需多价疫苗的抗原的表达载体以及选择标记物例如苯菌灵耐药基因(浓度通常为1.0mg/ml)。通过将12.83mg亚精胺溶解于1.0ml TE内并调整pH值为8.0可以制备出亚精胺溶液，并且可以储存于-20℃。通过将50mg肝素钠盐溶解于10mlSTC内可以制备出感染溶液，并储存其冻干部分。
在台式离心机上短暂地旋转(脉冲式的)试管内容物，然将其放置于冰浴箱内。往试管内加入约50-100μl冻融的原生质体。然后在冰上赋予混合物约30分钟，但是冰上孵育时间为20分钟也取得了成功。加入约1ml PTC，轻摇试管混合。然后将混合物在室温下再孵育约20分钟。
通过混合20ml 50x Vogel基本培养基、825ml水、182g山梨糖醇、和28g琼脂可以制备出再生“顶层”琼脂。高压灭菌顶层琼脂，并加入100ml 10x FIGS溶液(含有5g/l果糖、2g/l肌醇、2g/l葡萄糖、和200山梨糖)。在50℃-55℃下孵育15ml顶层琼脂，并将其倾倒到含有原生质体和质粒DNA的试管内。通过轻摇并倒转试管2到3次快速地混合内容物，然后均匀地倾倒到铺板的“底层”琼脂层上。
通过混合任一所需的添加物、1xN培养基；高压灭菌，并加入10xFIGS和苯菌灵(如果用苯菌灵耐药性作为标记物)制备出“底层”琼脂，FIGS和苯菌灵的终浓度分别是1x和0.5μg/ml。将体积为25ml“底层”琼脂倾倒到Petri培养板上，并使得其变硬。
在将顶层琼脂倾倒到底层琼脂上之后，通过加热去除气泡。直立放置培养板，知道顶层琼脂已经固化(约5分钟)。如果顶层琼脂过早地变硬，可以预加温底层琼脂培养板。一旦顶层琼脂已经固化，将培养板在30℃下倒置孵育。
为了选择出粗糙链孢霉转化体，将宿主培养于合适的培养基(具有只有转化细胞才能利用的组合物或者含有只有转化细胞才具有耐药性的抗生素)内，并在34℃下孵育。在铺板后约24-36小时可以发现成功转化的指示。在生长3天后，稳定转化体被总体评分。检测出转化体所需的孵育时间根据宿主菌株和表型标记物的不同会有所不同。
用标准方法例如合适的ELISA、菌落印迹免疫检测法、限制性内切酶分析、滤膜杂交、嵌套缺失亚克隆等可以筛选出所选的转化体是否表达所需的抗原亚基。
在本发明中，用上述的重组技术生产表达所需重组抗原或抗原组的真菌宿主菌株，每个宿主菌株都具有一种或多种在特定条件下负面地影响生长的特性，但是所述特性是可以被一种或多种其它的细胞核所赋予的性能纠正的。
所形成的宿主菌株是用于形成本发明的异核体的亲代菌株。
或者，可以用电穿孔方法转化新采集的丝状真菌例如链孢霉菌的分生孢子(Van，D.C.Fungal Genetics Newsletter No.42A(Supplement)(1995))。通常从7-28天的培养物中采集到分生孢子。用1M山梨醇溶液洗涤细胞，并将其配成终浓度为2.5×109个细胞/ml的悬浮液。往分生孢子悬浮液部分加入近5μg线性DNA，然后将其一部分放置于电穿孔杯例如具有0.2cm缺口的电穿孔杯的底部。电穿孔机例如In Vitrogen电穿孔机II被设定为电压梯度约为7.25kb/cm、以及约71μF和约200欧姆。在电穿孔之后，将细胞铺板于具有或不具有基本上如上所述的顶层琼脂的合适培养基上。
在转化之后，通过在用于特殊宿主细胞和每种个别情况中所用的表达单元的选择培养基上扩增培养物可以建立源自每个分子变体的稳定的生产菌株。
异核体的产生因为就所有的异核体相容性等位基因(如上面所解释的，除了当存在tol基因时的交配型等位基因)而言，所选出的所有真菌宿主菌株都是共等位基因(conallelic)，因此当在没有一种宿主菌株能单独存活的条件下一起培养宿主菌株时，真菌能融合，使得形成本发明的异核体真菌。通过菌丝融合，宿主真菌的不同的单倍体核可以共存于共同的细胞质内。虽然不希望受任何理论的约束，本发明人相信每个细胞内的膜内颗粒的聚集造成了膜融合，使得在无蛋白区域之间的细胞接触成为可能。然后接触区内的脂质重排导致了细胞的完全融合。
因为每个亲代都含有能产生多价疫苗的不同抗原的细胞核，所形成的异核体能够产生完整的包括多个抗原的多价疫苗。
据此所形成的异核体是稳定的，其中核以相同的速度分裂。
生产给定多价疫苗的异核体的产生本发明的组合物和方法采用了表达源自病原生物体的免疫原性抗原的异核体。如上所述，两种或多种宿主菌株形成了所述异核体，每个异核体都生产不同的多价疫苗。
一个实例是产流感抗原变体的异核体。为了产生这样一种菌株，在没有任何营养添加物的固体培养基底物上混合每种单个亲代菌株的分生孢子悬浮液，或者对于具有耐药性基因的宿主细胞而言，是在含有细胞毒药物的培养基上进行混合。可以形成由亲代菌株的预定组合所构成的异核体，或者可以形成利用微滴定板的矩阵格式或其它常用格式的异核体文库。下面的表(表2)中举例说明了一些可得到的组合，其仅仅是举例说明的形式，并不表示任何形式的限定。
表2用于产生多价疫苗的异核体的产生亲代宿主细胞含有来自流感病毒株的基因AH1N1或AH3N2或BHN具有抗原变体a、b、c... d、e、f... g、h、j...
根据用户的选择可以产生单个疫苗生产菌株异核体的组成菌株c加上 菌株f加上 菌株h或者可以产生一组疫苗生产菌株例如异核体1的组成 菌株a加上 菌株d加上 菌株g异核体2的组成 菌株a加上 菌株e加上 菌株h异核体3的组成 菌株b加上 菌株f加上 菌株i以及如果需要，可以包括所有可能的组合，其中“A”＝A型流感病毒；“B”＝B型流感病毒；“H”＝血凝素；“N”＝神经氨酸酶；“变体”＝流感病毒类型的H和N抗原的抗原类型与菌株的不同组合。
常用的基本培养基含有按每升计，5.0g葡萄糖、50.0ml盐溶液(见下)、1.0ml微量元素(见下)、和12.5g琼脂(pH值调整为6.5)(如果所需的培养基为固体形式)。盐溶液含有120.0g NaNO3、10.4g KCl、10.4gMgSO4、和30.4g KH2PO4。
微量元素溶液包括1.1g(NH4)6Mo7O24.4H2O、11.0g H3BO3、1.6gCoCl2.6H2O、1.6g CuSO4、50.0g Na2EDTA、5.0g FeSO4.7H2O、5.0gMnCl2.4H2O、和22.0g ZnSO4.7H2O(pH值为6.5)。
因此，为了使得异核体丝状真菌保持住其异形核状态，需要保持外界的强迫力。异核体真菌细胞在基本培养基中的生长“强迫”菌株仍保持在一起。如果交配型是相反的，可以用tol基因保持稳定的(A+a)异核体。
通过在有利于产生抗原的条件下培养本发明的异核体可以产生多价疫苗。可以从培养物中回收多价疫苗抗原，并用适合的标准技术进行纯化，所述技术必须要保留住抗原的结构。
优选地，异核体丝状真菌携带有表达单元，其容许所培养的宿主将所需的多价疫苗直接地分泌到基本生长培养基内，使得可以从无细胞的培养基中直接纯化出多价疫苗。或者，异核体丝状真菌携带有表达单元，其指导抗原表达于细胞表面。可以从细胞裂解物中分离出细胞内产生的多价疫苗。有用的纯化方法是本领域人员的能力范围之内，例如分子尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、HPLC、亲和色谱法、疏水作用色谱法等等。
抗原所阐述的发明涉及制备抗病原体(特别是证实有改变其抗原特征的的能力的病原体)的抗原组合物例如疫苗。真核的、病毒的、细菌的和真菌的抗原都包括在本发明的用途之内。本发明的另一个用途是制备同时抗多种不同抗原的抗原组合物。本发明的优选的实施方式涉及制备多价流感疫苗。流感病毒一直都在发生突变并产生新的病毒株。因此，没有必要限制在本发明中所列的个别基因，因为本发明适用于任何流感病毒株或者任何病原体株。
存在三种类型的流感病毒A、B和C型流感病毒。A和B型流感病毒几乎每年都会引起疾病流行，而C型病毒仅仅引起轻微的呼吸道不适，并被认为是临床上不重要的一种病毒类型。根据病毒表面上的两种蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)可以将A型流感病毒分成亚型。目前感染人类的A型流感病毒的亚型是A(H1N1)和A(H3N2)。目前禽流感病毒(H5N1)受到了极大的关注，已知其也能感染人类。
流感病毒极好地进行着巨大的抗原漂移。全世界都投入了极大的努力来监测病毒的抗原漂移，使得可以鉴定出任何新出现的变异病毒株，然后将其用于产生更新的疫苗，所述疫苗是与在给定流感季节中可能感染人类的病毒株最为匹配的疫苗。在鉴定出相关的流感病毒株之后，可以用本发明的方法产生多价抗原材料，可以用其制备出疫苗。
另一个实施方式涉及制备抗疟原虫的多价疫苗，疟原虫是一种原虫，其包括四种引起人类疟疾的种类。四种疟原虫的实例包括间日疟原虫和恶性疟原虫。多价疫苗所针对的病原体的总列表打算包括人乳头瘤病毒16、18、和31、人免疫缺陷病毒(HIV)、带状疱疹-水痘病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、1型单纯疱疹病毒、和2型单纯疱疹病毒。适合用作本发明的靶点的抗原包括这些生物体的能够引发宿主体内的免疫反应的任何蛋白。
分泌抗原的检测异核体宿主可以储存于固体基本培养基上，也可以在有利于表达多价抗原的条件下培养于液体基本培养基内。在生长2-7天后，可以在无菌条件下收集液体培养基，并用标准的分析方法检测是否存在每种特异的所需抗原，所述方法包括但不限于ELISA、PAGE5毛细管电泳、和光谱测定法。
在鉴定出产所需的多价疫苗的变体的培养物之后，用标准方法可以将储存于固体培养物中的细胞扩增为更大的发酵培养物，当在所用的特殊真菌宿主的最佳生长条件下生长时，这种扩增的宿主培养物将产生所需的产物，其量足够用于研究评估以及最终用作重组疫苗。
细胞表面定向抗原的检测可以构建出异核体，其表达在真菌孢子的表面上展示病毒抗原的融合蛋白。天然的蛋白一般都定向于真菌的细胞表面，例如疏水蛋白例如链孢霉菌的EAS蛋白，以及透酶蛋白例如链孢霉菌的MTR蛋白。这些蛋白可以用作病毒抗原的细胞表面定向的融合配偶体。用本领域人员公知的方法构建并表达融合蛋白。用标准的分析方法可以检测在细胞表面上表达抗原的单个菌株。这些方法包括但不限于用特异于病毒抗原的抗体直接或间接地标记细胞，之后用各种方法检测特异性结合。这些方法包括但不限于ELISA、肉眼或荧光光谱法、和流式细胞术。然后可以融合表达抗原的单个菌株，并重新测定是否同时表达单个表达的表面抗原，并因此直接地或在纯化之后形成了免疫系统的多价靶点、用于重组疫苗的多价抗原。
非分泌抗原的检测如果抗原是非分泌的，可以用标准方法裂解并去除每个液体培养物中的细胞组分，然后检测细胞悬浮液和碎片中的具有所需特征的多价疫苗。一旦用标准方法已经鉴定出产所需抗原的菌株时，可以用储存于固体培养基中的菌株接种并进行扩增培养。当在特殊异核体的最佳生长条件下生长时，这种扩增的宿主培养物将再次产生足以进行进一步评价和应用的量的所需产物。
下面的实施例只用于举例说明，并不用于限定本发明。
实施例1合成的HA基因构建体用下面的方法设计出合成基因(A/New Caledonial/20/1999/H1N1的HA0、A/Vietnam/1194/2004/H5N1的HA、和A/Vietnam/1194/2004/H5N1的M1)。
从公共NCBI数据库中得到每个基因的氨基酸序列。在HA和HA0基因中，用真菌的信号序列取代天然的前导序列。利用此序列，用于真菌表达的基因被反向翻译，并利用粗糙链孢霉密码子偏向性对其进行密码子优化。序列被变更成低自由能形式，其被计算成复原了新生mRNA的二级结构。逐串地搜索所形成基因中的内含子剪接供体和受体位点。在变更序列以去除这些位点之后，也检查了序列的转录终止位点，并去除了任何的意外位点。
然后测序优化的序列。将所形成的DNA亚克隆到大肠杆菌内，然后测序以检查合成过程中的错误。在验证序列之后，将DNA亚克隆到表达载体(对HA和HA0基因是pHDKXL1，而对M1基因是pALGAM)内，并转化到链孢霉菌内。HA和HA0基因靶向于链孢霉菌的His-3位点处的整合，以及M1基因靶向于链孢霉菌的Am基因处的整合。
实施例2在粗糙链孢霉中表达HA0如实施例1所述的，产生了编码合成的血凝素0(HA0)以及所连接的促进蛋白产生的真菌的信号序列的表达载体。
利用在组氨酸-3处具有突变的宿主菌株选择出组氨酸原养型的转化体(pHDKXL1/HA或HA0转化体)或潮霉素B耐药的转化体(pALGAM/M1转化体)。通过在选择培养基上反复涂划接种纯化出所转化的菌株之后，用ELISA检测转化体是否表达所述基因。检测摇瓶内的培养基中的分泌的流感抗原。将约100万个分生孢子/ml接种于含有25ml基本Volet盐加上0.5％的125ml Ehrlenmeyers中的酵母提取液的烧瓶内。样品在26℃、200rpm摇晃下生长，或者可以在相同的温度下静置生长。在生长2、3、4、5、和6天之后取出样品。用购自BIODESIGN的抗流感病毒的抗体开发出ELISA。用作标准物的对照抗原购自蛋白科技公司。用利用标准方法和试剂的Western印迹法重新筛选ELISA阳性的样品。
测试了不同的生长条件。具体地，分别特异地测试了摇晃和静置培养。通常培养酵母2到6天后，收集样品进行分析。
用SDS-PGAE分离样品，并将其印迹到硝基纤维素膜上进行显像。用山羊多克隆的抗HA(H1N1)抗体以及随后的抗山羊Ig碱性磷酸酶缀合物检测出血凝素。用比色法测定结合力。
图7显示了用于检测粗糙链孢霉内表达合成HA0的western印迹法检测。图8显示了对来自不同HA0克隆的SDS-PAGE凝胶的考马斯兰染色。图9显示了对静置培养表达的HA05的western印迹。这个数据证实了本系统在真菌内重组表达流感病毒蛋白的能力。
实施例3在真菌异核体内多价表达流感病毒抗原根据实施例1所述的方法制备出表达载体。通过电穿孔将DNA引入到链孢霉菌内，并用实施例2的方法选择出转化体。因为表达载体编码HA0、HA、和M1基质蛋白，所以培养物产生了流感病毒蛋白的多价混合物。
序列表<110>纽詹尼西斯有限公司<120>基于组合方式产生多价重组抗原的方法和组合物<130>239182001440<140>To Be Assigned<141>Concurrently Herewith<150>US 60/619,364<151>2004-10-15<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1718<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>synthetic hemagglutinin 0(HA0)gene(A/NewCaledonial/20/1999/H1N1)<400>1agatcttcgc aatgaagttt cttcaagttc ttccagcact catccccgcc gcgctcgccc 60aagaccaaat ctgcatcgga tatcatgcaa acaactccac cgaacaagtc gataccatta 120tggaaaagaa cgtcactgtt acccatgcac aagacatcct ggaaaaaacg cacaacggca 180aactctgtga cctggacggg gtcaagcccc ttattttgcg cgattgctca gtcgccggct 240ggctcctcgg aaacccaatg tgcgacgagt ttatcaatgt ccccgagtgg tcttatattg 300ttgaaaaagc caacccagtg aacgatctgt gctatcccgg cgattttaac gactacgaag 360agctcaaaca ccttctctcc cgtatcaatc actttgagaa gattcagatc atccccaagt 420cctcctggag cagtcacgag gcatcactgg gcgtcagcag cgcctgtcct tatcagggca 480agtcctcttt ctttcgcaac gtcgtctggc tcatcaagaa gaactccacg tacccaacca 540tcaagcggag ctataacaac actaaccagg aagacctcct tgtcctgtgg ggaatccatc 600atccaaacga cgcagctgaa cagacaaaat tgtaccagaa tcctactacg tatatcagcg 660tcggcacctc gacgttgaac cagcgacttg tcccccgaat tgcgactcga tccaaggtca 720acgggcaatc tggccgcatg gaattttttt ggaccatcct caagccaaac gacgccatca 780acttcgaatc aaatggcaac ttcatcgcac ccgaatacgc ctacaagatc gtgaaaaaag 840gagatagtac aatcatgaag tcagagcttg aatatggcaa ctgtaatacg aagtgtcaaa 900ctcccatggg ggcgatcaat agcagcatgc ctttccataa cattcacccc cttactattg 960gcgaatgccc aaaatatgtc aagtcgaatc gcctcgtgct cgcaaccggc cttcgcaact 1020ctccccagcg cgaaaggagg cggaagaagc gcggtctttt cggtgcaatc gcaggcttca 1080tcgaaggcgg atggcagggc atggtcgacg gctggtacgg ataccatcac tcaaacgaac 1140aaggctctgg ttatgcagcg gacaaggaat cgacacaaaa ggcaattgac ggcgtcacca 1200acaaagttaa ctctattatc gacaaaatga acacccaatt cgaggccgtg ggacgtgaat 1260ttaataacct cgagcgccgc atcgagaact tgaacaaaaa gatggaggat ggcttcttgg 1320acgtctggac ttacaatgcc gagttgctcg tgctcatgga aaatgaaaga acgctcgact 1380tccacgattc caacgttaag aacctctacg acaaggtgag actccaactc cgcgacaacg 1440ctaaggagct tggcaacggt tgctttgagt tctaccacaa gtgcgataac gaatgcatgg 1500aatccgtcag aaatggcacc tacgactacc cccaatactc cgaagaagca cgattgaatc 1560gcgaagaaat ttctggtgtc aaacttgaat ctatcggaat ctaccaaatc ctctctatct 1620actcaaccgt cgcttcctcc ctcgccctcg ctatcatggt tgccggtctt tctctctgga 1680tgtgttcaaa tggctccctt caatgtcgct aatctaga 1718<210>2
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<223>Synthetic hemagglutinin(HA)gene(A/Vietnam/1194/2004/H5N1)<400>3agatcttcgc aatgaagttt cttcaagttc ttccagcact catccccgcc gcgctcgccc 60aagaccaaat ctgcatcgga tatcatgcaa acaactccac cgaacaagtc gataccatta 120tggaaaagaa cgtcactgtt acccatgcac aagacatcct ggaaaaaacg cacaacggca 180aactctgtga cctggacggg gtcaagcccc ttattttgcg cgattgctca gtcgccggct 240ggctcctcgg aaacccaatg tgcgacgagt ttatcaatgt ccccgagtgg tcttatattg 300ttgaaaaagc caacccagtg aacgatctgt gctatcccgg cgattttaac gactacgaag 360agctcaaaca ccttctctcc cgtatcaatc actttgagaa gattcagatc atccccaagt 420cctcctggag cagtcacgag gcatcactgg gcgtcagcag cgcctgtcct tatcagggca 480agtcctcttt ctttcgcaac gtcgtctggc tcatcaagaa gaactccacg tacccaacca 540tcaagcggag ctataacaac actaaccagg aagacctcct tgtcctgtgg ggaatccatc 600atccaaacga cgcagctgaa cagacaaaat tgtaccagaa tcctactacg tatatcagcg 660tcggcacctc gacgttgaac cagcgacttg tcccccgaat tgcgactcga tccaaggtca 720acgggcaatc tggccgcatg gaattttttt ggaccatcct caagccaaac gacgccatca 780acttcgaatc aaatggcaac ttcatcgcac ccgaatacgc ctacaagatc gtgaaaaaag 840gagatagtac aatcatgaag tcagagcttg aatatggcaa ctgtaatacg aagtgtcaaa 900ctcccatggg ggcgatcaat agcagcatgc ctttccataa cattcacccc cttactattg 960gcgaatgccc aaaatatgtc aagtcgaatc gcctcgtgct cgcaaccggc cttcgcaact 1020ctccccagcg cgaaaggagg cggaagaagc gcggtctttt cggtgcaatc gcaggcttca 1080tcgaaggcgg atggcagggc atggtcgacg gctggtacgg ataccatcac tcaaacgaac 1140aaggctctgg ttatgcagcg gacaaggaat cgacacaaaa ggcaattgac ggcgtcacca 1200acaaagttaa ctctattatc gacaaaatga acacccaatt cgaggccgtg ggacgtgaat 1260ttaataacct cgagcgccgc atcgagaact tgaacaaaaa gatggaggat ggcttcttgg 1320acgtctggac ttacaatgcc gagttgctcg tgctcatgga aaatgaaaga acgctcgact 1380tccacgattc caacgttaag aacctctacg acaaggtgag actccaactc cgcgacaacg 1440ctaaggagct tggcaacggt tgctttgagt tctaccacaa gtgcgataac gaatgcatgg 1500aatccgtcag aaatggcacc tacgactacc cccaatactc cgaagaagca cgattgaatc 1560gcgaagaaat ttctggtgtc aaacttgaat ctatcggaat ctaccaaatc ctctctatct 1620actcaaccgt cgcttcctcc ctcgccctcg ctatcatggt tgccggtctt tctctctgga 1680tgtgttcaaa tggctccctt caatgtcgct aatctaga 1718<210>4<211>566<212>PRT
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<223>Synthetic hemagglutinin(HA)<400>4Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Gln Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln20 25 30Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp35 40 45Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val50 55 60Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly65 70 75 80Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile85 90 95Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe100 105 110Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe115 120 125Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala130 135 140Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe145 150 155 160Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr165 170 175Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu180 185 190Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr195 200 205Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln210 215 220Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser225 230 235 240Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile245 250 255Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys260 265 270Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr275 280 285Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser290 295 300Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro305 310 315 320Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn325 330 335Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala340 345 350Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp355 360 365Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp370 375 380Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn385 390 395 400Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu405 410 415Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu420 425 430
Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu435 440 445Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn450 455 460Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu465 470 475 480Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met485 490 495Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu500 505 510Ala Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile515 520 525Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu530 535 540Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn545 550 555 560Gly Ser Leu Gln Cys Arg565<210>5<211>776<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic M1 matrix protein(A/Vietnam/1194/2004/H5N1)<400>5agatcttcgc aatgtctctt ctcactgaag ttgaaactta cgtgctttcc atcatcccgt 60ctggtccact caaagctgaa atcgcacaaa aacttgaaga tgtcttcgcc ggcaagaaca 120ctgatctcga agctctcatg gaatggctga aaacgcgccc gattctctca ccactcacca 180agggcatcct cggttttgtc tttaccctta cagtcccctc agaacgcgga ctccaaagac 240gtagatttgt gcaaaacgcc ctgaacggta acggagaccc taacaatatg gaccgcgcag 300tcaagctcta caaaaaactc aagagagaga ttactttcca cggtgctaag gaagttgccc 360tctcatattc taccggtgct ctcgcttctt gcatgggcct catttacaac cgcatgggaa 420cggttaccac tgaagttgct tttggccttg tctgcgccac atgcgaacaa attgctgact 480ctcaacatcg ctctcatcgt caaatggcca caatcacaaa ccccctcatc cgacacgaaa 540atagaatggt cctcgcatca acaacagcaa aggctatgga acaaatggca ggctcatcag 600aacaggcagc cgaagctatg gagatcgcaa accaagcccg acagatggtt caagctatgc 660gcaccattgg cactcaccct aattcctcag caggtcttag agacaatctc ctcgaaaatc 720ttcaagccta ccaaaaacga atgggcgtcc aaatgcaacg ctttaaataa tctaga 776<210>6<211>252<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic M1 protein<400>6Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro1 5 10 15Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe20 25 30Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr35 40 45Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
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权利要求
1.丝状真菌异核体，其中所述异核体产生抗原的多价重组变体，且其中所述异核体是通过融合两种或多种真菌亲代菌株形成的，其中所述异核体的生存需要存在所有真菌亲代菌株的细胞核，所述亲代真菌菌株各自含有外源提供的编码源自病原生物体的抗原变体的核酸分子，且其中所述真菌亲代菌株是所有异核体相容性等位基因的纯合子。
2.权利要求1的异核体，其中多价抗原以可溶性蛋白的形式被分泌至培养基内。
3.权利要求2的异核体，其中多价抗原聚集成颗粒。
4.权利要求1的异核体，其中多价抗原展示于真菌异核体的表面。
5.权利要求1的异核体，其中多价抗原保留在真菌异核体的细胞质内。
6.权利要求1的异核体，其中病原生物体是病毒。
7.权利要求1的异核体，其中病毒是由流感病毒、人乳头瘤病毒16、人乳头瘤病毒18、人乳头瘤病毒31、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、1型单纯疱疹病毒、和2型单纯疱疹病毒组成的组中的一种。
8.权利要求1的异核体，其中病毒抗原源自A型流感病毒和B型流感病毒。
9.权利要求4的异核体，其中抗原是由A型和B型流感病毒的血凝素和神经氨酸酶的变体组成。
10.权利要求1的异核体，其中每种所述的A型和B型流感病毒的血凝素和神经氨酸酶的变体都是天然存在的变体。
11.权利要求1的异核体，其中每种所述的A型和B型流感病毒的血凝素和神经氨酸酶的变体都不是天然存在的亚基变体。
12.权利要求1的异核体，其中病原生物体是细菌。
13.权利要求1的异核体，其中病原生物体是真菌。
14.权利要求1的异核体，其中病原生物体是由病毒、细菌和真菌生物体的任何及所有组合的混合物组成。
15.一种生产多价疫苗的方法，所述方法包括在能够表达外源提供的核酸分子以形成多价疫苗的条件下培养权利要求1的异核体的步骤。
全文摘要
本发明提供了用丝状真菌异核体快速地生产多价重组疫苗的方法和组合物。本发明涉及通过组合其中已经被引入编码源自病原生物体的抗原变体的重组DNA分子的两种或多种亲代菌株形成的丝状真菌异核体的用途。所形成的疫苗是多价疫苗。
文档编号A61K39/116GK101043903SQ200580035156
公开日2007年9月26日 申请日期2005年10月17日 优先权日2004年10月15日
发明者多尔西·W.·斯图尔特, 爱德华·B.·凯姆巴拉瑞 申请人:纽詹尼西斯有限公司