Tnfr1基因重组腺病毒及其构建的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因生物工程技术领域，涉及一种腺病毒的构建，特别是涉及一种干 扰TNFR1表达的重组腺病毒。
【背景技术】
[0002] NMDA受体是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸受体，属离子型受体，在突 触可塑性及兴奋毒性方面具有重要作用。
[0003]NMDA受体是由NR1、NR2和NR3亚单位组成的异四聚体，每种亚基在中枢神经系统 中的分布不尽相同。一般认为，NR1是NMDA受体的必需亚基，在大脑和脊髓中大量分布，是 实现其通道功能所必需的。NMDA受体不仅在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，而 且对神经元回路的形成亦起着关键作用。Bird等人发现，在关节炎模型的大鼠杏仁核神经 元中，NMDA受体NR1的磷酸化（pNRl)明显上调，而NR1的表达没有明显变化；脑片膜片钳实 验中，给予杏仁核神经元NMDA受体的拮抗剂AP5可显著降低NMDA受体介导的EPSC幅度， 而且在抑制PKA，即阻断了PKA磷酸化NR1的途径后，NMDA受体介导的EPSC也被阻断，类似 现象在抑制PKC后并没有出现。这说明PKA介导的NR1磷酸化在突触后膜表达上调，是导 致突触传递发生可塑性变化的重要原因，也是发生痛觉过敏的基础。
[0004] 肿瘤坏死因子（TNF-α)是由神经元和胶质细胞分泌的炎性因子，TNF-α的许 多生物效应是通过两个细胞表面受体TNFR1和TNFR2介导的。TNF-a的大多生物活性由TNFR1来传递信号，如细胞程序性死亡、抗病毒活性、转录因子NF-kappaB的激活以及宿主 防御等；通过TNFR2的信号通路仅局限于免疫系统。这两个受体是TNF受体超家族的成员。 [0005] 疼痛发生时，不仅神经元产生的神经肽类物质参与了痛信号的传入，而且神经胶 质细胞释放的多种促炎细胞因子，如IL-Ιβ和TNF-α等也促进伤害性信息的传入，如在炎 性痛模型鼠脊髓就会明显发生TNF-a的表达上调。
[0006] 资料表明，中枢和外周因素引起脊髓TNF-a表达上调，可以促成炎性和神经性 疼痛的发生；脊髓胶质细胞释放的TNF-a可以提高神经元的兴奋性；癌痛动物内源性的 TNF-a表达上调增强热敏反应；在鞘内直接注射TNF-a可增强大鼠脊髓广动力神经元的 反应，并快速诱发动物自发性缩足行为和热痛反应，而在鞘内注射溶解的TNF-a受体的抗 体显著减弱大鼠异常疼痛的发生。以上这些都说明，TNF-a在脊髓水平都可以通过激活 TNF受体（TNFR)诱发痛觉过敏。
[0007]Wei等人研究发现，在脑干RVM利用TNF-a抑制剂，可减弱眶下神经慢性缩窄性损 伤（CCI)诱发的痛敏反应，并下调pNRl的表达。因此，可以设想在脊髓水平TNF-a通过激 活TNFR，介导了NMDA受体NR1亚基的磷酸化，引起兴奋传递的可塑性变化以及痛敏的发生。 新近研究表明，TNF-a可以增加普通小鼠脊髓]?层细胞NMDA电流，鞘内应用NMDA受体阻断 剂MK-801后可减弱鞘内注射TNF-a所致的热痛反应，说明TNF-a通过其受体TNFR影响 了NMDA受体的功能活动。
[0008] 目前已知TNFR的2种亚型TNFR1 (55KD)和TNFR2 (75KD)在背根神经节（DRG)和 脊髓都有表达，但二者在痛调制中的作用还有争议。一般认为TNFR1与痛信号传递、痛觉过 敏发生有密切关系，TNFR2并不参与此过程。而新近研究提出了不同的观点，Schafers等 通过体内和体外实验证实，神经损伤后TNFR1在引起感觉神经元兴奋及诱导痛反应的过程 中起主要作用，TNFR2在TNFR1作用时发挥协同作用，它独自并不产生类似TNFR1的作用， 但在神经受损后，对临近未损伤感觉神经元的兴奋有易化作用。Xu等人认为，在L5腹前根 离断损伤模型引起的神经病理性疼痛中，背根神经节和脊髓后角的TNF-α及其受体TNFR1 的上调主要在疼痛起始过程起作用，但与神经切断产生的持续性疼痛无关。另外敲除TNFR1 和TNFR2基因的小鼠实验提示，TNFR1和TNFR2都参与炎性痛和痛敏的过程，但TNFR1发挥 了主导作用，TNFR2是参与了早期阶段的炎性痛反应。
[0009] TNF-α在痛信号传入时表达增多，并参与痛敏及异常疼痛的发生和维持，但其通 过何种方式介导了这一过程，脊髓TNFR被激活后通过何种途径引起痛觉过敏，目前还并不 清楚。鉴于以上研究，需要对炎性痛敏发生时，TNFR1和TNFR2与痛敏及pNRl的相互关系 做进一步的研究。上述研究的基础是需要构建一种干扰TNFR基因表达的质粒载体，以用于 阻断TNF与TNFR结合，阻断TNF通过该途径产生生物学效应。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种TNFR1基因重组腺病毒，及该重组腺病毒的构建方法， 以用于阻断/减少TNFR1的表达，从而缓解TNF-a通过该途径产生的生物学效应。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种含有干扰TNFR1基因表达的siRNA的TNFR1 基因重组腺病毒，所述siRNA具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。
[0012] 用于构建所述TNFR1基因重组腺病毒所采用的穿梭质粒为pHBAd-U6_GFP，所述干 扰TNFR1基因表达的siRNA连接于所述穿梭质粒的U6启动子之下。
[0013] 进一步地，本发明构建所述腺病毒所采用的骨架质粒为pHBAd-BHG，包装细胞为 293细胞。
[0014] 本发明所述TNFR1基因重组腺病毒的构建方法是设计SEQIDNo.1所示核苷酸 序列的siRNA，化学合成对应的SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3所示的shRNA互补单链目的 基因片段，退火得到所述目的基因片段的双链表达模版，与BamHI和EcoRI双酶切的载体 pHBAd-U6-GFP连接构建腺病毒穿梭质粒，再将所述腺病毒穿梭质粒与骨架质粒pHBAd-BHG 共转染293细胞，即可得到腺病毒Ad-TNFR1shRNA。
[0015] 本发明所构建的TNFR1基因重组腺病毒可以作为一种工具药，用于阻断/减少 TNFR1的表达，减少TNF-α与TNFR1的结合，从而缓解TNF-α的致痛敏作用。
[0016] 通过本发明上述工具药的设计，可以进一步探索TNFR1在痛敏发生中的作用及胞 内作用机制，进而应用于临床服务，设计阻断炎性因子激活其受体的药物，以减弱受体激活 后导致的痛敏作用。
【附图说明】
[0017] 图1是pHBAd-U6-GFP干扰载体的质粒图谱。
[0018] 图2是重组腺病毒载体质粒的细胞出毒结果。
[0019] 图3是腺病毒Ad-TNFR1shRNA感染大鼠PC12细胞的荧光显示结果。
[0020] 图4是腺病毒Ad-TNFRlshRNA感染大鼠PC12细胞的WesternBlot检测结果。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1 设计干扰TNFR1 表达的siRNA序列，具体为：5'-attgttactaagcccctaact-3'。
[0022] 人工合成含有上述siRNA的shRNA表达序列，所述序列通过7个碱基的loop环连 接上述siRNA的正义链和反义链，并在序列两端分别引入BamHI和EcoRI酶切位点。
[0023]Topstrand(62bp)： 5'-AATTCGattgttactaagcccctaactTGTGCTTagttaggggcttagtaacaatTTTTTTg-3,；Bottomstrand(62bp)： 5'-GATCCAAAAAAattgttactaagcccctaactAAGCACAagttaggggcttagtaacaatCg-3' 。
[0024] 将上述互补利用3'和5'的单链退火得到相对应的目的片断shRNA的双链表达模 版退火产物。退火程序为： 体系：20μ1 ; 10XBuffer2μ1 ； 100mMTris-ClpH7. 5 ； 1MNaCl；lOmMEDTA； shDNA-R/shDNA-F:1/1μ1 ; H20 ：16μl〇
[0025]程序：95°C10 分钟；75°C10 分钟；55°C10 分钟；35°C10 分钟；15°C10 分钟。
[0026]pHBAd-U6_GFP干扰载体的质粒图谱如图1所示，其U6启动子后为MCS(多克隆位 点）区，BamHI和EcoRI为插入位点，目的片断插入BamHI、EcoRI位点，由U6启动子调控表 达。该腺病毒载体中含有PCMV启动子调控的GFP基因表达。
[0027] 用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切载体pHBAd-U6-GFP，酶切体系如下： 20μ1酶切体系37°C1小时； 4μ1 载体（500ng/μ1); 1 μ1BamHI/Ιμ1EcoRI; 2 μ1 10Xbuffer; 12μ1H20〇
[0028] 酶切完成后胶回收，回收体系：20μ1，含lOXBuffer2yl，100mMTris-Cl pH7. 5,1MNaCl，10mMEDTA。
[0029] 将上述干扰序列TNFR1shRNA的退火产物用T4连接酶连接到载体pHBAd-U6-GFP 的BamHI、EcoRI位点之间，构建腺病毒穿梭质粒，由U6启动子调控表达。
[0030] 引物为上海桑尼生物合成PAGE胶纯化的oligo序列，分别稀释至100μM。
[0031] 处理好的目的片段shRNA与载体连接的反应体系：