1μ1稀释好的退火产物； 100_200ng酶切好的载体；2μ1ligasebuffer;lylT41igase;以Η20 稀释至总体积 20μ1〇
[0032] 以上连接液在4°C过夜。
[0033] 将构建的腺病毒穿梭质粒转化感受态细胞DH5a，抗性：Amp;37°C培养过夜。
[0034] 转化后的TNFR1shRNA进行平板挑菌，37°C250rpm摇菌14小时，将菌液进行测序， 测序结果与目的序列相符。
[0035] 实施例2 取实施例1制备的对数生长期的腺病毒穿梭质粒菌液2ml，加入100ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37°C300rpm震荡摇菌过夜，用康为世纪中提质粒试剂盒提取质粒。
[0036] 转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10%Hyclon胎牛血 清，置37°C含5% 0)2的培养箱中培养过夜。
[0037] 待细胞生长至长满底面积的70~80%时，取重组腺病毒载体质粒TNFR1shRNA及 骨架质粒pHBAd-BHG，用Lipofiter?脂质体（汉恒生物，Hanbio)转染试剂进行转染。
[0038] 具体步骤为： a.转染前2小时更换完全培养基。取2yg重组腺病毒载体质粒TNFR1shRNA，4yg骨架质粒pHBAd-BHG，用300μ1DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
[0039]b.取15μ1Lipofiter?，用300μ1DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
[0040]c.将两者混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字 摇晃后置于37°C含5%C02的培养箱中培养。
[0041] 转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。
[0042] 每天观察细胞的出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显 噬斑（图2)。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒，将60mm培养皿中所有细胞及培养 液收于15ml离心管中。
[0043] 将15ml离心管在液氮及37°C恒温水浴中反复冻融三次，3000rpm离心5分钟，收 集含病毒的上清液，弃去沉淀。该上清即为Ad-TNFR1shRNA第一代毒种（P1)，将其作为随 后大量病毒扩增的毒种。
[0044] 从P1代病毒上清（约3ml左右）中取2ml，感染一个10cm细胞培养皿的细胞（细 胞密度保证90%以上）。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中，-80°C保留，做为毒种保留。
[0045] 病毒扩增两天后，待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收 入15ml离心管中，依据前面冻融方法冻融三次，取上清进行下一代扩增或于一 80°C保存。 以后每代病毒扩增及收毒都如此反复进行。
[0046] 按每个75cm2方瓶中接种4X10 6个293细胞，接种4个75cm2培养瓶，培养过夜， 待细胞生长满至90%时，将P2代病毒（除取少量留毒种外）全部接种培养瓶内，24小时，显 微镜下观察60%细胞病变，48小时后细胞完全病变。收获病变细胞混悬液，2000rpm离心5 分钟，弃上清，加入4mlSTbuffer(培养液+10%血清+2. 5%甘油），votex混勾，于-80°C 和37°C间冻融三次，3000rpm离心5min，取上清，作为第三代病毒（P3)。
[0047] 实施例3 以密度2X105种植MEF细胞系至6孔板中，待细胞生长至60%的汇合度后，分别感染Ad-GFP和Ad-TNFR1shRNA腺病毒，37°C5%C02培养箱中培养2小时，更换培养液，培养36 小时后，在荧光显微镜下观察GFP的荧光表达，结果如图3所示。
[0048] 收集细胞，用PBS洗涤3遍，刮刀刮取细胞移入EP管，lOOOrpm离心3分钟，弃上清， 将细胞沉淀用液氮速冻后放入_8°C冰箱保存。从_80°C冰箱中取出细胞，加入500μ1RIPA 完全裂解液，冰上裂解2小时，12000rpm离心30分钟，收上清，弃沉淀。以BCA法测定上清 液样本中蛋白含量，进行WesternBlot蛋白检测验证。具体方法为取每个样品蛋白50μg， 加入5XSDS上样缓冲液至终浓度为IX，将含上样样品的EP管置于沸水中煮5分钟使蛋 白变性，取15μ1加样孔上样，进行SDS-PAGE电泳4~5小时，电压为40V。再将蛋白转至 PVDF膜（200mA转移2. 5小时），之后转膜分别与一抗、二抗孵育，最后利用化学发光方法对 蛋白含量进行分析。
[0049] 结果显示，Ad-TNFR1shRNA腺病毒明显下调TNFR1的表达，效率明显，见图4。
[0050] 实施例4 将293细胞铺于40个10cm培养皿中，待细胞长满，向每块板中加入Ad-TNFR1shRNA的P3病毒20μ1，待细胞完全病变后（4~7天），向每块板中加入约500μ1 10%NP-40以 裂解细胞，冻存于_80°C。
[0051] 提前1天从-80 °C冰箱中取出病毒，室温（或4°C)融解。收集细胞裂 解物，12000rpm离心10分钟，弃细胞碎片，收集上清。每100ml上清加入50ml PEG8000 (20%PEG8000, 2. 5MNaCl)，冰上放置1小时沉淀病毒（可适当延长）。
[0052] 12000rpm离心上述混合物20分钟，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml密度1. 10g/ml 的CsCl溶液中（溶剂为20mMTris-HCl，pH8. 0)，毒液呈粉红色。
[0053]CsCl梯度制备方法如下：加入2. 0ml密度1. 40g/ml的CsCl溶液（溶剂同上），缓 慢加入3. 0ml密度1. 30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml病毒悬浮液。20000rpm室温离心2 小时。
[0054] 收集密度在1. 30g/ml和1. 40g/ml之间的病毒条带至透析袋中（透析袋使用前以 10mMEDTA-Na2煮沸 10 分钟）。在透析缓冲液（50g蔗糖，10ml1MTris-HCl，pH8.0,2ml1M MgCl2定容至1L)中4°C搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。
[0055]取 10μ1 纯化后的Ad-TNFR1shRNA病毒液，加 90μ1ρΗ8· 0 的Tris-HCl稀释，以 100μ1ρΗ8· 0的Tris-HCl作为空白对照，用分光光度计测0D26。及0D26Q/0D2S。的值。
[0056] 0D26Q/0D2S。的正常范围为1. 20~1. 40,检测结果为1. 26,符合正常范围。
[0057] 病毒颗粒数（VP)与0D26。的换算公式为（0D26。）X稀释倍数X1. 1X1012VP/ml〇
[0058] 所测得0D26。为0· 148,体积1ml，总病毒颗粒数为1. 63X10 12VP。
[0059] 感染性滴度的检测采用改进的TCID5。法，测得总滴度为1X10 12PFU。
【主权项】
1. TNFR1基因重组腺病毒，含有干扰TNFR1基因表达的siRNA，所述siRNA具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中构建所述腺病毒所采用的穿梭 质粒为pHBAd-U6-GFP〇3. 根据权利要求2所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中所述干扰TNFR1基因表达的 siRNA连接于所述穿梭质粒的U6启动子之下。4. 根据权利要求2所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中构建所述腺病毒所采用的骨架 质粒为pHBAd-BHG。5. 根据权利要求2所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中构建所述腺病毒所采用的包装 细胞为293细胞。6. -种TNFR1基因重组腺病毒的构建方法，设计SEQIDNo. 1所示核苷酸序列 的siRNA，化学合成对应的SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3所示的shRNA互补单链目的基 因片段，退火得到所述目的基因片段的双链表达模版，与BamHI和EcoRI双酶切的载体 pHBAd-U6-GFP连接构建腺病毒穿梭质粒，再将所述腺病毒穿梭质粒与骨架质粒pHBAd-BHG 共转染293细胞，得到腺病毒Ad-TNFR1shRNA。7. 权利要求1所述TNFR1基因重组腺病毒作为阻断/减少TNFR1表达的工具药的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种TNFR1基因重组腺病毒，所述腺病毒含有SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列的干扰TNFR1基因表达的siRNA，将其连接于穿梭质粒pHBAd-U6-GFP的U6启动子之下，制备腺病毒穿梭质粒，再与骨架质粒pHBAd-BHG共转染293细胞，得到腺病毒Ad-TNFR1？shRNA。本发明的TNFR1基因重组腺病毒用于阻断/减少TNFR1的表达，阻断TNF通过该途径产生的生物学效应，从而设计工具药探索TNFR1在痛敏发生中的作用及胞内作用机制，并设计阻断炎性因子激活其受体的药物，以减弱受体激活后导致的痛敏作用。
【IPC分类】C12N15/861, A61K31/713, C12R1/93, C12N7/01, A61K48/00, A61P25/04
【公开号】CN105349502
【申请号】CN201510899026
【发明人】张宇, 王志华, 赵欣, 侯苗苗, 王媛, 秦霞, 秦国华, 马洋, 贾欣, 代杰琼, 陈建鸣, 陈晋源, 张策
【申请人】山西医科大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月9日