活性，对a几丁质和0几 丁质降解生成几丁二糖，具有一定的工业化生产前景。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明chiC基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0030] 图2为本发明chiC蛋白的SDS-PGAE检测结果，图中M:蛋白标准分子量；1~3均 为BL21/chiC-pET28aSDS-PGAE检测结果：1为破壁全菌；2为超声破碎上清液；3为破壁沉 淀；4~6均为BL21/pET28a检测结果：4为破壁全菌；5为破壁后上清液；6为破壁后沉淀；
[0031] 图3为本发明chiC蛋白纯化的SDS-PGAE检测结果，图中M:蛋白标准分子量； 1 :重组菌破壁后上清；2 :重组菌破碎后上清经镍柱纯化的流出液；3 :20mmol的咪唑洗脱 收集液；4 :150mmol的咪唑洗脱收集液；5 :300mmol的咪唑洗脱收集液；1~5上样量均为 10 y L；
[0032] 图4为chiC蛋白的标准曲线和标准曲线方程；
[0033] 图5为酶活标准曲线和标准曲线方程；
[0034] 图6为本发明中温度对几丁质酶chiC活性的影响；图中，A:几丁质酶chiC活性 最适温度；B:几丁质酶chiC温度稳定性；
[0035] 图7为本发明中pH对几丁质酶chiC活性的影响；图中，A:几丁质酶chiC最适pH; B :几丁质酶chiCpH稳定性；
[0036] 图8为本发明chiC蛋白的动力学常数分析；
[0037] 图9为本发明chiC蛋白的底物特异性；
[0038] 图10为本发明chiC蛋白降解产物分析；图中，A:a几丁质；B:0几丁质。
【具体实施方式】
[0039] 下面通过实施例对本发明做进一步描述，但不用于限制本发明的保护范围。实施 例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用到实验原料主要包括：大肠杆菌感受 态细胞 E. coli DH5 a、E. coli BL21 (DE3)，pMD19-T Simple 购自 TaKaRa 公司；T4DNA 连接 酶、限制性内切酶BamHI和Xhol、蛋白质分子量标准购自TaKaRa公司；Ni2+-NTA树脂购自 Novagen公司；奸壳a型几丁质、鱿鱼|3型几丁质购自Sigma公司；IPTG、卡那霉素、丙稀 酰胺十二烷基磺酸钠、甘氨酸购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其它常用化学试剂 均为市售分析纯。
[0040] 实施例1 chiC基因的扩增
[0041] 本发明根据NCBI上已报道的假交替单胞菌几丁质酶的基因序列设计引物，通过 聚合酶链式反应（PCR)的方法获得了假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. DL-6)几丁质 酶chiC的保守序列。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏日期：2013年12月13日，其保藏编号为CGMCC No. 8580。
[0042] 利用PCR技术以假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. DL-6)菌株的基因组DNA 为模板，采用Primer5.0软件设计引物，分别为：上游引物chiC-F(SEQ ID No. 2):5'-CCC匹 ATCCGGCGCCTTCTACACCAAGCATTAATTGG-3'设计有 BamHI 酶切位点；下游引物 chiC_R(SEQ ID No. 3) :5' -CCGCTCGAGAAGTGCTAACCATACATCGG-3' 设计有 XhoI 酶切位点。
[0043] PCR反应体系：
【主权项】
1. 一种几丁质酶基因chiC，为SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。
2. -种如权利要求1所述的几丁质酶基因chiC的扩增方法，其特征在于，以假交替单 胞菌株（Pseudoalteromonassp.DL-6)基因组DNA为模板，以引物对chiC-F和chiC-R进 行PCR扩增；上游引物chiC-F:5' -CCCGGATCCGGCGCCTTCTACACCAAGCATTAATTGG-3'，下游引 物chiC-R:5' -CCGCTCGAGAAGTGCTAACCATACATCGG-3'。
3. -种如权利要求1所述的几丁质酶基因chiC表达的几丁质酶。
4. 根据权利要求3所述的几丁质酶，其特征在于，具有如SEQIDNo. 4所示的氨基酸序 列。
5. -种几丁质酶chiC的表达与纯化方法，其特征在于，步骤如下： (1) 以PCR方法扩增如SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列； (2) 构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-chiC:将PCR扩增的DNA序列和pMD19-Tsimple 载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接纯化 的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-chiC; (3) 构建大肠杆菌重组表达载体pET28a-chiC:将克隆载体pMD19-T-chiC质粒转化 至E.coliDH5a，得到阳性转化子，用限制性内切酶BamHI和XhoI将chiC基因片段从 pMD19-T-chiC质粒上切下，连接到pET-28a表达载体上，转化至E.coliBL21 (DE3)，通过菌 落PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子，得到重组表达载体pET28a-chiC; ⑷构建大肠杆菌重组表达菌株BL21 (DE3) -pET28a-chiC:将重组表达载体pET28a-chiC质粒转化至E.coliBL21 (DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株 BL21(DE3)-pET28a-chiC； (5) 体外诱导表达：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-chiC接入含卡那霉素的LB 培养基中，于37°C过夜培养14h后，按1%的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中，当 OD6tltlmi= 0. 6-0. 8,加入终浓度为 0. 2mM的IPTG，于 30°C，IOOrpm低温诱导 6h; (6) 几丁质酶chiC的纯化：体外诱导表达结束后于4°C，5, 000Xg离心5min收集菌体， 用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎三次，每次 30s，每次间隔lmin，然后于4°C，12,OOOXg离心20min收集上清液，即为粗蛋白，粗蛋白用 Ni2+-NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质酶chiC。
6. -种如权利要求3所述的几丁质酶在降解含几丁质底物中的应用。
7. 根据权利要求6所述的几丁质酶chiC的应用，其特征在于，适宜的酶解条件为：酶 解温度30 °C，pH值为9.0。
8. 根据权利要求6所述的几丁质酶chiC的应用，其特征在于，所述的几丁质酶chiC对 胶体几丁质具有高降解活性可达I. 569±0. 017U/ml。
9. 根据权利要求6所述的几丁质酶chiC的应用，其特征在于，所述的几丁质酶chiC降 解a几丁质和0几丁质生成几丁二糖。
10. -种具有几丁质酶的功能的广品，具有如SEQIDNo. 4所不的氣基酸序列。
【专利摘要】本发明涉及几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用，属于基因工程技术领域。本发明以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)为研究对象，首次克隆出具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的几丁质酶基因chiC，并获得了高活性几丁质酶，其制备方法简单，生产成本低，产品易保存，适宜的酶解温度是30℃，酶解pH值为9.0，对胶体几丁质具有高降解活性可达1.569±0.017U/ml，几丁质酶chiC降解α几丁质和β几丁质生成几丁二糖，具有工业化生产前景。CGMCC No.858020131213
【IPC分类】C12N9-42, C12N15-10, C12N15-56, C12P19-26
【公开号】CN104762307
【申请号】CN201510219342
【发明人】王晓辉, 张庆芳, 迟乃玉
【申请人】大连大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月30日