一种低温碱性磷脂酶a的制作方法

专利名称：一种低温碱性磷脂酶a的制作方法
技术领域：
本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，本发明涉及一种编码耐冷居泉沙雷氏菌的低温碱性磷脂酶A1的基因序列及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株、衍生物。
背景技术：
磷脂酶是水解磷脂的酯键的酶。广泛存在于真核生物和原核生物中，影响磷脂的分解代谢、生物膜的形成和重组，并且磷脂酶也涉及信号的级联。根据磷脂酶分子攻击的键的位置，已知有几种类型的特异性不同的磷脂酶，其中磷脂酶A1(Phospholipase A1，3.1.1.32，简称PLA1)催化磷脂第一位酯酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。PLA1可以在细胞内，也可以在细胞外；是膜结合的或者是可溶的。
磷脂酶在工业中有多种应用，包括应用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油/水混合物的乳化；磷脂酶还可以被用于植物油加工过程中的油的脱胶。此外，磷脂酶在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有用。低温磷脂酶A1的最适酶活温度一般在40℃以下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点，因而应用于植物油脱胶和修饰磷脂乳化剂等工业生产中可简化生产工艺、节能降耗、提高产品质量、保护环境、降低生产成本，有着中温磷脂酶A1无法取代的优越性。
磷脂酶A已经从动物、植物、真菌和细菌等许多不同的来源中获得。来自于动物组织如大鼠肝脏(Biochemistry，104447～4450，1971)、心、脑(LipidRes，26104～114，1985)和人脑(Biosci.Biotechnol.Biochem，63(5)820～826，1999)以及牛脑(Biochem.Res.Commun，1951272～1279，1993)的细胞内磷脂酶A1已被部分纯化。通过凝胶过滤测得这些胞内磷脂酶A1的分子量大于150kDa，它们在动物细胞中的含量很低。磷脂酶A最早是从蛇毒液和猪胰液中获得(Journal of Biotechnology，72103～114，1999)。来源于猪胰腺(Biochem.Res.Commun，1951272～1279，1993)和Agkistrodon HalysBlomhoffii毒液的磷脂酶A的热稳定性比较高(Biochim.Biophys.Acta，159103，1968)。马铃薯块茎储藏蛋白(Patatins)的作用相当于磷脂酶(Eur.J.Biochem，2685037～5044，2001)。与膜结合的微生物磷脂酶A已报道的有两例E.coli的DR-磷脂酶A抗表面活性剂SDS，被Ca2+和Mg2+激活，被Fe3+抑制(J.Biochem，961645～1653，1984；J.Biochem，961655～1664，1984)；另一种来源于E.coli与细胞膜结合的PLA1，在SDS和一些有机溶剂中很稳定，最适pH为8.4，在pH6.5可失去一半的酶活，酶反应需要Ca2+(Biochemistry，104447～4456，1971)。来源于动物组织的磷脂酶A和与膜结合的微生物磷脂酶A来源都很有限，且价格昂贵，故微生物胞外磷脂酶A1的研究越来越受到重视。有关微生物胞外磷脂酶A1的酶学性质的报道仅一篇，Kim报道的一株沙雷氏菌Serratia sp.MK1产生最适反应温度为50℃，最适pH为8.5，在70℃保温1h仍然很稳定的磷脂酶A1(Journal ofMicrobiology and Biotechnology，6(6)407～413，1996)。到目前为止，国内外尚未见有关专利和文献报道微生物低温碱性磷脂酶A1。
目前，国内外研究较多的是海洋、极地环境下的低温微生物及其低温酶，而对于内陆高寒地区、冰川冻土的研究较少。低温微生物产生的低温磷脂酶A1具有优良的低温活性，所以研究、开发低温磷脂酶具有重要意义。此外，有关既产生低温磷脂酶又产生脂肪酶的沙雷氏菌的研究，国内外尚未见报道。

发明内容
本发明是针对目前国内外尚未有微生物低温磷脂酶A1的报道，及对于内陆高寒地区、冰川冻土的研究较少，尚没有从冰川冻土中分离到的低温微生物资源涉及的酶基因克隆到受体菌，由受体菌在其培养条件下产生磷脂酶A1的报道的现状。
本发明提供一种低温磷脂酶A1产生菌株，编号为xjF1，其具有生产低温碱性磷脂酶A1的优良特性，经微生物学分类与鉴定，属于居泉沙雷氏菌株(Serratia fonticola)。
本发明同时提供了一种新型磷脂酶A1及其结构基因、重组质粒和重组菌体。该基因表达产物磷脂酶A1在低温条件下显示活性，应用于磷脂乳化剂的修饰、油脂精练等工业过程中可节能降耗，简化生产工艺。同时本发明提供了一种制备低温磷脂酶A1的方法，就是通过培养耐冷居泉沙雷氏菌xjF1，或含有本发明的低温磷脂酶A1编码基因的工程菌获得低温磷脂酶A1。
新疆天山冻土属于我国高海拔多年冻土，分布于乌鲁木齐河源天山冰川站地区海拔3250m以上区域，年平均地温为-4.95℃，冻土微生物被描述为“幸存着的群落”。本发明从天山冻土中分离耐冷菌，筛选出产低温酶的菌株，其中耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1产生在低温条件下具有良好的活性和稳定性的低温磷脂酶A1，其分泌的磷脂酶A1最适作用温度为20～35℃，最适pH9.0。这不仅为研究极端环境下的生命特征和适应机制提供了理想的材料，而且对于寻找具有独特性质的低温酶，实现低温酶产业化具有重要意义。
本发明从居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1中获得磷脂酶A1基因，它包含两个开放阅读框plA和plS。其中plA基因被证实编码磷脂酶A1，该基因全长963bp，编码320个氨基酸，酶蛋白理论分子量为33.9kDa。plS基因编码磷脂酶A1的辅助蛋白，该基因包含756个核苷酸，编码251个氨基酸，理论分子量为27.7kDa。
利用现有分子生物学方法可以得到不同的表达载体和细胞系。即获得含有本发明基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌；获得含有本发明基因的毕赤酵母重组质粒以及重组酵母。
本发明具体提供了一种低温碱性磷脂酶A1生产菌株，命名为xjF1，其能够产生低温碱性磷脂酶A1。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey’sManual of Systematic Bacteriology》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对xjF1菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定xjF1菌株为沙雷氏菌属(Serratia)中的成员。16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明xjF1菌株为居泉沙雷氏菌株(Serratiafonticola)，可简称S.fonticola xjF1。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期是2007年3月12日，保藏号是CGMCC No.1971。该菌株最适生长温度范围是20～30℃；优先生长于LB培养基表面(培养基组分[g/L]为蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂粉15)，30℃下培养12小时可获得单菌落。菌落稍大于E.coli，呈白色、半透明、粘稠状。菌落表面凸起、边缘整齐。该菌株具有周鞭毛可帮助其运动，兼性厌氧。细胞短杆状，两端圆，长度约0.9-2.0微米，直径约0.5-0.8微米，为革兰氏阴性菌。发酵并利用麦芽糖、卫矛醇。胞外酶可以水解DNA，不水解脂肪、脲和明胶，发生硝酸和亚硝酸还原，VP反应、吲哚产生实验均呈阴性。通过BLAST同源比对，菌株xjF1的16SrRNA序列与S.fonticola种的16SrRNA序列的相似性最高，S.fonticola xjF1的G+C克分子％为52.5％。
本发明通过S.fonticola xjF1发酵获得磷脂酶和脂肪酶。该磷脂酶最适作用温度为35℃，4℃时测定仍有一定的酶活力，这种低温活性在工业上具有很重要的开发潜能。通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，低温磷脂酶发酵酶活达17.5U/mL，脂肪酶发酵酶活达4.0U/mL。本发明通过从S.fonticola xjF1中分离到的脂肪酶基因片段和磷脂酶基因，进一步确定了菌株xjF1产生两种酶磷脂酶和脂肪酶。
本发明从耐冷居泉沙雷氏菌(S.fonticola xjF1)中提取总DNA。根据NCBI上已公布的细菌低温脂肪酶和磷脂酶基因序列的保守区，设计了一对特异性引物，以S.fonticola xjF1的全基因组DNA为模板，用PCR方法扩增到约750bp的磷脂酶A1基因片段。根据磷脂酶A1基因的部分序列，又设计了嵌套的特异性引物，利用TAIL-PCR技术扩增得到750bp的部分基因序列的侧翼序列，最后通过序列拼接获得了完整的磷脂酶A1基因的核苷酸序列。测序结果表明，目的基因的核苷酸序列含有两个开放阅读框(plA和plS)。其中plA基因具有序列表中SEQ No.1所示的核苷酸序列，全长963bp，其中1～54bp编码低温碱性磷脂酶A1信号肽序列，55～963bp编码低温碱性磷脂酶A1成熟肽。plS基因具有序列表中SEQ No.3所示的核苷酸序列，由756个核苷酸组成，编码一个由251个氨基酸组成的磷脂酶A1的辅助蛋白，是具有序列表中SEQ No.4氨基酸序列的蛋白质。
本发明涉及的磷脂酶A1是一种低温碱性磷脂酶A1，是具有序列表中SEQ No.2氨基酸序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。序列表中的SEQ No.2由320个氨基酸残基组成，其中自C末端1～18氨基酸为低温碱性磷脂酶A1信号肽序列，19～320氨基酸为低温碱性磷脂酶A1成熟肽序列，193～197氨基酸(-Gly-X1-Ser-X2-Gly-)为脂肪酶中最保守的、在部分磷脂酶中也有很高的保守性的序列。本发明涉及的磷脂酶A1是一新型的磷脂酶A1，其氨基酸序列与其它已报道的磷脂酶A1的氨基酸序列比较，相似性在59％～70％。plA基因的氨基酸序列与粘质沙雷氏菌的磷脂酶A1基因的同源性为70.4％。plS基因的氨基酸序列与沙雷氏菌Serratia sp.MK1的辅助蛋白基因的同源性为62％。应当指出的是，对本发明的磷脂酶A1基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而本发明也包括与SEQ No.2所示的氨基酸具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有磷脂酶A1的活性的功能类似物。
分析居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因的核苷酸序列，可以看到plA和plS是两个重叠基因，plS的起始密码子位于plA的终止密码子上游5bp的位置，这两个可读框可以单独进行转录。为了探讨辅助蛋白基因plS在磷脂酶A1基因的表达中的作用，分别构建了含有两个基因(plA和plS)的大肠杆菌重组质粒pET-PL-AS和含有一个基因(plA)的大肠杆菌重组质粒pET-PL-A。重组大肠杆菌经IPTG诱导后，分别取培养液和超声波破碎后得到的细胞周质测定磷脂酶A1活力。实验结果表明含有两个基因的重组大肠杆菌BL21/pET-PL-AS和含有一个基因的重组大肠杆菌BL21/pET-PL-A培养液中的磷脂酶A1活力均低于细胞周质中的，表明磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的表达产物绝大部分位于细胞周质中，只有少量在培养液中。同时还发现重组菌BL21/pET-PL-AS的磷脂酶A1的活力明显高于重组菌BL21/pET-PL-A，表明辅助蛋白基因plS能够提高plA基因在大肠杆菌中的表达量。将所有的可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明培养液无明显的蛋白条带；含有两个基因的重组菌和含有一个基因的重组菌在分子量约35kDa的位置均出现了特异的表达蛋白条带，而含有空质粒的对照菌在同一位置上没有特异性的条带。由以上的酶活性测定结果和电泳分析结果可以得出结论居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因能够在大肠杆菌中进行有效的表达。
同时，通过PCR方法分别扩增含本发明的两个基因(plA和plS)和一个基因(plA)的DNA片段(去除编码信号肽的核苷酸序列后的基因序列)，以正确的可读框插入毕赤酵母表达载体pPIC9，构建了两个毕赤酵母重组质粒pPIC-PL-AS和pPIC-PL-A。用本领域熟知的电转化方法将重组质粒导入毕赤酵母GS115细胞中，获得两个重组酵母GS115/pPIC-PL-AS和GS115/pPIC-PL-A。摇瓶发酵试验的结果表明以上构建的两个重组酵母的发酵液上清中的磷脂酶A1活力比较接近，表明plS基因没有提高plA基因在毕赤酵母中的表达量，plS基因在毕赤酵母表达磷脂酶A1中的作用，还有待于进一步探讨。
重组酵母的发酵上清液通过透析、Sepharose Q Fast Flow柱层析和超滤管浓缩获得分子量为35kDa，纯度提高8.5倍的电泳均一的磷脂酶A1，这样得到的酶制品比活力达到23.13U/mg。用以上的35kDa蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后的凝胶放在蛋黄固体琼脂平板上，37℃反应16h左右可看到平板上出现白色沉淀条带。与SDS-PAGE凝胶上显示的条带比较，发现条带的位置和数目相同，可以确定以上纯化得到的35kDa蛋白确为磷脂酶。
在不同温度下按常规法测定磷脂酶A1活力，由温度-酶活力曲线可以看到毕赤酵母表达的磷脂酶A1的最适作用温度范围为20～35℃，在此范围内酶活力可保持在85％以上。10℃保温30min后仍具有70％的酶活力，而55℃处理30min酶活力完全丧失。由60℃下酶活力变化曲线可以看出在60℃下热处理10min，可导致酶活力损失86％，表明重组磷脂酶A1对热较敏感，是典型的低温磷脂酶。按常规法测定酶活力。由pH-酶活力曲线和pH稳定性曲线可以看到重组磷脂酶A1的最适pH值为9.0；在pH6～10的范围内酶活力维持在75％以上。可见该酶为低温碱性磷脂酶。实验证明仅Ca2+对酶有激活作用，其它测试的金属离子和化学试剂对酶都有不同程度的抑制作用。酶学性质的测定结果证明重组酵母表达低温碱性磷脂酶A1活性，其在低温条件下具有良好的活性和稳定性。该重组磷脂酶A1的最适反应温度为35℃，最适反应pH为9.0，在作用温度为20～35℃、pH6～10可水解卵磷脂产生溶血磷脂和脂肪酸。
本发明涉及一种新的低温碱性磷脂酶A1，在低温下具有高的催化效率，适用于油脂精练和其他相关工业，可简化生产工艺、节能降耗。构建生产低温碱性磷脂酶A1的工程菌为实现低温酶产业化奠定了坚实的基础。从耐冷居泉沙雷氏菌xjF1中获得的磷脂酶A1基因由两个开放阅读框plA和plS组成。用本领域技术人员所公知的重组DNA技术制备含有plA单基因的重组质粒和含有plA、plS双基因的重组质粒。本发明的这些重组质粒用本领域熟知的方法转化大肠杆菌和毕赤酵母，使重组大肠杆菌和重组酵母表达磷脂酶A1。因此本发明同时提供了一种通过遗传工程和分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株在其它培养条件产生本发明涉及的磷脂酶A1。
按照本发明所述的磷脂酶A1，具有如下特性1.耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1或其它衍生菌产生。衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株。
2.具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列，编码磷脂酶A1。
3.具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列，是磷脂酶A1。
4.含有SEQ NO.1和SEQ NO.3所示的核苷酸序列的重组质粒pET-PL-A、pET-PL-AS及重组大肠杆菌菌株BL21/pET-PL-A、BL21/pET-PL-AS。
5.含有SEQ NO.1和SEQ NO.3所示的核苷酸序列的重组质粒pPIC-PL-A、pPIC-PL-AS及重组毕赤酵母GS115/pPIC-PL-A、GS115/pPIC-PL-AS。
6.具有磷脂酶A1活性，作用温度20～35℃，pH9.0，分子量35000道尔顿。
本发明涉及的DNA序列，除了编码本发明涉及的磷脂酶A1的SEQ NO.1外，还应当包括编码对本发明的磷脂酶A1基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明所述的DNA核苷酸序列。因而本发明也包括编码与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有磷脂酶A1活性的功能类似物的DNA核苷酸序列。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果1.定向筛选到一株磷脂酶A1产生菌-居泉沙雷氏菌xjF1，并克隆了其磷脂酶A1基因plA和plS。
2.含有两个基因(plA和plS)的重组大肠杆菌的磷脂酶活力明显高于含有一个基因(plA)的重组大肠杆菌，表明辅助蛋白基因plS能够提高plA基因在大肠杆菌中的表达量。
3.构建重组大肠杆菌BL21/pET-PL-AS和重组毕赤酵母GS115/pPIC-PL-AS，实现了磷脂酶A1基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的成功表达，经摇瓶培养磷脂酶A1的表达量分别为7.1U/mL和41.8U/mL。
4.重组磷脂酶A1经分离、纯化和酶学特性的研究，证明是典型的低温碱性磷脂酶A1。该酶的最适pH为9.0，最适作用温度范围为20～35℃，55℃保温30min酶活力完全丧失。


图1为居泉沙雷氏菌xjF1的系统进化树。
图2为PCR扩增居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因片段的琼脂糖凝胶电泳。
其中1代表双引物扩增；2和3代表分别用两个单引物进行的PCR扩增；4代表1kb DNA分子量标准。
图3A为居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因的侧翼序列的TAIL-PCR扩增产物。其中II、III分别为TAIL-PCR反应中第2次反应产物和第3次反应产物，1-4显示用4个不同的随机简并引物扩增得到的PCR产物。B为PCR扩增居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1全长基因。
图4为大肠杆菌重组质粒pET-PL-AS和pET-PL-A的物理图谱。
图5为在大肠杆菌中表达的磷脂酶A1的SDS-PAGE。其中1代表蛋白标准分子量；2代表含空质粒的大肠杆菌对照菌；3代表含重组质粒pET-PL-AS的大肠杆菌的细胞周质部分；4代表含重组质粒pET-PL-A的大肠杆菌的细胞周质部分；箭头示35kDa的表达蛋白条带。
图6为毕赤酵母重组质粒pPIC-PL-AS和pPIC-PL-A的物理图谱。
图7为在毕赤酵母中表达的磷脂酶A1的SDS-PAGE。其中箭头示分子量约35kDa的重组磷脂酶A1的表达蛋白条带。
图8为纯化后的重组磷脂酶A1的SDS-PAGE电泳分析。其中M代表蛋白分子量标准；1代表含重组质粒pPIC-PL-AS的毕赤酵母发酵上清液；2代表纯化后的重组磷脂酶A1。
图9为磷脂酶A1的活性条带印迹实验。其中1代表活性染色；2代表考马斯亮蓝染色。箭头示重组磷脂酶A1的表达蛋白条带。
图10A为温度-酶活力曲线；B为60℃下酶活力变化曲线。
图11A为pH-酶活力曲线；B为pH稳定性曲线。
图12为金属离子和相关化学试剂对重组磷脂酶A1活力的影响。
具体实施例实施例1低温碱性磷脂酶A1产生菌的筛选1.菌种的分离筛选采集新疆天山一号冰川冻土，涂布于含有0.1％(NH4)2SO4，0.1％K2HPO4，1％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％FeSO4·7H2O，以1∶3比例混合的橄榄油和聚乙烯醇乳化液，2％琼脂粉的油脂同化培养基上，20℃下培养24小时筛选到3株产生脂肪酶的菌株。挑选其中的细菌菌落涂布于蛋黄+TYSPN固体琼脂培养基(4％葡萄糖，1％蛋白胨，5％酵母提取物，无菌蛋黄液，2％琼脂粉，pH7.0)。菌株xjF1在油脂同化平板上形成黄色变色圈、在蛋黄+TYSPN固体琼脂平板上形成不透明、云雾状的晕圈。将菌株xjF1接入磷脂酶产酶培养基(5.4％蛋白胨，2.6％酵母提取物，1.512％NaH2PO4·12H2O，0.3％K2HPO4，0.05％NaCl，0.0246％MgSO4·7H2O，0.00147％CaCl2，5×10-5％FeSO4·7H2O，0.1143％(NH4)2HPO4，0.5％木糖)和脂肪酶产酶培养基(1.5％豆饼粉，3％玉米浸出液，0.5％葡萄糖，0.75％橄榄油，pH8.0)进行酶活性测定。实验结果表明，菌株xjF1既有磷脂酶A1的活性，又有脂肪酶活性，它在不同的培养条件下可产生磷脂酶和脂肪酶。
将菌株xjF1接种至LB培养基，分别于10℃、20℃、30℃和37℃下培养，每天测量菌落直径，比较不同温度下菌株的生长情况，结果见表1，由表1可知菌株xjF1的最适生长温度范围在20～30℃，属于耐冷菌。耐冷菌株xjF1经摇瓶试验测得磷脂酶A1活力为17.5U/mL，且在4℃测定仍具有一定的酶活力，说明菌株xjF1产生低温磷脂酶A1。
表1 菌株xjF1的生长菌落直径单位cm

2.菌种鉴定(1)生理生化检测根据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey’s Manual of SystematicBacterio-logy》)第九版对菌株xjF1的形状、大小、生理生化反应进行检测，产生本发明的低温碱性磷脂酶A1的微生物菌种Serratia fonticola xjF1的生物学特性如表2所示表2 菌株xjF1的生物学特性

采用反相高效液相色谱法进行G+C含量测定，具体方法参照林万明的《细菌分子遗传学分类鉴定法》。本发明的低温碱性磷脂酶A1的产生微生物S.fonticola xjF1的G+C克分子％为52.5％。
(2)16SrRNA序列分析以S.fonticola xjF1的基因组DNA为模板，16sRNAEP15’-CCGGATCCGTCGACAGAGTTTGATCTTGGCTCAG-3’和16sRNAEP25’-CCAAGCTTCTAGACGGITACCTTGTTACGACTT-3’为引物，进行PCR扩增，获得的16SrRNA序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，结果本发明的低温碱性磷脂酶A1产生菌与Serratia fonticola UTAD54相似性最高为99％，表明二者的亲缘关系最近。S.fonticola xjF1的16SrRNA基因序列如下1GCGGCAGGCC TAACACATGC AAGTCGAGCG GTAGCACAGG GAGCTTGCTCCTGGGTGACG AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA TGTCTGGGAA ACTGCCCGAT101 GGAGGAGGGG GATAACTACT GGAAACGGTA GCTAATACCG CATAACGTCTTCGGACCAAA GTGGGGGACC TTCGGGCCTC ACACCATCGG ATGTGCCCAG201 ATGGGATTAG CTAGTAGGTG AGGTAATGGC TCACCTAGGC GACGATCCCTAGCTGGTCTG AGAGGAGGAT GACCAGCCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC301 CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGCACAA TGGGCGCAAGCCTGATGCAG CCATGCCGCG TGTGTGAAGA AGGCCTTCGG GTTGTAAAGC401 ACTTTCAGCG AGGAGGAAGG GTTCAGTGTT AATAGCACTG TTCATTGACGTTACTCGCAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT501 ACGGAGGGTG CAAGCGTTAA TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGCAGGCGGTTTGTT AATGCAGATG TGAAATCCCC GAGCTTAACT TGGGAACTGC601 ATTTGAAACT GGCAAGCTAG AGTCTTGTAG AGGGGGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATCTGGAGG AATACCGGTG GCGAAGGCGG701 CCCCCTGGAC AAAGACTGAC GCTCAGGTGC GAAAGCGTGG GAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCTGTAA ACGATGTCGA CTTGGAGGTT801 GTGCCCTTGA GGCGTGGCTT CCGGAGCTAA CGCGTTAAGT CGACCGCCTGGGGAGTACGG CCGCAAGGTA AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC901 AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGATG CAACGCGAAG AACCTTACCTACTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA TGGATTGGTG CCTTCGGGAA1001 CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTA TCCTTTGTTG CCAGCGCGTC
1101 ATGGCGGGAA CTCAAGGAGA CTGCTGGTTG ATAAACCGGA GGAAGGTGGGATGACGTCAA GTCATCATGG CCCTTTACGA GTAGGGCCTA CACCACGTGC1201 TACAT各项实验结果都表明菌株xjF1为居泉沙雷氏菌菌株(Serratia fonticola)中的成员，根据相邻连接方法构建系统进化树，参见附图1。
实施例2S.fonticola xjF1产生的酶的活力测定低温碱性磷脂酶A1活性测定采用KOH电位滴定法(即改良的Kawauchi法)。底物卵磷脂的配制也是参照Kawauchi法(Biochimica et Biophysica acta，142～159，1971)。卵磷脂500mg，溶于10mL乙醚中，加入双蒸水20mL混匀，65℃水浴25min，以除去乙醚，再加入双蒸水20mL，置于超声波发生器中冰浴乳化40min，加入1mol/L NaCl 10mL，0.01mol/L CaCl210mL，0.01mol/L脱氧胆酸钠10mL，搅拌溶解后用蒸馏水定容至100mL，最后用1.0mol/L NaOH将pH值调至8.2～8.5，置于4℃保存，时间不超过48h。每次测定取底物溶液10mL，待测酶液200uL，37℃反应30min后，加入95％乙醇6mL终止反应，以5mmol/L KOH标准溶液滴定由酶释放出的游离脂肪酸，至pH8.2为滴定终点。
磷脂酶活力(U/mL)＝(V1-V2)/V×N×1000式中V1-待测样品消耗的KOH体积(mL)V2-空白对照消耗的KOH体积(mL)V-加入的待测酶液体积(200uL)N-KOH的摩尔浓度(5mmol/L)脂肪酶活性测定参照中华人民共和国轻工业部部颁标准GB/T1803-93(2002)采用NaOH滴定法。发酵液经12000rpm离心5min，以上清液作为粗酶液进行酶活力的测定。于100mL具塞三角瓶中分别加入5mL0.025mol/L磷酸缓冲液和4mL聚乙烯醇橄榄油乳化液，置于37℃水浴中保温5min，然后在样品瓶中加入1mL粗酶液，从加入酶液开始精确计算时间，继续保温15min，取出后立即加入95％乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示剂3滴，用0.05N NaOH标准溶液滴定至溶液微红色并保持30sec不褪为其终点，记下消耗的NaOH的量。脂肪酶的活力单位采用国际单位(IU)在上述反应条件下，每分钟释放1umol脂肪酸的酶量定义为-个酶活力单位。酶活力的计算公式如下脂肪酶活力(U/mL)＝10/3×(B-A)×n式中B-待测样品消耗的NaOH体积(mL)A-空白对照消耗的NaOH体积(mL)n-稀释倍数实施例3S.fonticola xjF1的磷脂酶A1基因的克隆1.居泉沙雷氏菌xjF1基因组DNA的提取用本领域技术人员已知的常规方法制备居泉沙雷氏菌xjF1的基因组DNA。居泉沙雷氏菌xjF1在LB液体培养基中振荡培养16h后，离心弃上清。取50mg菌泥加500uL无菌水清洗。离心后的沉淀重悬于溶菌酶混合液，37℃温育30min，再加入10％SDS至终浓度为2％。12000rpm离心5min后的上清用等体积酚、酚∶氯仿和氯仿依次抽提。取上层溶液加入异丙醇，室温沉淀20min，12000rpm离心20min，弃上清，DNA沉淀用无菌水溶解，-20℃保存备用。
2.PCR扩增磷脂酶A1基因片段根据NCBI上已公布的细菌磷脂酶和脂肪酶的基因序列的保守区设计了-对特异性引物(5B5’-TGGCGTTACTGGCCAAGGACGT-3’和3b5’-CATGGTTTTTGCTCCGCCATCG-3’)，以居泉沙雷氏菌xjF1基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃变性5min，1个循环；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
将PCR扩增出的大小约为750bp的DNA片段连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，通过蓝白斑筛选出阳性克隆子，再通过单酶切进行插入片段大小的验证，最后用SP6和T7引物进行序列测定。测序结果表明，扩增的750bp的DNA片段确为磷脂酶A1基因片段，参见附图2。
3.利用TAIL-PCR技术获得磷脂酶A1全长基因根据已获得的磷脂酶A1部分基因序列设计了6个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物T1-T6T1 5’-CTCATGCGCGAAAAGCCCTC-3’、T2 5’-GAAAGCCAGCACATAGTGCTGC-3’、T3 5’-GCAATCGCCACGGCATGATTG-3’、T4 5’-CCGATCATACTCTGAACCGTTTCG-3’、T5 5’-GATCGCAGCATGACGGCACATG-3’T6 5’-GATGGCGGAGCAAAAACAGAGAAAAGAACAT-3’)它们分别与11个随机简并引物(AD1-AD11)组合，以居泉沙雷氏菌xjF1基因组DNA为模板，进行TAIL-PCR反应。经过3次连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性扩增目标片段，最后回收第3次PCR反应的产物，直接送上海博亚生物技术公司测序。测序结果表明，引物T3、T2和T1分别与AD引物组合，通过分级反应扩增得到的大小约为700bp和900bp的特异性片段都包含了750bp的已知序列和起始密码子ATG所处的5’端序列。只改变不对称温度循环中的退火温度，使用特异性引物T4、T5和T6进行的TAIL-PCR扩增得到1050bp和1150bp长度不同的特异性产物。经序列测定，我们发现扩增的这些特异性片段都包含了750bp的已知序列和终止密码子TGA所处的3’端序列。TAIL-PCR产物分析的结果参见附图3A。将750bp已知序列和用TAIL-PCR方法扩增得到的750bp已知序列的两侧序列进行拼接，就获得了完整的磷脂酶A1基因的核苷酸序列，参见附图3B。
实施例4磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的诱导表达1.大肠杆菌重组质粒的构建以S.fonticola xjF1的基因组DNA为模板，采用引物plAS-f(5’-GGAGATCTTATGAGTTTGCCTTTGAG-3’，含BglII酶切位点)和plA-r(5’-TAGCGGCCGCTTAGGCATTCGCCTT-3’，含Not I酶切位点)，PCR扩增含有plA基因的DNA片段。反应条件为95℃变性3min，1个循环；94℃变性30sec，50℃复性30sec，72℃延伸2min，32个循环，再进行72℃延伸10min。回收PCR产物用BglII/NotI双酶切，酶切片段回收纯化后与经BamH I/Not I双酶切的pET-22b(+)载体连接，获得大肠杆菌重组质粒pET-PL-A，参见附图4，转化大肠杆菌BL21，提取质粒DNA，酶切鉴定后获得阳性克隆BL21/pET-PL-A。
为了考察辅助蛋白基因(plS)在磷脂酶A1原核表达中的作用，以plAS-f和plAS-r(5’-TTTAAGCTTTCAAGGCTGAGTATAGTGC-3’，含HindIII酶切位点)为引物，PCR扩增包含plA和plS两个基因的DNA片段。PCR反应条件95℃变性3min，1个循环；94℃变性30sec，54℃复性30sec，72℃延伸2min10sec，32个循环，再进行72℃延伸10min。回收PCR产物用BglII/HindIII双酶切，酶切片段回收纯化后与经BamH I/HindIII双酶切的pET-22b(+)载体连接，获得重组质粒pET-PL-AS，参见附图4，转化大肠杆菌BL21，提质粒和进行酶切鉴定，获得阳性克隆BL21/pET-PL-AS。
2.磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的诱导表达重组大肠杆菌在含有100ug/mL氨苄的LB培养基中37℃振荡培养过夜，以1％接种量转接于8mL的LB培养基中(含氨苄)，200rpm培养至OD600在0.6-0.8，再加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，继续诱导培养4h后，离心收集菌体和上清液。上清液用于酶活性测定，菌体用50mmol/LTris-Cl(pH8.0)缓冲液悬浮，采用超声波法破碎。破碎后的菌体再离心获得的上清液用于酶活性测定和SDS-PAGE分析。酶活性测定结果见表3。
表3 重组大肠杆菌的酶活性测定结果

由表3可知含有两个基因的重组大肠杆菌BL21/pET-PL-AS和含有一个基因的重组大肠杆菌BL21/pET-PL-A菌液上清中的磷脂酶活力均低于细胞周质中的，表明磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的表达产物绝大部分位于细胞周质中，只有少量在上清液中。由表3我们还可以看到无论是菌液上清还是细胞周质中，含有两个基因的重组大肠杆菌的磷脂酶活力都明显高于含有一个基因的重组大肠杆菌，表明plS基因能够提高plA基因在大肠杆菌中的表达量。
所有的可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳分析参见附图5，结果表明上清液无明显的蛋白条带，而周质部分有明显的表达蛋白条带。重组大肠杆菌BL21/pET-PL-AS和BL21/pET-PL-A经IPTG诱导后在分子量约35kDa的位置均出现了特异的蛋白条带，而含有pET-22b(+)空质粒的对照菌经IPTG诱导后在同一位置上没有特异的条带。以上的电泳分析结果和酶活性测定结果均证明磷脂酶A1基因在大肠杆菌中能有效地表达。
实施例5磷脂酶A1基因在毕赤酵母中的表达与分泌1.毕赤酵母重组质粒的构建以pplAS-f(5’TATACGTAGCTTCGTCACTCCCG-3’，含SnaB I酶切位点)和pplA-r(5’ATGCGGCCGCTTAGGCATTCGCCTT-3’，含Not I酶切位点)为引物，以S.fonticola xjF1基因组DNA为模板，采用高保真pfuTaq酶PCR扩增不带信号肽的plA基因的DNA片段。PCR反应条件95℃变性3min，1个循环；94℃变性30sec，53℃复性30sec，72℃延伸2min，32个循环，再进行72℃延伸10min。回收PCR产物用SnaB I/Not I双酶切，与同样双酶切的pPIC9穿梭表达载体连接，构建了毕赤酵母重组质粒pPIC-PL-A，参见附图6，转化大肠杆菌JM109。
通过PCR和酶切鉴定重组质粒。使用两个引物pplAS-f和pplAS-r(5’TAGCGGCCGCTCAAGGCTGAGTATA-3’，含Not I酶切位点)，以居泉沙雷氏菌xjF1基因组DNA为模板，PCR扩增不带信号肽的含有plA和plS两个基因的DNA片段。PCR反应条件95℃变性3min，1个循环；94℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸3min30sec，32个循环，再进行72℃延伸10min。回收PCR产物用SnaB I/Not I双酶切，与同样双酶切的pPIC9载体连接，构建了重组质粒pPIC-PL-AS，参见附图6，转化大肠杆菌JM109。通过PCR和酶切鉴定重组质粒。
2.酵母的转化和重组酵母的筛选将重组质粒pPIC-PL-A和pPIC-PL-AS用Bgl II酶切线性化，以电转化方法导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中，在电转化后的酵母细胞中加入500uL山梨醇溶液，涂布RDB平板。用无菌牙签将RDB平板上单菌落酵母点种在MM和MD平板的相同位置上，30℃培养2d，在MD上生长良好而在MM上生长缓慢或不生长的克隆即为阳性克隆。从MD平板上挑取阳性克隆接种于BMGY液体培养基中，30℃、300rpm振荡培养3d。5000rpm离心10min，去除BMGY培养液，菌体中加入原培养液1/3体积的诱导培养液BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃继续诱导培养3-5d。离心收集上清液，进行磷脂酶活力测定和SDS-PAGE电泳分析。酶活性测定结果表明不同的酵母阳性克隆在摇床水平上的表达量各不相同；含有两个基因和含有一个基因的酵母阳性克隆GS115/pPIC-PL-AS和GS115/pPIC-PL-A的发酵液上清中磷脂酶活力较接近，表明plS基因没有提高plA基因在毕赤酵母中的表达量，plS基因在毕赤酵母表达磷脂酶A1中的作用尚不十分清楚，还有待于进一步探讨。
3.重组酵母产生磷脂酶A1的发酵培养将重组酵母接种在1L的三角瓶中培养28h后，添加0.5％甲醇诱导，每隔12小时取样一次，测定菌体湿重和磷脂酶活力，并进行表达蛋白的SDS-PAGE电泳分析。试验结果表明随着诱导时间的延长发酵液中的磷脂酶活力逐渐提高，诱导60h左右发酵液中磷脂酶活力达到最高，为41.8U/mL。SDS-PAGE电泳分析，参见附图7，表明发酵液中磷脂酶A1蛋白表达量随着诱导时间的延长也在不断积累，在分子量约35kDa处磷脂酶A1蛋白的表达条带由不明显逐渐变得明显，参见附图7。60h之后磷脂酶活力和表达产物积累量不再随诱导时间的增加而增加，反而开始逐渐下降。两个重组酵母GS115/pPIC-PL-A和GS115/pPIC-PL-AS的表达产物随时间积累的曲线相同，说明磷脂酶A1的表达具有很好的稳定性。
实施例6生产低温碱性磷脂酶A1工程菌的核苷酸序列生产低温碱性磷脂酶A1的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核细胞或真核细胞1)序列表中的SEQ NO.1和SEQ NO.3；2)编码序列表中SEQ NO.2和SEQ NO.4蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ NO.1和SEQ NO.3限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在中度严谨条件下能与序列表中SEQ NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
其中所述原核细胞或真核细胞优选的为大肠杆菌和酵母细胞，也可以是其它的各种动植物细胞。可选用本领域技术人员熟知的各种合适的表达载体，如市场销售的各种质粒、粘粒、噬菌体及病毒载体等。可以直接将低温碱性磷脂酶A1基因序列直接连接于表达载体中表达调控序列下游，形成低温碱性磷脂酶A1表达载体。包含本发明的分离的核酸分子的宿主细胞可以是常规使用的原核宿主细胞、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。
实施例7重组磷脂酶A1的柱层析纯化重组酵母GS115/pPIC-PL-AS诱导培养60h后，收集发酵液上清，用25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)4℃透析2天，其间更换4次缓冲溶液。将透析液以4℃、6000rpm离心20min，收集上清液。上样至预先用Tris-HCl缓冲液清洗了2个柱床体积且平衡好的Sepharose Q Fast Flow层析柱上(10mL)，用含0至1.0mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)梯度洗脱20个柱床体积，洗脱速度为5.0mL/min，洗脱蛋白的保留体积为189.82mL。部分收集器分步收集洗脱液，每管约16mL，合并有酶活的各管。最后，用30kDa超滤管将合并酶液浓缩至200uL，进行SDS-PAGE电泳分析和活性染色分析。由附图8可知重组酵母发酵液上清经纯化后，在分子量约35kDa的位置呈现单一的蛋白条带。将纯化的35kDa蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将电泳后的凝胶放在蛋黄固体琼脂平板上，37℃反应16h左右可观察到白色沉淀条带出现。与SDS-PAGE凝胶电泳显示的条带进行比较，它们的位置和数目相同，因此可以确定纯化获得的35kDa蛋白就是磷脂酶，参见附图9。重组酵母的发酵液经Sepharose Q Fast Flow柱层析一步法分离得到电泳均一的重组磷脂酶A1，比活力为23.13U/mg，纯化倍数为8.5，酶活性得率为3.4％。
实施例8重组低温磷脂酶A1酶学性质的研究1.温度对酶活力的影响和酶的热稳定性在pH9.0及分别在4℃、10℃、13℃、16℃、20℃、28℃、35℃、41℃、48℃、54℃、60℃、70℃、80℃和90℃温度条件下，按常规方法测定酶活力。由附图10A可见重组磷脂酶A1的最适作用温度范围为20～35℃。有趣的是，该酶在55℃保温30min后完全失活，而在10℃保温30min仍保持约70％的酶活力。
将酶液分别在40℃、50℃和60℃下保温10min，15min，20min，30min，35min，40min，50min和60min，迅速冷却，然后再调至35℃按常规法测定酶活力，与同时置于35℃的对照比较，求出剩余酶活。实验结果表明50℃保温15min，剩余酶活为16.9％，而60℃保温15min，酶活力几乎完全丧失。附图10B显示了重组磷脂酶A1在60℃下热处理不同时间的酶活力变化，由附图10B可知60℃下热处理10min，可导致该酶活力损失86％。这说明重组磷脂酶A1对热较敏感，属于低温磷脂酶A1。
2.pH对酶活力的影响和酶的pH稳定性在pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5的不同系列的缓冲液及35℃条件下，按常规方法分别测定酶活力，结果参见附图11A。附图11A表明重组磷脂酶A1最适作用pH为9.0。将酶液用不同pH值的缓冲液稀释，在35℃保温3h，再用pH9.0的Gly-NaOH缓冲液适当稀释，按常规法测定酶活力，以未保温的相应pH的稀释酶液为对照。结果表明，在pH6-10的范围内重组磷脂酶A1的酶活力可维持在75％以上，参见附图11B。可见重组磷脂酶A1是一种低温碱性磷脂酶A1。
3.金属离子和相关化学试剂对酶活力的影响5mmol/L的各种金属离子溶液和一定浓度的其它化学试剂分别与酶液混合在35℃保温30min后，测定酶活力，以未加金属离子和化学试剂的酶液为对照。结果发现5mmol/LCa2+对酶的激活作用最强，表明重组磷脂酶A1是Ca2+依赖型磷脂酶，其它测试的金属离子和化学试剂对酶都有不同程度的抑制作用，参见附图12。
4.重组磷脂酶A1的Km值及Vmax的测定根据实验测定的磷脂酶A1的水解反应初速度，确定测定磷脂酶A1的Km和Vmax的反应时间为10min。重组磷脂酶A1与不同浓度的卵磷脂反应10min后测定酶活力，卵磷脂浓度依次为2‰、1‰、0.5‰、0.25‰、0.125‰、0.0625‰和0.03125‰。按双倒数作图法(Lineweave-Burk法)将米氏方程改写为1V=KmVmax×1[S]+1Vmax]]>以浓度的倒数1/[S]为横坐标，反应速度的倒数1/[v]为纵坐标作图，测得该重组磷脂酶A1对卵磷脂的Km值为1.82mg/mL，Vmax为9.09umol/mL·min。
序列表<110>新疆农业科学院微生物应用研究所<120>一种低温碱性磷脂酶A1及其编码基因<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>963<212>DNA<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>1atgagtttgc ctttgagttt catctcgacg atgacgccca tcaccgctgc atctgcttcg60tcactcccgc ttcaagacgc aataaaacca gtccaaaccg acgagccaca ggtgacaaaa120gttgctgtgc cgctcccctc tgaaaatagt cgtaatgcac aaaacctgtt gaattcactg180actcgcgatc tctctgctgc ggtacctttg gccccaaggc tggagatgtc tcgtgggcaa240gagtctcagc agggcgatta ctctttggcg ctattggcca aggatgtcta caacctcact300gggcagggtg cagagggctt ttcgcgcatg agtgataacg atttgctgag tgttggcatt360gaccccgcaa gtttattgga tgcagcctca gggttacagg cgggtattta ttcgaataag420cagcactatg tgctggcttt cgctggtact aatgatatgc gcgattggct gagcaatgtg480cgtcaggcta cggggtacga cgatgtgcag tacaatcatg ccgtggcgat tgccaaaaat540gccaaagctg cgtttggtga cggcttagtg atcaccggcc attcgttggg gggagggttg600gcagcaacgg cggcgttggc aaccggttct ctggcggtaa cattcaacgc cgctggggtt660tccgatcata ctctgaaccg tttcggtatt aatccggctg cggcaaagca agatgcagaa720tctggcggga tccgtcgtta cagtgaacaa tacgatatgt tgacggggac gcaggagtcg780acctctctgc ttccagatgc tatcgggcat aaaataacca ttgccaacaa tgagactctg840agcggcactg atgcttggcg gccgagcaaa tatctcgatc gcagcatgac ggcacatggc900atcgataagg taatcagttc aatggcggaa cagaagccat gggagatcaa ggcgaatgcc960taa 963
<210>2<211>320<212>PRT<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>2Met Ser Leu Pro Leu Ser Phe Ile Ser Thr Met Thr Pro Ile Thr Ala15 10 15Ala Ser Ala Ser Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ile Lys Pro Val Gln20 25 30Thr Asp Glu Pro Gln Val Thr Lys Val Ala Val Pro Leu Pro Ser Glu35 40 45Asn Ser Arg Asn Ala Gln Asn Leu Leu Asn Ser Leu Thr Arg Asp Leu50 55 60Ser Ala Ala Val Pro Leu Ala Pro Arg Leu Glu Met Ser Arg Gly Gln65 70 75 80Glu Ser Gln Gln Gly Asp Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Ala Lys Asp Val85 90 95Tyr Asn Leu Thr Gly Gln Gly Ala Glu Gly Phe Ser Arg Met Ser Asp100 105 110Asn Asp Leu Leu Ser Val Gly Ile Asp Pro Ala Ser Leu Leu Asp Ala115 120 125Ala Ser Gly Leu Gln Ala Gly Ile Tyr Ser Asn Lys Gln His Tyr Val130 135 140Leu Ala Phe Ala Gly Thr Asn Asp Met Arg Asp Trp Leu Ser Asn Val145 150 155 160Arg Gln Ala Thr Gly Tyr Asp Asp Val Gln Tyr Asn His Ala Val Ala165 170 175Ile Ala Lys Asn Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asp Gly Leu Val Ile Thr180 185 190
Gly His Ser Leu Gly Gly Gly Leu Ala Ala Thr Ala Ala Leu Ala Thr195 200 205Gly Ser Leu Ala Val Thr Phe Asn Ala Ala Gly Val Ser Asp His Thr210 215 220Leu Asn Arg Phe Gly Ile Asn Pro Ala Ala Ala Lys Gln Asp Ala Glu225 230 235 240Ser Gly Gly Ile Arg Arg Tyr Ser Glu Gln Tyr Asp Met Leu Thr Gly245 250 255Thr Gln Glu Ser Thr Ser Leu Leu Pro Asp Ala Ile Gly His Lys Ile260 265 270Thr Ile Ala Asn Asn Glu Thr Leu Ser Gly Thr Asp Ala Trp Arg Pro275 280 285Ser Lys Tyr Leu Asp Arg Ser Met Thr Ala His Gly Ile Asp Lys Val290 295 300Ile Ser Ser Met Ala Glu Gln Lys Pro Trp Glu Ile Lys Ala Asn Ala305 310 315 320<210>3<211>756<212>DNA<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>3atgcctaaaa ggtggtgcag aggctgctgg atagcggctc tcgttttgcc cctgtttggg60atcgctggat tattgatggt agccaaggag cactatatgg aacagcaaac ttcgccattt120gcgggtaccg atatcctgtc tttatcacag gcggtggctg aagatgacgt ttggcaaatt180agccagcaag caacggctga acggcaacat gtgcggggag atttgcagat cacactgttg240cagtgggcga ttctgcagca gaggccaggc agtgtacagg cattgataca ggcgggggca300gatattgggc aaccaggtat ggagggcaac ggggcattgc atacggcggc gatggttaag360
gatgcgcaat atttacgctt gttattgcaa caggctcccc aggttaatat gcgtaatctg420gtcactgctg ctacgccatt agccgctgcc gtgctggcgg ggcgggagga gcaggtgcgt480atgctgttga atgccggggc tgatagtaca ttgagtgaca gagtggggga tacgcccttg540cacctggccg caaaaatcaa cgcaccacag ttggcgctgc tcctgttaca aacgggggct600gatgccaagg cacaaaatca gcaagggaga acgttccagt attactttgc ccagacgcca660gtgcatttgc agaatagtga gttgcgtgag cagtaccgtc aattggagag ctggctcaaa720agtcagcaat tggccgggca ctatactcag ccttga 756<210>4<211>251<212>PRT<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>4Met Pro Lys Arg Trp Cys Arg Gly Cys Trp Ile Ala Ala Leu Val Leu15 10 15Pro Leu Phe Gly Ile Ala Gly Leu Leu Met Val Ala Lys Glu His Tyr20 25 30Met Glu Gln Gln Thr Ser Pro Phe Ala Gly Thr Asp Ile Leu Ser Leu35 40 45Ser Gln Ala Val Ala Glu Asp Asp Val Trp Gln Ile Ser Gln Gln Ala50 55 60Thr Ala Glu Arg Gln His Val Arg Gly Asp Leu Gln Ile Thr Leu Leu65 70 75 80Gln Trp Ala Ile Leu Gln Gln Arg Pro Gly Ser Val Gln Ala Leu Ile85 90 95Gln Ala Gly Ala Asp Ile Gly Gln Pro Gly Met Glu Gly Asn Gly Ala100 105 110Leu His Thr Ala Ala Met Val Lys Asp Ala Gln Tyr Leu Arg Leu Leu115 120 125
Leu Gln Gln Ala Pro Gln Val Asn Met Arg Asn Leu Val Thr Ala Ala130 135 140Thr Pro Leu Ala Ala Ala Val Leu Ala Gly Arg Glu Glu Gln Val Arg145 150 155 160Met Leu Leu Asn Ala Gly Ala Asp Ser Thr Leu Ser Asp Arg Val Gly165 170 175Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Ile Asn Ala Pro Gln Leu Ala180 185 190Leu Leu Leu Leu Gln Thr Gly Ala Asp Ala Lys Ala Gln Asn Gln Gln195 200 205Gly Arg Thr Phe Gln Tyr Tyr Phe Ala Gln Thr Pro Val His Leu Gln210 215 220Asn Ser Glu Leu Arg Glu Gln Tur Arg Gln Leu Glu Ser Trp Leu Lys225 230 235 240Ser Gln Gln Leu Ala Gly His Tyr Thr Gln Pro245 250
权利要求
1.一种产生低温碱性磷脂酶A1的耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)CGMCC.No.1971及其衍生菌。
2.一种低温碱性磷脂酶A1，其特性在于，该低温碱性磷脂酶A1分子量为35000道尔顿，最适作用温度20～35℃，55℃保温30min酶活力完全丧失；最适pH9.0，pH6～10可水解卵磷脂产生溶血磷脂和脂肪酸；Ca2+依赖型磷脂酶，其它金属离子和化学试剂对酶都有抑制作用；对卵磷脂的Km值为1.82mg/mL，Vmax为9.09umol/mL·min。
3.一种低温碱性磷脂酶A1基因序列，其特征在于如权利要求2所述的编码磷脂酶A1，包含两个开放阅读框plA和plS，其中plA基因被证实编码磷脂酶A1；plS基因编码磷脂酶A1的辅助蛋白；plA和plS是两个重叠基因，plS的起始密码子位于plA的终止密码子上游5bp的位置，两个可读框可以单独进行转录。
4.一种如权利要求3所述SEQ NO.1核苷酸序列，其特征在于，plA基因全长963bp，编码320个氨基酸，酶蛋白理论分子量为33.9kDa，其中1～54bp编码低温碱性磷脂酶A1信号肽，55～963bp编码低温碱性磷脂酶A1成熟肽。
5.一种如权利要求3所述SEQ NO.3核苷酸序列，其特征在于，plS基因编码磷脂酶A1的辅助蛋白，包含756个核苷酸，编码251个氨基酸，理论分子量为27.7kDa。
6.一种具有SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，其特征在于，序列由320个氨基酸残基组成，其中自C末端1～18氨基酸为低温碱性磷脂酶A1信号肽序列，19～320氨基酸为低温碱性磷脂酶A1成熟肽序列，193～197氨基酸(-Gly-X1-Ser-X2-Gly-)为脂肪酶和部分磷脂酶的保守五肽序列。
7.由SEQ NO.2衍生且与其氨基酸序列相同活性的蛋白质，其特征在于，SEQNO.2氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加获得。
8.具有SEQ No.2所示氨基酸80％以上同源性的氨基酸序列。
9.优选与权利要求8所示氨基酸90％以上同源性的氨基酸序列，且具有与SEQNO.2相同活性的功能类似物。
10.低温碱性磷脂酶A1基因在受体菌中表达获得的重组质粒和重组菌株。
11.含有如权利要求10中SEQ NO.1所示的重组质粒和重组菌株，其特征在于，耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)CGMCC.No.1971的磷脂酶A1基因在大肠杆菌中表达并获得大肠杆菌重组质粒和重组菌株。
12.含有如权利要求10中SEQ NO.1所示的重组质粒和重组菌株，其特征在于，耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)CGMCC.No.1971的磷脂酶A1基因在毕赤酵母中表达并获得毕赤酵母重组质粒和重组菌株。
全文摘要
本发明公开了一种耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1 CGMCC No.1971，通过对菌株特性、产酶条件和酶学性质的研究，探明了新的磷脂酶A
文档编号C12N1/19GK101070530SQ20071010048
公开日2007年11月14日 申请日期2007年4月13日 优先权日2007年4月13日
发明者付建红, 姚斌, 石玉瑚, 孟昆, 欧阳平凯, 袁铁铮 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所