一种低温中性脂肪酶及产生该酶的白地霉的制作方法

专利名称：一种低温中性脂肪酶及产生该酶的白地霉的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵及其产物酶领域，特别是涉及从高寒地区分离获得一种产生低温中性脂肪酶的白地霉菌株及其由该菌株产生的新型低温中性脂肪酶。
背景技术：
低温微生物是研究在低温条件下生物适应性的极好材料，而且也是获得在低温条件下具有较高催化能力的低温酶类的最佳来源。有关低温酶的最早报道是在1984年，Kobori等从南极地区筛选的菌种中成功检测到碱性磷酸酶的活性并观察到该酶在低温时的高比活力和高温时的迅速失活的特性。直到20世纪90年代前期，随着世界能源紧缺，石油价格上涨，节能降耗成为世界范围内亟待解决的热点问题，低温酶的研究才因此在国内外引起广泛关注。目前，国内外研究较多的是海洋和极地环境下的低温微生物及其低温酶，而对于内陆高寒地区、冰川冻土的研究较少。新疆是我国西北内陆省区，具有独特的自然环境，其中干旱和低温是其两个显著的特点，这样的特殊环境下蕴藏着大量丰富的低温微生物资源。研究、开发该地区低温微生物资源及其相应的低温酶类具有重要的战略意义。
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一种在自然界中普遍存在的酶类。按其来源可分为动物、植物及微生物脂肪酶三大类。其中，微生物脂肪酶因其容易生产、易于扩大等特点以及对脂肪类物质专一性的分解特性，使其在洗涤、食品加工、皮革加工、有机合成化工产品、香料、药物制备、油脂加工等方面得到广泛应用，成为世界主要工业用酶制剂之一。脂肪酶已从多种不同的微生物中分离如青霉(黄建忠等，工业微生物，25(3)1～5，1995)、白地霉(谢舜珍，微生物学报，26(3)260～264，1986)、根霉菌(金其荣等，工业微生物，25(1)17～20，1995)、类产碱假单胞菌(吴松刚等，微生物学报，37(1)32～39)、假单胞菌(Kotsuka等，美国专利US Patent5846801，1998年12月8日)、假丝酵母等(William等，Microbial Enzymes and Biotechnology，应用科学出版社出版，225～247，1983)。其中多数脂肪酶的最适作用温度在50℃左右，在低温时酶活力很低。而低温脂肪酶具有的最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点，在某些领域有着中温脂肪酶所不可比拟的优越性。低温脂肪酶应用于有关的工业生产可简化生产工艺，节能降耗，保护环境，同时可降低生产成本，提高产品质量，具有重要的现实意义。微生物产生的脂肪酶种类多，但是来源不同的脂肪酶具有多方面不同的性质，从而导致微生物脂肪酶各具特色的应用范围，因此低温酶的应用前景广阔，需要持续不断地开发新特性脂肪酶以更好地满足工业需要。
目前，国内外已报道的低温脂肪酶产生菌主要以细菌为主，兼少量酵母。如低温微球菌(Mcrococcus antarcticus)T2所产生的低温脂肪酶最适酶解温度为35℃、pH8.0(刘洪灿等，一种低温脂肪酶及其编码基因与生产方法，专利公开号CN1611600A)；适冷性海洋酵母(Yarrowia lipolytica)Bohaisea-9145产生的低温脂肪酶的最适反应温度为35℃，在0℃时保持20％的相对酶活力，最适pH8.5、pH4.0～9.0范围内较稳定，热稳定性差(邵铁娟等，微生物学报，6789-792，2004)；南大洋深海嗜冷菌22521021产生的酶最适酶解条件为35℃、pH7.5；深海适冷假单胞菌(Pseudomonas sp.)KB700A所产的低温脂肪酶的最适酶活温度也为35℃；方金瑞从深海泥样分离到的菌株EQ223产生的低温脂肪酶的最适作用温度为10℃；适冷菌(Pseudomonas sp.)B1121产生的冷适应脂肪酶最适作用温度为45℃(林学政等，海洋学报，5154-158，2005)；气单孢菌属菌株(Aeromonas sp.)LPB4产生的低温酶最适酶解温度为10℃(Han-Ki Lee等，The Journal of Microbiology，22-27，March 2003)；假单孢菌Pseudomonas fragi产生的低温脂肪酶最适酶解温度为29℃、最适pH8.0(Claudia Alquati等，Eur.J.Biochem，2693321-3328，2002)；耐冷假单胞菌属(Pseudomonas)菌株BTs10022产生的脂肪酶的最适酶解温度为24℃、10℃仍可保持35％的相对酶活力，最适pH为8.0，在pH7～9范围内具有较高的酶学特性(俞勇等，高技术通讯，1089-93，2003)；嗜冷杆菌属(Psychrobacter sp.)7195所分泌的脂肪酶最适作用温度为30℃，最适pH值为9.0，对热敏感，60℃热处理10min，剩余酶活为30％，是典型的低温酶(张金伟等，生物磁学，6(1)6-10，2006)；发光杆菌属(Photobacterium)D2菌株所产脂肪酶的最适作用温度在35℃左右，证明其为低温酶，最适pH值为8(林容霞等，北京化工大学学报，33(1)31-35，2006)。
国内外尚未见有关霉菌产生低温脂肪酶的报道。关于脂肪酶产生菌-白地霉，国内只有零星的菌种选育和发酵生产的研究报道(谢舜珍，微生物学报，26(3)260～264，1986)，国外虽已克隆了多个白地霉脂肪酶基因，并进行了酵母表达和酶学性质测定(Bertolinie等，Eur.J.Biochem，219119～125，1994；Shimada等，J.Biochem，106383～388，1989；Alberghina等，Germany，VCH，16237～241，1990)，但报道的白地霉脂肪酶都不是低温脂肪酶。
从微生物发酵液中分离纯化酶的常用方法有沉淀分离和层析分离。沉淀分离纯化酶的收得率高，一般在80％以上，但纯度较低。层析分离方法分离纯化酶的收得率低，一般在15～40％之间，纯度在60％以上。在目的产物(酶)分子量已知的情况下，选择葡聚糖凝胶过滤(Sephadex)技术比常用的离子交换层析技术更简便和更易于操作。因此，对于不同酶类的提取、分离，需要针对不同微生物及相应的产物性质来决定选择不同的提取技术。

发明内容
针对目前国内外尚未报道霉菌产生低温脂肪酶的现状，根据不同酶类的提取、分离，由不同微生物及相应的产物性质决定选择不同的提取技术的现状。本发明提供了从新疆寒冷地区含油冻土中筛选出的产生低温中性脂肪酶的白地霉菌株ch-3及由此产生的新型低温中性脂肪酶。同时，本发明创造性地运用双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤技术的有机结合提取、纯化获得低温中性脂肪酶。
本发明通过对新疆高寒地区的含油冻土样本进行微生物菌种的培养、分离，获得一批低温微生物，并从中分离筛选出一株低温脂肪酶产生菌，编号为ch-3，从而提供了一株具有生产低温中性脂肪酶优良特性的脂肪酶产生菌。根据《真菌鉴定手册》和对ch-3菌株的形态学鉴定、生理生化检测及18SrRNA同源分析确定ch-3菌株为白地霉菌株(Geotrichum candidum)。
同时，本发明还提供了一种低温中性脂肪酶，通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵工艺及相应的提取技术而获得。
本发明具体提供了一种低温中性脂肪酶菌株，命名为ch-3，其能够产生低温中性脂肪酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期是2007年3月12日，保藏号是CGMCC No.1972。该菌株最适生长温度是20℃；优先生长于麦芽汁培养基和马铃薯琼脂培养基PDA(去皮马铃薯∶水＝1∶5煮沸半小时，用纱布过滤，滤液加水稀释至原来的体积，再加1％蔗糖和1.5％琼脂粉，自然pH)。20℃下培养3d的菌落直径为30～40mm，白色粉状，菌落中心突起，有放射线。当菌落表面被扰动时，变成似酵母的粘稠状。显微镜下观察，具有真菌丝，有的有二叉分枝，横隔或多或少。菌丝宽3～7um，繁殖方式为裂殖。形成的节孢子单个或连接成链，孢子呈长筒形、方形，也有椭圆或圆形，末端钝圆。节孢子绝大多数为3～6×6～12um。根据以上的形态特征初步确定菌株ch-3属于地霉属。菌株ch-3能水解蛋白、液化明胶、胨化牛奶，利用蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉为唯一碳源。通过BLAST同源比对，菌株ch-3的18SrRNA序列与Geotrichum candidumIFO4599的18SrRNA序列的相似性最高，因而将菌株ch-3确定为地霉属白地霉(Geotrichum candidum)，该菌种简称为G.candidum ch-3。
本发明通过G.candidum ch-3发酵获得的低温中性脂肪酶具有优良的低温活性，最适反应温度是35℃，在20～40℃酶的稳定性最佳，随着温度升高，酶活力迅速下降。20℃保温30min可保持90％的酶活力，而50℃保温30min，仅有55％的酶活力。这一性质在工业上具有很重要的开发潜能。该酶的最适pH是7.0，在pH6.5-8.0范围内温育3h能保持原来酶活的93％以上。Fe2+、Cu2+、Mn2+对本发明的脂肪酶有较强的激活作用；Ca2+有轻微的激活作用；Mg2+和EDTA对酶有一定的抑制作用，表明本发明的脂肪酶是一种金属酶。通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，摇瓶发酵酶活达18.9U/mL。
本发明进一步建立了菌种筛选、鉴定、保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。
(一)菌种筛选从新疆油脂化工厂油污排放池采集含油冻土，每克土样与9mL无菌水混合，加无菌小玻璃珠振荡摇匀后静置片刻，取5mL上清液加入到富集培养液(橄榄油2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，(NH4)2SO40.5％，MgSO4·7H2O0.05％，K2HPO40.4％，KH2PO40.1％，CaCl20.05％，pH7.5)中，20℃、150rpm摇瓶振荡培养4d后，取5mL培养液加入另一新鲜富集培养液中继续培养。如此重复5-6次后，取富集培养液用无菌生理盐水梯度稀释，涂布分离培养基平板(0.1％(NH4)2SO4，0.1％K2HPO4，1％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％FeSO4·7H2O，12％橄榄油和聚乙烯醇乳化液，2％琼脂)，倒置于20℃温控培养箱中培养5d以上，将有黄色变色圈的菌落挑至LB斜面保藏，同时挑起一环至LB培养液中，20℃摇瓶振荡培养48h后，离心，取30uL上清液加入罗丹明B定性平板(将罗丹明B溶解于去离子水中，使其终浓度为1mg/mL，过滤除菌。基础培养基高压灭菌后冷却至60℃，加入3.125％橄榄油和1％的罗丹明B溶液，混合后静置10min，以消除泡沫，倒平板，平板呈不透明粉红色。)的孔中，于20℃培养48h再在350nm紫外光下观察，产脂肪酶的微生物发酵液周围有橘黄色荧光圈。挑选荧光圈大的菌落接入产酶培养基中，22℃、150rpm下培养48h，取发酵上清液测定脂肪酶活性。
(二)菌种鉴定根据《真菌鉴定手册》对菌株G.candidum ch-3的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的低温中性脂肪酶产生菌G.candidum ch-3的生物学特性如表1所示。
表1 低温脂肪酶产生菌白地霉ch-3的生理生化特性

利用真菌18SrRNA的通用引物ca18spF2(5’-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3)ca18spR(5’-TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3’)以菌株ch-3的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃30s，50℃30s，72℃2min，32个循环。PCR产物经Takara胶回收试剂盒纯化后，与pGEM-Teasy载体连接，转化E.coli JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得阳性克隆，经测序。应用BLAST程序将所得的18SrRNA序列与GenBank数据库中的序列进行相似性比较分析。结果发现菌株G.candidum ch-3与白地霉Geotrichum candidum IFO4599的18SrRNA序列相似性最高，为99％，表明二者的亲缘关系最近。本发明的低温中性脂肪酶产生菌G.candidum ch-3的18SrRNA序列如下1CTGCGAATGG CTCATTAAAT CAGTTATCGT TTATTTGATA TTACATTACTACTTGGATAA CCGTGGTAAT TCTAGAGCTA ATACATGCTA AAACGGCCGG101 GTTTCCGGCT GGTATTTATT AGATAAAAAA CCAATGCCTT CGGGCTCTATGGTGAATCAT AATAACTTGT CGAATCGCAT GGCCTTGTGC TGGCGATGGT201 TCATTCAAAT TTCTGCCCTA TCAACTTTCG ATGGTAGGAT AGAGGCCTACCATGGTTTTA ACGGGTAACG GGGAATCAGG GTTCGATTCC GGAGAGGGAG301 CCTGAGAAAC GGCTACCACA TCCAAGGAAG GCAGCAGGCG CGCAAATTACCCAATCCTGA CACAGGGAGG TAGTGACAAT AAATAACGAT ACGGGGCCTA401 TTAGGTCTCG TAATTGGAAT GAGAACAATT TAAATACCTT AACGAGGAACAATAGAGGGC AAGTTCTGGG CCAGCAGCCC CGGTAATTCC AGCTCTGATA501 GTATATATTA AAGTTTTGCA GTAAAAAGCT CGTAGTTGAA ACTTGGGTGCGTAGGGGCGG TCTCTTTTAG AGTACTACCC TGAAACATCT TTCTTTGGTG601 TAAACTTTCT ATTTATTTAG GAAGTGTAAA CCAAACATTT ACTTTGAAAAAATTAGAGTG TTCAAAAGCA GGCCTTTGCT CGAATATATT AGCATGGAAT701 AATAGAATAG GACGTATGGT TCTATTTTGT TGGTTTCTAG GACCGTCGTAATGATTAATA GGGACGGTCG GGGGCATCAG TATTCAGTTG TCAGAGGGAA801 ATTCTTGGAT TTACTGAAGA CTAACTACTG CGAAAGCATT TGCCAAGGACGTTTTCATTA ATCAAGAACG AAAGTTAGGG GATCGAAGAC GATCAGATAC901 CGTCGTAGTC TTAACCGTAA ACTATGCCGA CTAGGGATCG GAGGGCGTTATAATAACCTC TCCGGCACCT TACGAGAAAT CAAAGTTTTT GGGTTCTGGG1001 GGGAGTATGG TTGCAAGGCT GAAACTTAAA GGAATTGACG GAAGGGCACCACCAGGAGTG GAGCCTGCGG CTTAATTTGA CTCAACACGG GGAAACTCAC1101 CAGGTCCAGA CACAATAAGG ATTGACAGAT TGAGAGCTCT TTCATGATTTTGTGGGTGGT GGTGCATGGC CGTTCTTAGT TGGTGGAGTG ATTTGTCTGC1201 TTAATTGCGA TAACGAACGA GACCTTAACC TGCTAAATAG CTGTAACAATAGATTATTGT TTTGACAGCT TCTTAGAGGG ACTATCGATT TTCAAGTCGA1301 TGGAAGTTTG AGGCAATAAC AGGTCTGTGA TGCCCTTAGA CGTTCTGGGCCGCACGCGCG CTACACTGAC GGAGCCAGCG AGTCTAACCT GTGCCGAGAG1401 GTATGGGTAA TCTTGTGAAA CTCCGTCGTG CTGGGGATAG AGCATTGCAATTATTGCTCT TCAACGAGGA ATTCCTAGTA AGCGCAAGTC ATCAGCTTGC1501 GTTGATTACG TCCCTGCCCT TTGTACACAC CGCCCGTCGC TACTACCGATTGAATGGCTT AGTGAGGCTT CCGGATTGAT TAACTGGAGA GGGCAACTTT1601 TCTGGTTGAA CGAGAAGCTA GTCAAACTTG GTCATTTAGA GGAAGTA通过对菌株G.candidum ch-3的18SrRNA同源序列进行进化分析发现Geotrichum candidum IFO4599与其在同一分支，其进化拓扑结构参见附图3所示。结合低温脂肪酶产生菌ch-3的形态结构特征及生理生化特性，确定其为地霉属的白地霉菌株(Geotrichum candidum)。
(三)菌种保藏真空冷冻干燥或石蜡油保存。无菌条件下将100％石蜡油加入试管斜面上，使石蜡油液面超出培养基斜面，完全隔绝空气对菌种的影响，将菌种保存于-70℃的超低温冰箱中。
(四)菌种活化从石蜡油中取一菌种移植块，接种到PDA培养基上，在20～25℃下培养1天左右，再转接到一新鲜PDA培养基上，连续活化数次，就可进行菌株其它实验的测定。
(五)菌种复壮首先按步骤(四)活化菌株，然后在筛选培养基中接种活化好的菌株并进行培养，检测菌株周围的变色圈和橘黄色荧光圈的大小，选取变色圈和橘黄色荧光圈大的单菌落接种于斜面培养基上培养，并将此菌株作为生产菌株使用。
本发明还具体提供一种低温中性脂肪酶的生产方法，其包括(一)对G.candidum ch-3 CGMCC No.1972进行菌种活化培养步骤；(二)利用如上步骤获得的活化菌种进行发酵步骤；(三)发酵后的纯化、提取步骤。
具体的，本发明提供了一套完整的脂肪酶产生菌筛选方案。我们从新疆昌吉市采集冰冻的含油土壤，采用本领域普通技术人员已知的橄榄油-溴甲酚紫指示剂平板和罗丹明B平板从中筛选出12株脂肪酶产生菌。又通过滴定法复筛，测定所有产酶菌的脂肪酶活性，最终确定其中产生低温脂肪酶且产酶性质较稳定的G.candidum ch-3为生产菌株。
本发明的低温中性脂肪酶的产生菌，既可为本发明所保护的菌株，也可为自然筛选的原始菌株，或为保护菌株通过自然变异或人工诱变产生的变异菌株，通过本发明所述的方法，均可实现本发明所阐述的技术效果。
作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变，如紫外线辐射处理、钴60辐照处理、离子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍、硫酸二乙酯等化学诱变剂处理，用常规脂肪酶产生菌分离筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌株。另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌或诱导变异菌中获取低温中性脂肪酶基因，以原核生物如大肠杆菌等作为基因受体菌，构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的低温中性脂肪酶产生菌种。
白地霉G.candidum ch-3产酶培养基的培养源可广泛使用通常用于培养的培养源包括碳源、氮源、无机盐以及其它必要的营养物质。在不同的碳源培养基中，本发明G.candidum ch-3的产酶能力有很大差异，以可溶性淀粉为碳源时最有利于产酶，酶活可达14.7U/mL；而以葡萄糖为碳源时，发酵液产生较低的酶活。
本发明G.candidum ch-3的氮源的选择和用量，可根据其它培养源的成分和用量的不同而不同，玉米浆为氮源最有利于产酶，此时酶活力达到20U/mL；其次是酵母粉；以乙酸铵和硝酸钠为氮源时，几乎不产酶。通过氮源浓度的研究可知，玉米浆浓度为2.0％时，酶活最高。
不同培养时间和培养温度对产酶的影响不同，结果表明G.candidum ch-3在24℃培养48h时酶活力最高。
不同起始pH对菌体产酶的影响不同，结果表明不同的培养基起始pH对产酶的影响很大，在起始pH8.0时G.candidum ch-3的酶活力最高。
不同摇瓶装液量对产酶的影响不同，结果表明最适装液量为90mL。
不同接种量对产酶的影响不同，结果表明最佳接种量为10％。
不同接种龄对产酶的影响不同，菌体在产酶培养基中接入种龄48h的种子，有利于产酶。
油脂在脂肪酶合成过程中起碳源的作用，同时也是诱导物，因此油脂是产酶培养基的一个重要组分。在产酶培养基中加入10g/L的各种油脂，在特定条件下进行发酵培养测酶活，结果表明豆油是最好的诱导物，而甘油、猪油和菜籽油对该酶的形成有一定的抑制作用。
无机盐类对G.canidum ch-3产酶的影响不同。以不加盐类的酶活力为100％，实验结果表明10mmol/L的Fe2+、Cu2+和Mn2+对酶的产生有促进作用；而Zn2+、Mg2+、Na+、K+及EDTA对酶的形成有不同程度的抑制作用，其中Mg2+和EDTA的抑制作用最为明显。
G.candidum ch-3经摇瓶培养48h，取发酵上清液分析酶的性质。G.candidum ch-3发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃，在0℃可保持66％的相对酶活力，对热较敏感；最适pH为8。标明G.candidum ch-3产生的脂肪酶为低温脂肪酶。
通过双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤两步纯化，从G.candidumch-3发酵液中分离、获得了电泳均一的蛋白，用SDS-PAGE测得该蛋白的分子量约为38kDa。通过酶活性测定及凝胶电泳酶活性条带印迹实验，证明以上纯化的38kDa蛋白确为脂肪酶，我们将其命名为LIP3。摇瓶发酵脂肪酶比活力为4.65U/mg，经两步法纯化后提高到337.5U/mg，纯化后酶活性得率为16.3％，纯化倍数为72.6。通过双水相萃取和反胶团相转移两种酶提取方法的比较，可看到反胶团相转移法造成G.candidum ch-3的脂肪酶活力损失较大，而双水相萃取法使酶活力损失较小。采用双水相萃取法纯化脂肪酶的最佳条件为PEG浓度为15％，硫酸铵浓度为22.5％及pH8.0，此时脂肪酶的比活力提高到40.3U/mg，纯度提高了8.6倍。
在不同温度下按常规法测定酶活力，获得的LIP3最适作用温度为35℃。在20～40℃酶的稳定性最佳，随着温度的升高，酶活力迅速下降。50℃保温30min，仅有55％的酶活力。可见LIP3对热敏感，是一种低温脂肪酶。按常规法测定酶活力。由pH-酶活力曲线可以看到脂肪酶最适pH为7.0，pH低于6.5酶活力迅速下降。由pH稳定性曲线可以看出该酶在pH6.5-8.0范围内酶活力可保持在95％以上。可见脂肪酶LIP3为低温中性脂肪酶。实验证明，Fe2+、Cu2+、Mn2+对酶有较强的激活作用；而Mg2+和EDTA对酶有一定的抑制作用。为了降低酶失活的速度，我们还研究了保藏条件和保护剂对脂肪酶活力的影响。
本发明提供的G.candidum ch-3是具有良好商业应用前景的低温中性脂肪酶产生菌，产酶温度稳定，原料来源广泛，生产成本低廉，有利于进一步开拓低温微生物资源的应用领域。本发明提供的LIP3为新型低温中性脂肪酶，最适作用温度为35℃，最适pH为7.0，可广泛应用于食品、化工、医学制品等领域中。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。
1、定向筛选到低温中性脂肪酶产生菌ch-3，经鉴定为白地霉菌株(Geotrichum candidum，G.candidum)，经摇瓶发酵实验证明G.candidum ch-3发酵上清液中的脂肪酶是一种对热较敏感的低温脂肪酶。
2、经双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤两步法纯化后G.candidumch-3的脂肪酶比活力由原来的4.65U/mg，提高到337.5U/mg，酶纯度提高了72.6倍，酶活性得率为16.3％。
3、纯化获得的脂肪酶LIP3的最适作用温度为35℃。在20～40℃酶的稳定性最佳，随着温度的升高，酶活力迅速下降；50℃保温30min，仅有55％的相对酶活力。可见LIP3对热敏感，是一种低温脂肪酶。
4、纯化获得的脂肪酶LIP3最适pH为7.0，pH低于6.5酶活力迅速下降。由pH稳定性曲线可以看出该酶在pH6.5-8.0范围内可保持95％以上的酶活力。可见脂肪酶LIP3为低温中性脂肪酶。


图1A和B为定向筛选G.candidum ch-3时在罗丹明B和溴甲酚紫指示剂平板上产生荧光圈和黄色变色圈的情况。
图2A为G.candidum ch-3的发酵粗酶液的温度-酶活力曲线；B示粗酶液的pH-酶活力曲线。
图3为G.candidum ch-3的系统进化树。
图4A为低温中性脂肪酶LIP3的温度-酶活力曲线；B示LIP3的热稳定性曲线。
图5A为低温中性脂肪酶LIP3的pH-酶活力曲线；B示LIP3的pH稳定性曲线。
图6为金属离子和相关化学试剂对低温中性脂肪酶LIP3活力的影响。
图7A为保藏条件对低温中性脂肪酶LIP3活力的影响；B示保护剂对LIP3活力的影响。
具体实施例方式
实施例1低温脂肪酶产生菌的筛选采用本领域技术人员所熟知的橄榄油-溴甲酚紫指示剂平板法从新疆昌吉市油脂化工厂含油冻土中筛选出12株脂肪酶产生菌，再转接到罗丹明B平板上进一步鉴定和检测，最后接入产酶培养基进行脂肪酶活性测定。实验结果表明，其中白地霉(Geotrichum candidum)ch-3在橄榄油-溴甲酚紫指示剂平板上形成的黄色变色圈与菌落直径的比值较大，产生的脂肪酶活力较高。参见附图1A可看到白地霉(Geotrichum candidum)ch-3在罗丹明B平板上形成橘黄色荧光圈；附图1B显示白地霉ch-3在油脂同化平板上形成黄色变色圈的情况。
G.candidum ch-3经摇瓶培养48h，取发酵液上清分析酶的性质。参见附图2A温度-酶活力曲线和附图2B pH-酶活力曲线可以看到白地霉发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃，在0℃可保持66％的相对酶活力，对热较敏感；最适pH为8，表明Geotrichum candidum ch-3产生的脂肪酶是低温脂肪酶。
实施例2产酶菌株的鉴定菌株G.candidum ch-3在PDA和麦芽汁培养基上20℃培养2-3d的菌落直径为30～40mm，白色粉状，菌落中心突起，有放射线。当菌落表面被扰动时，变成似酵母的粘稠状。显微镜下观察，具有真菌丝，有的有二叉分枝，横隔或多或少。菌丝宽3～7um，繁殖方式为裂殖。形成的节孢子单个或连接成链，孢子呈长筒形、方形，也有椭圆形或圆形，末端钝圆。节孢子绝大多数为3～6×6～12um。根据以上的形态特征初步确定菌株ch-3属于地霉属。
为了进一步确定菌株G.candidum ch-3的分类学位置，我们测定了其18SrRNA基因序列。以菌株G.candidum ch-3的基因组DNA为模板，ca18spF2和ca18spR为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃30s，50℃30s，72℃2min，32个循环。PCR产物经Takara胶回收试剂盒纯化后，与pGEM-Teasy载体连接，转化E.coli JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选，获得阳性克隆、测序。应用BLAST程序将所得的18SrRNA序列与NCBI中已公布的真菌18SrRNA序列进行相似性比较分析，结果表明菌株G.candidumch-3与Geotrichum candidum IFO4599的相似性最高为99％，表明菌株ch-3与Geotrichum candidum IFO4599的亲缘关系最近，它们在系统进化树的同一分支，参见附图3所示，因而菌株ch-3是地霉属白地霉菌株(Geotrichumcandidum)。
引物选用ca18spF2(5’-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3’)和ca18spR(5’-TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3’)。
实施例3低温中性脂肪酶活性测定方法根据中华人民共和国轻工业部部颁标准GB/T 1803-93(2002)，工业酶制剂通用试验方法，在测试过程中温度设定为35℃。
A4.1 定义1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于一定温度和pH的条件下，水解脂肪每分钟产生1umoL的脂肪酸，即为一个脂肪酶国际单位，以U/g(或U/mL)表示。
A4.2 原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸，可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。反应式为RCOOH+NaOH→RCOONa+H2OA4.3 试剂和溶液A4.3.1 聚乙烯醇(PVA)聚合度1750±50。
A4.3.2 橄榄油采用中国医药集团上海化学试剂公司产品。
A4.3.3 95％(V/V)乙醇(GB679)A4.3.4 底物溶液的制备a.称取聚乙烯醇(PVA)40g，加水800mL，在沸水浴中加热、搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1000mL。以干净的双层纱布过滤，取滤液备用；b.量取4％PVA溶液(A4.3.4a)150mL，加橄榄油50mL，用高速组织捣碎机处理6min(分2次处理，每次3min，中间休息5min)，即成乳白色PVA乳化液。该溶液要现用现配。该溶液如贮存在冰箱中，有效期为一周。
A4.3.5 0.025mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.5)甲液称取磷酸二氢钾(KH2PO4)17.01g，加水溶解并定容至500mL。
乙液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)44.77g，加水溶解并定容至500mL。
使用液吸取甲液13mL，加乙液100mL，混匀，即成0.25mol/L磷酸缓冲液。使用时用水稀释10倍，即成0.025mol/L磷酸缓冲液，用pH计校正。
A4.3.6 氢氧化钠标准溶液c(NaOH)＝0.05mol/L按GB601配制与标定c(NaOH)＝0.5mol/L氢氧化钠标准溶液。使用时，准确稀释10倍。
A4.3.7 10g/L酚酞指示液按GB603配制。
A4.4 仪器和设备A4.4.1 恒温水浴35±0.2℃。
A4.4.2 高速组织捣碎机8000～12000r/min。
A4.4.3 pH计分度值为0.02pH单位或2mV。
A4.4.4 电磁搅拌器。
A4.4.5 微量滴定管10mL，分刻度≤0.05mL。
A4.5 分析步骤A4.5.1 待测酶液的制备A4.5.2 测定A4.5.2.2 指示剂滴定法(第二法)a.取两个100mL三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中，各加底物溶液(A4.3.4)4.00mL和磷酸缓冲液(A4.3.5)5.00mL，再于A瓶中加入95％乙醇(A4.3.3)15.0mL，于35±0.2℃水浴预热5min，然后，在两瓶中各加待测酶液1.00mL，立即混匀计时，在35±0.2℃水浴中准确反应15min，在B瓶中立即补加95％乙醇15.0mL终止反应，取出；b.于空白和样品溶液中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪为其终点，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。
A4.6 计算样品的酶活力(U/mL)＝10/3×(B-A)×n式中B-滴定样品时消耗NaOH标准溶液的体积，mL；A-滴定空白时消耗NaOH标准溶液的体积，mL；n-稀释倍数。
实施例4产酶条件的研究1.碳源对产酶的影响以文献报道的脂肪酶产酶培养基为基础，改变碳源种类，24℃下摇瓶发酵48h，发酵液离心去除菌体沉淀测酶活。以1％橄榄油为碳源时酶活力为100％，结果见表2。从表2可以看出，在不同的碳源培养基中，白地霉(Geotrichum candidum)ch-3的产酶能力有很大差异，以可溶性淀粉为碳源最有利于产酶，酶活可达14.7U/mL；而以葡萄糖为碳源时，发酵液产生较低的酶活，这与前人报道的葡萄糖对诱导产生脂肪酶不利的结论相吻合。
表2 碳源对产酶的影响

2.氮源对产酶的影响以1％可溶性淀粉为碳源，加入2％不同氮源，24℃下摇瓶发酵48h，发酵液离心去除菌体沉淀测酶活。以2％豆饼粉的酶活力为100％，结果见表3。从表3可以看出，玉米浆为氮源最有利于产酶，此时酶活力达到20U/mL；其次是酵母粉；以乙酸铵和硝酸钠为氮源时，几乎不产酶。通过氮源浓度的研究可知，玉米浆浓度为2.0％时，酶活最高。
表3 氮源对产酶的影响


3.不同培养时间和培养温度对产酶的影响以1％可溶性淀粉为碳源，2％玉米浆为氮源，培养基初始pH6.0，500mL三角瓶装液量100mL，摇床转速为180r/min，分别在20℃、22℃、24℃、26℃和28℃五个温度下培养11h、25h、48h、72h、98h和120h后测定酶活，结果见表4。由表4可知，白地霉ch-3在24℃培养48h时产生的脂肪酶活力最高。
表4 培养时间和培养温度对产酶的影响

4.不同起始pH对菌体产酶的影响将产酶培养基初始pH值用NaOH或HCl分别调至pH6.5～8.5，以0.5个pH为一个单位，24℃下摇瓶发酵48h，离心取发酵液上清测酶活力，结果表明不同的起始pH对产酶的影响很大，在pH8.0时酶活力最高，如表5所示。
表5 培养基起始pH值对产酶的影响

5.不同摇瓶装液量对产酶的影响控制摇床转速在180r/min，在500mL三角瓶中分别装入30mL、60mL、90mL、100mL、120mL和150mL的产酶培养基，24℃下摇瓶培养48h测酶活，如表6，结果表明最适摇瓶装液量为90mL。
表6 摇瓶装液量对产酶的影响

6.不同接种量对产酶的影响将培养48h的种子培养液，分别以2％、5％、10％和20％(V/V)的接种量接入产酶培养基，其余培养条件同上，24℃摇瓶培养48h后测酶活，结果见表7，最佳接种量为10％。
表7 接种量对产酶的影响

7.最佳接种龄对产酶的影响白地霉ch-3接种于种子培养基中于20℃，180r/min分别培养14h、20h、38h、48h、63h和72h后，再以10％接种量接入起始pH8.0的产酶培养基，振荡培养48h后测酶活，见表8，结果表明产酶培养基中接入种龄48h的种子，有利于产酶。
表8 接种龄对产酶的影响

8.油脂对酶形成的影响油脂在脂肪酶合成过程中起碳源的作用，同时也是诱导物，因此油脂是产酶培养基的一个重要组分。在产酶培养基中加入10g/L各种油脂，在特定条件下进行发酵培养测酶活，结果见表9。由表9可以看出，豆油是最好的诱导物，而甘油、猪油和菜籽油对该酶的形成有一定的抑制作用。
表9 不同油脂对产酶的影响

9.无机盐类对产酶的影响试验了8种无机盐类对产酶的影响，以不加盐类的酶活力为100％，结果见表10。由表10可知，10mmol/L的Fe2+、Cu2+和Mn2+对酶的产生有促进作用；而Zn2+、Na+、K+、Mg2+及EDTA对酶的形成有不同程度的抑制作用，其中Mg2+和EDTA的抑制作用最为明显。此外，蔗糖可促进该酶的产生，其机理有待于进一步研究。
表10 无机盐对产酶的影响


*各种金属离子的终浓度为10mmoL/L。
实施例5低温中性脂肪酶的分离、纯化白地霉(Geotrichum candidum)ch-3接种产酶培养基后，置于往复式摇床(180rpm)24℃发酵培养48h。取发酵液于4℃、6000rpm离心20min，收集发酵上清液即为脂肪酶粗酶液。
将粗酶液进行双水相萃取。双水相体系在22℃按重量配制。体系总质量为10g，酶液量为3g。按计算称取一定量50％(m/m)PEG溶液和一定量成相的(NH4)2·SO4固体盐，不足部分以水补充。所配混合物定量转到离心管，2000r/min离心5min，分相。读出上、下相体积，用取样器吸取一定量的上、下相溶液，测定酶活力和总蛋白含量。有关计算公式为相比R＝上相体积/下相体积；分配系数K＝上相萃取物浓度/下相萃取物浓度；萃取率C＝RK/(1+RK)。为优化双水相萃取的条件，以脂肪酶比活力为指标做三因素三水平的正交试验。结果表明PEG浓度为15％，硫酸铵浓度为22.5％及pH8.0时脂肪酶的比活力达到最大，也是双水相萃取的最佳条件。本步得到了纯化倍数为8.6、酶活性收率为88％、比活力为40.3U/mg的脂肪酶。双水相萃取后的酶样品用PEG20000浓缩至1-2mL，上样至预先用重蒸水平衡好的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱上(2×20cm)，用0.1mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱，流速为0.4mL/min，部分收集器分步收集洗脱液，自动记录仪记录洗脱曲线，分别测定各管酶活力，合并酶活性峰各管的酶液，测定合并酶液的蛋白质含量及酶活力，进行SDS-PAGE电泳分析和活性染色分析。经Sephadex G-75凝胶过滤后的脂肪酶比活力是双水相萃取后的酶比活的7.4倍。经过两步法纯化后脂肪酶被提纯约73倍，酶活力回收率为16.3％，参见表11。
表11 低温脂肪酶LIP3的纯化结果表

经过双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤两步法纯化获得的酶液进行SDS-PAGE电泳分析，用考马斯亮蓝R-250染色，呈现单一条带，证明该蛋白已经达到电泳纯。用标准的不同蛋白质分子量对数对Rf值作图，求出该蛋白的分子量约为38kDa。将38kDa蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，电泳后的凝胶放在维多利亚蓝指示剂平板(分别将2.5g琼脂粉、6.25mL三丁酸甘油酯、18.75mL 3g/dL聚乙烯醇、2.5mL 1g/dL维多利亚蓝和225mL磷酸缓冲液加入500mL三角瓶中，加热溶解琼脂粉，趁热用高速组织捣碎机均质，倒平皿，静置冷却，制成含脂肪酶作用底物和指示剂的固体琼脂平板)上，37℃反应16h左右，可观察到透明条带出现。与SDS-PAGE凝胶电泳显示的条带进行比较，它们的位置和数目相同，因此可以确定纯化得到的38kDa蛋白是脂肪酶，将其命名为LIP3。
实施例6温度对低温中性脂肪酶LIP3酶活力的影响1.LIP3最适作用温度的测定及结果除了在pH7.0磷酸缓冲液中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃的温度下反应30min，其它条件都相同，酶活测定方法具体参照实施例3。
测定、比较各温度的酶活，35℃的条件下酶活最高，表明脂肪酶LIP3的最适作用温度为35℃。结果参见附图4A。
2.LIP3热稳定性的测定及结果除了将酶液分别置于20℃、30℃、40℃、50℃和60℃下保温30min后，迅速冷却，再调至35℃，测定剩余酶活外，酶活测定方法具体参照实施例3。以同时置于35℃下测定的酶活力为100％对照，求出剩余酶活。由附图4B可知，在20～40℃的温度范围内酶的稳定性最佳，随着温度升高，酶活力迅速下降。20℃下保温30min后再在35℃测定，剩余酶活为90％，50℃保温30min后测定的剩余酶活仅为55％。可见LIP3对热敏感，在低温下活力较高、较稳定，因而是一种低温脂肪酶。
实施例7pH对低温中性脂肪酶LIP3酶活力的影响配制不同pH值的缓冲液(1)0.1mol/L醋酸缓冲液的配制(pH5.0、pH5.5)溶液A0.2mol/L醋酸(11.55mL冰醋酸溶于1L水)。
溶液B0.2mol/L醋酸钠(16.4g醋酸钠溶于1L水)。
取14.8mL、0.2mol/L醋酸与35.2mL、0.2mol/L醋酸钠溶液混合，最后稀释成100mL，即配制成pH5.0醋酸缓冲液；取4.8mL、0.2mol/L醋酸与45.2mL、0.2mol/L醋酸钠溶液混合，最后稀释成100mL，即配制成pH5.5醋酸缓冲液。
(2)0.1mol/L磷酸缓冲液的配制(pH6.0～8.0)溶液A0.2mol/L NaH2PO4(27.8g溶于1L水)。
溶液B0.2mol/L Na2HPO4(53.65g Na2HPO4·7H2O溶于1L水)。
取87.7mL、0.2mol/L NaH2PO4与12.3mL Na2HPO4混合后，用水稀释至终体积为200mL，即配制成pH6.0磷酸缓冲液；取68.5mL、0.2mol/L NaH2PO4与31.5mL Na2HPO4混合后，用水稀释至终体积为200mL，即配制成pH6.5磷酸缓冲液；取39.0mL、0.2mol/L NaH2PO4与61.0mL Na2HPO4混合后，用水稀释至终体积为200mL，即配制成pH7.0磷酸缓冲液；取16.0mL、0.2mol/L NaH2PO4与84.0mL Na2HPO4混合后，用水稀释至终体积为200mL，即配制成pH7.5磷酸缓冲液；
取5.3mL、0.2mol/L NaH2PO4与94.7mL Na2HPO4混合后，用水稀释至终体积为200mL，即配制成pH8.0磷酸缓冲液。
(3)0.1mol/L Tris-HCl缓冲液的配制(pH8.5、pH9.0)1.pH对LIP3酶活力的影响以上述不同pH值的缓冲液配制底物和稀释酶液，分别在pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的磷酸缓冲液中35℃下反应30min，其它条件都相同，然后测定酶活，酶活测定方法具体参照实施例3。
测定、比较各pH值的酶活大小，在pH7.0酶活最高，结果参见附图5A。由附图5A可知脂肪酶LIP3反应最适pH为7.0。低于6.5酶活力急速下降。
2.pH对LIP3稳定性的影响将酶液用不同pH值缓冲液稀释(pH5.0～9.0)，35℃保温3h后，用pH7.0的磷酸缓冲液适当稀释，测定剩余酶活，酶活测定方法具体参照实施例3。结果表明，脂肪酶LIP3在pH6.5-8.0范围内可保持93％以上的酶活力，参见附图5B。表明LIP3是一种低温中性脂肪酶。
实施例8金属离子和相关化学试剂对LIP3酶活力的影响除了10mmol/L的各种金属离子溶液分别与酶液混合后在35℃下保温30min，其它条件都相同，测定酶活力，以未加金属离子的酶液为100％对照，酶活测定方法具体参照实施例3。
结果表明Fe2+、Cu2+、Mn2+对酶有较强的激活作用；Ca2+对酶有轻微的激活作用；Mg2+和EDTA则对酶有一定的抑制作用，参见附图6。
实施例9保藏条件和保护剂对低温中性脂肪酶LIP3活力的影响1.保藏条件对LIP3活力的影响将酶液在4℃、-20℃和-70℃下分别放置1h，2h，6h，15h，30h和60h后测定酶活力随时间的变化值，酶活测定方法具体参照实施例3。
由附图7A可知，低温中性脂肪酶LIP3在4℃下贮存活力丧失较快，-20℃和-70℃下贮存酶活力均较为稳定，其中-70℃适于短期贮存，-20℃适于长期贮存。
2.保护剂对LIP3稳定性的影响由于酶在使用过程中本身会发生降解，会失去部分活性，所以有必要寻找合适的保护剂，保持酶的稳定性，降低酶失活的速度。在酶液中分别加入单糖、双糖、多糖及多元醇至饱和，在不同温度下放置1d、2d、2.5d、4d、4.5d和6d，测定酶活力随时间的变化值，以未加入保护剂的酶活力为100％，其它条件都相同，酶活测定方法具体参照实施例3。
实验结果表明分别加入麦芽糖、乳糖、葡萄糖、甘油和山梨醇后在25℃贮存4d，仍有70-85％的酶活力；从附图7B可以看出20℃下酶活较高，酶活力变化曲线比较平缓；随着温度的升高，脂肪酶LIP3变得不稳定，温度越高，酶活力下降得越快。
权利要求
1.一种低温中性脂肪酶产生菌白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972。
2.一种低温中性脂肪酶的生产方法，其包括，A，对白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972进行菌种活化培养步骤；B，利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤；C，发酵后的纯化提取步骤。
3.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，在菌种活化培养后该菌产酶的条件为起始pH8.0，培养温度24℃，180rpm振荡培养48h，其培养基由重量百分比的1％可溶性淀粉、1％豆油、2％玉米浆、0.1％(NH4)2SO4、0.5％ K2HPO4、0.1％ MgSO4·7H2O和0.1％ FeSO4·7H2O组成。
4.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，在发酵培养基中，以玉米浆、酵母粉为氮源，其中，优选浓度为2.0％玉米浆。
5.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，在发酵培养步骤中，菌株最适生长温度是20℃，按体积比计，最适装液量为12-20％，优选18％，最佳接种量为10％。最适发酵温度24℃，搅拌速度为180rpm，发酵周期48小时。
6.如权利要求2所述的发酵后的纯化提取步骤，其特征在于，白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972的发酵液经双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤纯化，并用SDS-PAGE测得单一蛋白条带，获得纯化的低温中性脂肪酶。
7.如权利要求6所述的双水相萃取，其特征在于，双水相体系在22℃按重量配制，体系总质量为10g，酶液量为3g，在PEG浓度为15％，硫酸铵浓度为22.5％及pH8.0时获得脂肪酶比活力最大。
8.如权利要求6所述的Sephadex G-75凝胶过滤，其特征在于，双水相萃取后的酶样品用PEG20000浓缩至1-2mL，上样至预先用重蒸水平衡好的2.0×20cm的Sephadex G-75凝胶层析柱上，用0.1mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱，流速为0.4mL/min。
9.一种低温中性脂肪酶，其利用权利要求1所述的白地霉(Geotrichumcandidum)CGMCC.No.1972，由权利要求2所述的生产方法制备而成。
10.如权利要求9所述的低温中性脂肪酶，其特征在于，最适反应温度是20～35℃，在20～40℃酶的稳定性最佳，随着温度升高，酶活力迅速下降；在0℃可保持66％的相对酶活，20℃保温30min仍可保持90％的酶活力，而50℃保温30min，仅有55％的酶活力；该酶的最适pH是7.0，在pH6.5-8.0范围内温育3h能保持原来酶活的93％以上，pH低于6.5酶活力迅速下降；Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+对酶有激活作用，Mg2+和EDTA对酶有抑制作用。
全文摘要
本发明公开了一种白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972及其表达产物低温中性脂肪酶，本发明还同时提供了采用双水相萃取和Sephadex G－75凝胶过滤的方法对白地霉发酵液进行了分离纯化技术。本发明通过提供的菌种是具有良好商业应用前景的低温中性脂肪酶产生菌，产酶温度稳定，原料来源广泛，生产成本低廉。其表达产物是一种新型低温中性脂肪酶，最适作用温度为35℃，最适pH为7.0，可广泛应用于食品、化工、医学制品等领域。
文档编号C12N9/18GK101058797SQ20071010048
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月13日 优先权日2007年4月13日
发明者付建红, 姚斌, 石玉瑚, 孟昆, 欧阳平凯, 袁铁铮, 古丽尼莎 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所